专利名称：一种荧光标记的16重x-str基因座复合扩增系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种染色体分型的检测系统及其应用， 特别涉及一种X染色体STR基因位点分型的荧光检测系统及其应用。
背景技术：
短串联重复序列(short tandem repeats,简称STR)是由2-7个碱基对作为核心 单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列；STR由于核心重复单位数目的变化形成了 STR 基因位点的遗传多态性。人类基因组中，平均每6-10kb就存在有一个STR基因位点，为法 医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。STR等位基因的分型在研究与实际应用中具有以下显著的特点良好的重复性， 分型结果稳定可靠，操作简单快速；片段长度一般在100-400bp，容易通过PCR扩增、电泳分 型，适用于各种检材及高度降解检材的检测；三核苷酸、四核苷酸重复的STR位点PCR扩增 结果稳定，产生的附加带、影子带少，容易分型；是绘制人类遗传图、疾病基因连锁分析、遗 传病诊断、个体识别等分析工作的主要工具。X染色体STR位点广泛存在于真核细胞基因组中，高度稳定且具有较高的遗传多 态性，但与常染色体和Y染色体STR相比，迄今发现和应用的X染色体STR位点数量非常少， 群体分布、突变率、连锁平衡、基因结构等方面的信息尚不够丰富，在法医学、医学等领域的 应用受限，远不及其它DNA遗传标记广泛。但X染色体STR对于亲子鉴定、个体识别、性别 鉴定、X连锁遗传致病基因定位、易感基因的检出，多基因遗传病致病基因的定位、发病的分 子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面有独特的优势。故X染色体的有关研究有重要 的意义。X染色体遗传标记的研究在国内还处于初期，目前国际上商业化检测试剂盒仅有 德国Biotype Argus X-12，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问题
1、采用该类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；
2、这些X-STR基因座都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的， 其中有些基因座，在中国群体中的基因频率分布较差，个体识别能力较低；
3、国外商业化试剂盒价格昂贵。这些缺点限制了 X染色体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。申请号为200810017404. 6，公开号为CN101225387的中国专利公开了一种覆盖 X染色体全长的11个STR基因座并公开了 STR基因座结合等位基因标准物进行染色体分 型的方法。但是该发明公开的STR分型为银染检测，虽然对实验设备的成本要求不高，但 是在实验中人工操作较多，工作量大，实验结果易受人员操作熟练程度的影响。申请号为 200810219413. 3，公开号为CN101413030A的中国专利公开了一种涵盖10个X-STR基因座 的荧光复合扩增系统，但该系统的10个X-STR基因座位于同一连锁群内，在亲权鉴定等实 践中需要计算单倍型频率，整体的鉴别效能降低。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在中国人群中可以快速、准确 针对常染色体STR、Y-STR难以排除或认定亲权关系的特殊检案(如同父同母姐妹认亲、同 父异母姐妹认亲、祖母与孙女鉴定等)进行鉴定的荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统。本发明的另一个目的在于提供上述复合扩增系统用于X连锁遗传致病基因定位、 亲子鉴定、同父同母姐妹认亲、同父异母姐妹认亲、祖母与孙女鉴定等领域。本发明建立了一种荧光标记的X-STR复合扩增系统，该系统可分析16个X-STR基 因座，这 16 个 X-STR 基因座为GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、 DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810 和 DXS7132。本发明具体包括如下内容 一、等位基因分型标准物的制备。分别以包含16 个 X 染色体 STR 基因座 GATA165B12、DXSlOl、GATA172D05、HPRTB, DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、 DXS7133、DXS6810和DXS7132的不同等位基因的质粒为模板，以5'端标记有荧光分子的 引物对为引物，PCR扩增上述X染色体STR基因位点全部的等位基因，并确定PCR扩增出的 等位基因的片段大小，将全部的等位基因的片段按照等摩尔比混合得到等位基因分型标准 物。二、多重PCR引物的荧光标记。由于需要对16个X染色体STR基因座进行复合扩增，并对等位基因片段长度差异 和扩增子长度的限制，多重PCR体系构建时要进行多重荧光标记，本发明采用5色荧光标 记，在选择荧光标记时考虑以下要素
①每种荧光素的激发光光谱间隔应尽可能均勻，且其间隔最好是不少于20nm，以达到 最佳的分离效果；
②一种荧光素的激发光光谱与另一种荧光素的吸收光光谱尽可能不重叠，以减少相 互间的干扰；
③荧光素可通过商业途径获得，不受专利保护；
