专利名称：一种半定量检测孕酮胶体金试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于奶牛妊娠诊断技术领域，特别是涉及一种半定量检测孕酮胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术：
母畜体内的孕酮(P4)主要在卵巢合成，是反映卵巢活动的精确指示剂，具有控制母畜生殖活动的功能。检测体液中的孕酮水平和含量变化，不仅可以了解母畜的生殖生理规律，而且可以监测生殖系统疾病，是研究母畜生殖生理及其疾病的重要手段，是预防和治疗母畜繁殖障碍性疾病的一种有效方法。血液或奶中的P4含量的测定，还可用于早期妊娠诊断、不孕症诊断和发情鉴定；也可用于卵巢机能、繁殖障碍和产科疾病的研究；还可用来检查人工授精效果，激素试验，为遗传分析提供有效的生理指标等。早期妊娠诊断对于改善乳牛繁殖情况、减少空怀时间、缩短胎间距、提高乳牛饲养的经济效益具有重要意义。目前，用放射免疫分析法(RIA)测定孕酮具有灵敏度和精确度高、重复性好等特点，但因其对设备要求高，检测费时，产生的废液难以处理，有放射性危害而限制了它的应用。近年来国外在用ELISA测定孕酮进行妊娠诊断取得了较大的进展，一些成套的试剂盒已经面市，使得在牧场实地测定孕酮，进行早期妊娠诊断成为现实。然而，在生产实践应用中发现ELISA敏感度较低，背景较深，结果判定比较困难，测定结果不够稳定等问题。目前， 我国许多乳牛场仍是通过直肠检查进行妊娠诊断，该方法诊断怀孕的最早时间和最佳时间没有确切的标准，其效果很大程度上取决于检查者的临床经验、家畜种类、母体和胎儿的发育状况等。一般须在人工授精2个月后进行，因而难以及时发现未孕母牛，不能对乳牛进行及时处理，增加了母牛的空怀时间。国外生产的ELISA试剂盒价格昂贵，国内乳牛场很难广泛使用。鉴于上述原因，研究新的早期、敏感、特异、简便、准确和容易操作的孕酮检测技术就显得十分必要，也是当前亟待解决的问题，这对于促进我国畜牧业的发展具有极为重要的意义。

发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种半定量检测孕酮胶体金试纸条及其制备方法。免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而成为可定性或半定量的快速免疫检测方法。本发明的目的之一是提供一种具有操作简单，方便实用，对于改善乳牛繁殖情况、 减少空怀时间、缩短胎间距、控制产科疾病、检查人工授精效果，提高乳牛饲养的经济效益具有重要意义等特点的半定量检测孕酮胶体金试纸条。本发明半定量检测孕酮胶体金试纸条为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是
一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特点是试纸条包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜样品垫、吸水垫、PVC底板；玻璃纤维膜样品垫、含有金标孕酮抗体复合物的金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜的另一侧粘贴有吸水垫；硝酸纤维素膜上有乳牛孕酮人工抗原检测线和羊抗鼠二抗对照线， 乳牛孕酮人工抗原检测线靠近含有孕酮抗体的金标垫一侧。本发明半定量检测孕酮胶体金试纸条还可以采用如下技术方案
所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特点是对照线距吸水垫近端0. 3-0. 6cm，检测线与吸水垫近端相距0. 8-1. 3cm。所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特点是对照线羊抗鼠二抗的喷涂浓度为0. 2-ang/L，检测线的乳牛孕酮人工抗原的喷涂浓度为0. 05-0. lmg/ml。所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特点是试纸条大小为 6-8cmX0. 3-0. 6cm,吸水垫长 1. 8-2. 2cm、样品垫长 1. 8-2. 2cm、金标垫长 0. 6-1. 0cm、硝酸纤维素膜长2-3cm ；硝酸纤维素膜贴在底板上，与底板吸水端边缘相距1. 3-1. 8cm ；吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，样品垫、金标垫与硝酸纤维素由上而下依次交叠，金标垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，金标垫与硝酸纤维素膜的交叠长度为0. 8-1. 3mm。本发明的目的之二是提供一种具有工艺简单，操作方便，经济实用，更容易在基层推广等特点的半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法。本发明半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法所采取的技术方案是 一种半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特点是制备步骤如下
