专利名称：：一种同时测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法
技术领域：
：本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法。
背景技术：
：临床器官移植后需进行抗排异治疗，目前广泛采用新型的抗代谢类免疫抑制剂霉酚酸酯(MycophenolateMofetil，MMF，RS61443;商品名Cellcept,骁悉)进行抗排异治疗。该药物是霉酚酸(MycophenolicAcid，MPA)的2-乙基酯前体药物，可显著提高MPA的体内生物利用度。MMF口服后，在体内迅速被水解脱酯转化为活性代谢产物MPA,后者继而与葡萄糖醛酸结合，转化为没有活性的代谢产物葡糖苷酸化物(Mycophenolicacidglucuronide,MPAG)，其主要代谢途径如图1所示。MPAG在体内的浓度大大高于MPA，且能通过肠肝循环再次水解为MPA，重新进入体内发挥作用，因此MPAG能够影响MPA的体内药动学。现有技术研究表明，MMF在部分病人中的生物利用度低于80%，甚至低于50%，不完全的生物转化同样可能影响MPA的药动学。所以，通过同时测定血浆中三种物质的浓度，并据此调整给药剂量，对保证用药的安全和疗效有重要意义。与本发明相关的现有技术有专利:ZL200410066519.6，但其中公开的技术方案所能测定的药物范围仍嫌不足。迄今为止，尚未见国内、外有关同时测定人血浆中MMF、MPA和MPAG的浓度的报道。
发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可同时测定人血浆中霉酚酸酯(MycophenolateMofetil，MMF,RS61443;商品名Cellcept,骁悉)，霉酚酸(MycophenolicAcid，MPA)和代谢产物葡糖苷酸化物(Mycophenolicacidglucuronide,MPAG)浓度的方法。本方法具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，无需昂贵的设备和试剂，更适合临床常规监测和药动学研究。本方法的技术方案是待测样品预处理后，先用紫外检测器检测MPAG，然后利用MMF和MPA在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后在线衍生化(碱化)，用荧光检测器检测。该法可使MMF和MPA的检出灵敏度大大提高。本方法包括以下步骤1)样品预处理取待测样品，加入甲醇、乙腈或两者混合液，进行蛋白沉淀；离心后取上清液进样；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八垸基或辛烷基键合相硅胶，高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱；分别采用紫外和荧光检测器分别检测MPAGMMF和MPA的峰面积，用标准曲线方程换算成三者的浓度；其中色谱条件是，HPLC系统日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括双泵，紫外检测器和荧光检测器，)；色谱柱ZORBAXRX-C8(250mmx4.6mm，5pm);流动相采用等度洗脱，甲醇一0.1o/。TFA(60:40-50:50，V/V);流速1.0-1.2ml/min;柱温40-45°C;荧光激发波长342-344nm，发射波长425-427nm。3)样品柱后衍生化采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，使分离后的样品有荧光信号。本方法用于同时定量测定人血浆中MMF、MPA和MPAG的浓度首先定量分取血浆样品，加入定量的蛋白沉淀剂，混匀、离心，取上清液进样，经紫外检测器检测MPAQ再用NaOH或KOH溶液进行衍生化后，用荧光检测器检测MMF和MPA。上述测定方法中，加入的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或二者混合物。上述测定方法中，分别用紫外检测器和荧光检测器测定MPAGMMF和MPA的峰面积，用标准曲线方程换算成MPAGMMF和MPA的浓度。上述方法中，采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛垸基键合相硅胶为填料的液相色谱柱。高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱。本发明方法快速准确、操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测和药动学研究。具有如下优点在本方法测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定；血桨MMF、MPA和MPAG测定的线性范围分别为0.041.00pg/ml，0.140.0ng/ml和10150pg/ml;测定偏差均在士15%以内，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于12%。图1是霉酚酸酯的主要代谢途径图，其中，MMF:霉酚酸酯；MPA:霉酚酸；MPAG:葡糖醛酸化霉酚酸。图2是色谱系统装置示意图。