④由于未来的应用主要依据美国AB公司的遗传分析仪，要求所选择的荧光素在美国 AB公司的遗传分析仪上适用。本发明的16个X-STR基因座分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX四种不同颜色的 荧光素标记(第五种荧光用于内标的标记如LIZ、SIZ等)。具体为FAM标记GATA165B12、 DXS101、GATA172D05、HPRTB 和 DXS981 共 5 个基因座；HEX 标记 DXS8378、DXS6795、GATA31E08 和 DXS6809 共 4 个基因座，TAMRA 标记 DXS6803、DXS9902、DXS6807 和 DXS7423 共 4 个基因 座，ROX标记DXS7133、DXS6810和DXS7132共三个基因座。本发明人的研究表明，可以在一个PCR单管中实现复合扩增，扩增效率高，无相互 干扰。三、本发明体系中16个X-STR基因座的复合扩增与检测。本发明的复合扩增系统是采用复合PCR技术在同一 PCR反应管中同时扩增上述16 个X-STR基因座，从而可同时分析X染色体的STR基因座。
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复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中 的引物正链的5 ‘端用相应的荧光素标记即用FAM、HEX、TAMRA和ROX标记，全部16个X-STR 基因座的引物按照比例混合在一起(一个试管中)。(I)PCR反应体系
反应体系总体积为12-25 μ L，包括PCR反应缓冲液(Buffer) 1-2. 5 μ L,引物混合物 (Primer pair Mix) 1-3 μ L，DNA聚合酶1-2. 5 U，模板DNA 1-3 μ L，超纯水补足至总体积。(2) PCR扩增参数
在9700或其他型号的PCR仪上进行扩增，多重PCR扩增参数为95°C 15min ；94°C 30sec、57°C 90sec、72°C 90sec，共进行 30 个循环；60°C延伸 60min。四、结果分析。①样品制备
权利要求
一种荧光标记的16重X STR基因座复合扩增系统，其特征在于该复合扩增系统的16个基因座如下GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810、DXS7132。
2.根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于所述16个 基因座在一个复合扩增体系中同时进行PCR扩增。
3.根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于所述16个 基因座引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光素标记。
4.根据权利要求3所述荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于四种 荧光素标记16个基因座引物，具体如下FAM标记GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB 和 DXS981 共 5 个基因座；HEX 标记 DXS8378、DXS6795、GATA31E08 和 DXS6809 共 4 个基因 座，TAMRA 标记 DXS6803、DXS9902、DXS6807 和 DXS7423 共 4 个基因座，ROX 标记 DXS7133、 DXS6810和DXS7132共三个基因座。
5.根据权利要求1、2、3或4所述荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，其特征 在于16个X-STR基因座及其引物序列和荧光素标记，具体对应如下
6. 一种基于权利要求1一4之一所述的荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统 的试剂盒，其特征在于包括PCR反应体系，反应体系总体积为12-25μ L，包括PCR反应缓冲 液1-2. 5 μ L，引物混合物1-3 μ L，DNA聚合酶1-2. 5 U，模板DNA 1-3 μ L，其余为超纯水； 所述的引物混合物包括16个X-STR基因座及其引物序列和荧光素标记，具体对应如下
7.权利要求1至4之一所述的荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，在特殊的 亲权关系鉴定或个体识别、性别鉴定及X连锁遗传病的基因定位中应用。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，具体为一种荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统及其应用。该系统复合扩增分析16个X-STR基因座GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810、DXS7132，这16个基因座相对独立、互不连锁，相应引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光标记。基于该复合扩增系统，本发明可制成适合中国人群的X-STR基因座复合扩增试剂盒，用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定。
文档编号G01N21/64GK101956004SQ20101025291
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者张素华, 李成涛, 李莉, 赵书民 申请人:司法部司法鉴定科学技术研究所