第一步，制备胶体金加热氯金酸水溶液至沸腾，加入柠檬酸三钠水溶液，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小15nm-20nm ；
第二步，制备纯化多克隆抗体采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11 α -半琥珀酸酯分别与牛血清白蛋白、卵清白蛋白载体偶联，制备乳牛孕酮人工抗原；再用制备的人工免疫抗原与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠制备免疫血清；采用辛酸一硫酸铵法方法获得纯化孕酮多抗；
第三步，制备金标抗体将抗体溶液去盐，胶体金PH值在9-9. 5之间时与抗体吸附，采用离心法纯化；
第四步，胶体金试纸条的制备用重量含量0. 3-0. 6%吐温的PB溶液浸泡金标垫 20-40min,烘干，将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维膜上，干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将乳牛孕酮人工抗原和羊抗鼠二抗喷成2条线，分别为检测线和对照线，再真空干燥；将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一侧，组装制成半定量检测孕酮胶体金试纸条。本发明半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法还可以采取如下技术方案
所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特点是制备胶体金时，用微波炉加热0. 005-0. 02%氯金酸水溶液至沸腾，一次性加入l_5mL 0. 5-2%的柠檬酸三钠水溶液。所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特点是采用辛酸一硫酸铵法方法获得纯化孕酮多抗，并将多抗中的无效抗体去除；最后测得抗体浓度为Hmg/mL。本发明检测早期怀孕母牛的胶体金试纸条的制备方法，其具体的制备过程包括以下步骤
第一步，制备胶体金用微波炉加热0. 01%氯金酸水溶液至沸腾，一次性加入2. 5mL1%的柠檬酸三钠水溶液，加热至透明红色为止。胶体金颗粒大小均15nm-20nm，平均粒径 (n=20)为 18. 9nm士0. 5nm ；
第二步，制备纯化抗体采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-Ila-半琥珀酸酯 (P4-Il α -HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVAAlG)肪、快速、不污染环境0) 载体偶联，制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA *P4-0VA。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA (50ug IOOug/只)与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/ c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原，间接ELISA法测定免疫血清中孕酮抗体的效价抗体效价1 12800 25600;采用辛酸一硫酸铵法方法获得纯化抗体，用紫外分光光度法测定抗体浓度为 6. 37mg/mL ；进一步提纯孕酮抗体，测得抗体浓度为1. 57mg/mL ；
第三步，制备金标抗体将待标记的抗体溶液去盐，最终确定稳定1 mL胶体金最适抗体量为36. 72ug。胶体金pH值在9-9. 5之间时与多抗的吸附较好；采用低温超速离心法纯化；
第四步，胶体金试纸条的制备将玻璃纤维膜裁成8mm宽的细条，用含有0. 5%吐温的 PB溶液浸泡金标垫30min，37°C烘干，最后将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维膜上，4°C 条件下干燥。在硝酸纤维膜上用点膜机将竞争原P4-OVA和羊抗鼠IgG喷成2条线，分别为检测线(T线)和对照线(C线)，再真空干燥，将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一端，组装后用斩切机将其切成4mm宽的试纸条，备用；
第五步，检测与判读将加样端插入待测液(湿润后取出)或将待测样品滴加到样品垫上，水平放置约3-5min，观察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅对照线呈一条紫红色带检测结果则为阳性；如出现2条紫红色带则为阴性；如对照线不显色，则将试纸条视为无效。本发明具有的优点和积极效果是
半定量检测孕酮胶体金试纸条及其制备方法由于采用了本发明全新的技术方案，与现有技术相比，