图3是典型色谱图，其中，志愿者空白血浆色谱图(a)荧光(b)紫外；志愿者服用MMF750mgbid、强的松和环孢素A的血浆色谱图(c)荧光(d)紫外；1:MMF;2:内标；3:MPA;4:MPAG。图4是典型色谱图，其中，未服用MMF的肾移植患者空白血浆色谱图(a)荧光(b)紫外；实际肾移植患者服用MMF750mgbid、强的松和环孢素A的血浆色谱图(C)荧光(d)紫外；1:MMF;2:内标；3:MPA;4:MPAG。具体实施例方式实施例1:志愿者血浆MMF,MPA和MPAG测定色谱条件HPLC系统日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括LC-10AD泵，LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器，RF-10AXL荧光检测器，SIL-10A自动进样器，CBM-10A系统通讯器，柱温箱，Class-LC10Version1.63色谱工作站)；色谱柱Kromasil-C18(150mmx4.6mm，5拜)；流动相采用等度洗脱，甲醇——0.1%TFA(45:55,V/V);流速1.2ml/min;柱温40。C;荧光激发波长342nm，发射波长425nm。血浆样品预处理精密吸取100^血浆置1.5ml离心管中，加入含内标普罗帕酮150pg/ml的乙腈溶液200nl，涡旋振荡30s，离心10min(20,627xg,4°C)，取上清液20jil进样，内标法以峰面积定量。专属性取8名志愿者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药对乙酰氨基酚、阿昔洛韦、阿替洛尔、硫唑嘌呤、卡维地洛、环丙沙星、氯硝西泮、氯氮平、环孢素A、地西泮、二甲双胍、多沙唑嗪、泛昔洛韦、非诺贝特、呋塞米、更昔洛韦、格列吡嗪、氢氯噻嗪、布洛芬、吲哚美辛、厄贝沙坦、氯沙坦、甲氧氯普胺、美托洛尔、氧氟沙星、非那西丁、泼尼松、利巴韦林、西罗莫司、他克莫司、替米沙坦、伐昔洛韦、缬更昔洛韦和缬沙坦等对测定也没有干扰。MMF、MPA、MPAG和内标的典型色谱保留时间分别为6.5、15.7、4.9禾tU0.8min，整个色谱分析过程时间为17.5min。线性试验取空白血浆，加入适量的MMF,MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MMF(0.040,0.125,0.250，0.500，0.750，1.000ng/ml),MPA(O.l，0.5,5.0，10.0,20.0,40.00ng/ml)和MPAG(IO，20,50,75,100,150jxg/ml)的血浆标准品，按"血浆样品预处理"方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比C4)和待测组分浓度(C)作加权(1/C2)线性回归，三者的标准曲线回归方程分别为MMF00.2355^+0.0124，r=0.9996;MPAC-0.20044+0.2034,r=0.9991;MPAGC=505.8589J+1.6839，r=0.9996。准确度和精密度取空白血浆，加入适量的MMF，MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MMF(0.04,0.10，0.40，0.80ng/ml),MPA(O.IO,0.25，15.00，30.00ng/ml)和MPAG(IO，25，60,120pg/ml)的血浆质控品，按"血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD),其中(C实测-C理论)/C理论x100%为偏差。表1显示了血样中MMF,MPA和MPAG的日内、日间精密度和准确度。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于11%，偏差小于15%。表l理论浓度(fig/ml)批内(n=6)批间(n=6)实测值(fig/ml)RSD(%)偏差(%)实测值(fig/ral)RSD(%)偏差(%)MMF0.040.046土0.0049.3714.630.040±0.00410.110.290.100.11±0.016.555.480.10±0.016.00-2.020.400.41±0.024.992.930.39±0.038.45-1.860.800.85±0.089.566.630.80±0.045.16-0.49MPA0.100.107±0.0033.257.120.107±0.0033.666.990.250.25±0.026.970.310.25±0.013.65-0.6715.0015.86±0.865.425.7515.14±0.765.020.9330.0030.62±2.648.632.0630.89±1.464.722.95MPAG1010.69±0.656.066.8710.46±0.43.934.572525.42±U04.741.6724.96±0.491.98-0.176062.78±0.340.544.6361.65±1.201.942.76120120.79±1.661.380.66123.72±5.574.503.10实施例2:肾移植患者血浆MMF，MPA和MPAG测定色谱条件HPLC系统日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括LC-10AD泵，LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器，RF-10AXL荧光检测器，SIL-10A自动进样器，CBM-10A系统通讯器，柱温箱，Class-LC10Version1.63色谱工作站)；色谱柱ZORBAXRX-C8(250mmx4.6mm,5nm);流动相采用等度洗脱，甲醇——0.1%TFA(52:48，V/V);流速1.2ml/min;柱温45。C;荧光激发波长344nm，发射波长427nm;。血浆样品预处理精密吸取100^血浆置1.5ml离心管中，加入含内标普罗帕酮15(Hig/ml的甲醇溶液200pl，涡旋振荡30s，离心10min(20,627xg，4°C)，取上清液20pl进样，内标法以峰面积定量。专属性取8名未服用MMF的肾移植患者的空白血浆，按照实施例1中方法进行专属性评价，未发现内源性物质和常用药物对上述测定组分有干扰。MMF、MPA、MPAG和内标的典型色谱保留时间分别为6.6、15.6、4.9和10.7min，整个色谱分析过程时间为17.5min。线性试验取空白血浆，加入适量的MMF,MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MMF(0.040，0.125,0.250，0.500，0.750，1.000^g/ml)，MPA(O.l，0.5，5.0,10.0，20.0,40.00ng/ml)和MPAG(10,20,50，75，100,150pg/ml)的血浆标准品，按"血浆样品预处理"方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比C4)和待测组分浓度(C)作加权(1/C2)线性回归，三者的标准曲线回归方程分别为MMFC=0.2563^-0.0018，r=0.9997;MPAC=0.2181J+0.0050，r=0.9993;MPAGC=513.7937^+2.4051，r=0.9996。准确度和精密度取空白血浆，加入适量的MMF，MPA和MPAG标准储备液，配制成分别含MMF(0.04,0.10,0.40，0.80ng/ml)，MPA(O.IO，0.25，15.00，30.00pg/ml)和MPAG(IO,25,60,120pg/ml)的血浆质控品，按"血浆样品预处理"方法操作,考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD),其中(C实测-C理论)/C理论x100%为偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种同时测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是待测样品预处理后，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器检测，包括以下步骤1)样品预处理取待测样品，加入甲醇、乙腈或两者混合液，进行蛋白沉淀；离心后取上清液进样；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛烷基键合相硅胶，高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱；分别采用紫外和荧光检测器分别检测代谢产物葡糖苷酸化物，霉酚酸酯和霉酚酸的峰面积，用标准曲线方程换算成三者的浓度；3)样品柱后衍生化采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，使分离后的样品有荧光信号。2、根据权利要求l所述的同时测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是所述的步骤l)的待测样品为人血浆。3、根据权利要求l所述的同时测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是所述的步骤2)，其中色谱条件是，HPLC系统LC-10A高效液相仪；色谱柱ZORBAXRX-C8250mmx4.6mm，5流动相采用等度洗脱，甲醇一0.1%TFA,两者体积比为60:40-50:50;流速1.0-1.2ml/min;柱温40-45'C;荧光激发波长342-344nm,发射波长425-427nm。4、根据权利要求3所述的方法，其特征是所述的色谱条件中，HPLC系统包括双泵，紫外检测器和荧光检测器。全文摘要本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人血浆中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法。本发明方法对待测样品经预处理后，利用霉酚酸酯和霉酚酸在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器检测。该法可使检测霉酚酸酯和霉酚酸的灵敏度大为提高。本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，分析周期短，成本低，无需昂贵的设备和试剂，适合于临床常规监测和药动学研究。文档编号G01N33/48GK101419224SQ200810202400公开日2009年4月29日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者施孝金,李中东,正焦,道毅俊,钟明康申请人:复旦大学附属华山医院