本发明所述检测孕酮胶体金试纸条为完整的检测血清中孕酮水平的产品，操作简单， 方便实用，对于改善乳牛繁殖情况、减少空怀时间、缩短胎间距、控制产科疾病、检查人工授精效果，提高乳牛饲养的经济效益具有重要意义。本发明使奶牛的早期诊断成为可能，而且方法简单可靠，更容易在基层推广。胶体金试纸条用于肉眼水平的免疫检测中，具有以下优点①样品不需要特殊处理，试剂和样本用量极小；②敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测； ③时间大大缩短，提高了检测速度，数分钟便可获得结果；④操作简单，不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场和基层应用；⑤实验结果可以长期保存。这使其在检验检疫上有很大的应用潜力。可以通过制备单克隆或多克隆抗体，将不同传染病和激素的抗体做成试纸条，直接检测血液、拭子、粪便、组织悬液中的病原体和激素。将传染病病原和激素的抗体制备成试纸条，技术上是成熟的，方法上是可行的，胶体金试纸条广泛用于检验检疫是必然的发展趋势。


图1是半定量检测孕酮胶体金试纸条结构示意图；图2是图1侧视结构示意图3是半定量检测孕酮胶体金试纸条阳性结果显示图； 图4是半定量检测孕酮胶体金试纸条阴性结果显示图。图中，1-样品垫、2-金标垫、3-检测线、4-对照线、5-底板、6_吸水垫、7_硝酸纤维素膜。
具体实施例方式为能进一步了解本发明的技术内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下
参阅附图1至图4。实施例1
一种能检测早期怀孕奶牛的胶体金试纸条，其由含有孕酮抗体的玻璃纤维素膜金标垫 2、硝酸纤维素膜7、玻璃纤维膜样品垫1、吸水垫6、PVC底板5等研制而成，试纸条检测原理采用竞争法。试纸条大小为6cmX0. 4cm,吸水垫长2cm、样品垫长2cm、金标垫长0. 8cm、硝酸纤维素膜2. 5cm。将硝酸纤维素膜贴在底板上，与底板吸水端边缘相距1. 5cm ；然后依次将吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，再依次将样品垫、金标垫与硝酸纤维素由上而下依次交叠，金标垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，金标垫与硝酸纤维素膜的交叠长度为1mm。本试纸条中各材料的材质如下底板为国产的PVC材料，外观呈白色；吸水垫采用国产的吸水纸材料，型号为H-8 ；硝酸纤维素膜为进口的材料，型号为Whantman Prima ；金标垫为进口的玻璃纤维素膜，型号为Alstrom 8964 ；样品垫为国产的玻璃纤维素膜，型号为GF-08 ；对照线4 (C线)和检测线3 (T线)的相对位置C线距吸水垫近端0. 5cm、T线与吸水垫近端相距lcm。金标垫处理将型号为Alstrom 8964的玻璃纤维素膜浸入金标垫处理液(含 5% 蔗糖、0. 5% 吐温、0. l%NaN3,pH=7. 2 0. 01mol/L 的 PBS 溶液)中浸泡 30min，37°C 干燥。将金标抗体提纯后，用金标抗体稀释液(含1%BSA、3%海藻糖的pH = 7. 0 0. Olmol/ L的PB溶液)稀释至原始体积的2/5，金标垫浸泡于其中，然后进行低温干燥。C线羊抗鼠二抗喷涂浓度大于O . ang/mL，本发明中的C线喷涂浓度为2mg/mL ；T线的P4-OVA最佳喷涂浓度为0. 07ang/mL。实施例2
一种能检测早期怀孕母牛的胶体金试纸条的制备方法，其制备步骤如下 第一步，采用柠檬酸钠还原法制备胶体金首先用微波炉将IOOmL 0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，然后一次性加入2. 5mL的1%柠檬酸钠溶液，迅速混勻，至溶液变为酒红色后继续煮沸3 5min。本发明中制备的胶体金颗粒直径应在15nm-20nm左右。第二步，制备纯化多克隆抗体采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11 α -半琥珀酸脂(P4-Ila-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)载体偶联，制备孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,分别作为免疫原和检测原(竞争原)。所制备的P4-BSA和 P4-OVA的浓度分别为11. lmg/mL和4. 67mg/mL。用合成的人工抗原P4-BSA,腹腔注射主动免疫小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，以后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，免疫间隔为1个月，制备免疫血清。用间接ELISA法测得的孕酮抗体效价高达1:25600。用辛酸-硫酸铵法纯化血清中抗体，SDS-PAGE检测抗体纯度，纯度应达到95%以上。第三步，金标孕酮抗体复合物的制备
将胶体金的PH调至9.0，将孕酮抗体浓度调至lmg/mL，取不同量(0. 5uL、0. 7uL、 1uL,2uL,3uL,4uL,5uL)的抗体溶液分别与IOOuL的胶体金溶液混合均勻，加入10 μ L的 10%NaCl,加入抗体量不足的胶体金将会变蓝，而所加抗体量超过时，胶体金颜色将会保持不变，以此来确定ImL胶体金所需的抗体量，此外在此基础上再加20%的抗体量；
取所需量抗体在磁力搅拌下与胶体金溶液混合，以PEG-20000作为稳定剂，制备金标抗体；
将金标抗体溶液先以1500rpm离心15min以去除凝集的金颗粒；再IOOOOrpm进行高速离心30min，吸弃上清，暗红色的沉淀即为结合良好的胶体金-抗体复合物，制成混悬液； 采用金标抗体与抗原在NC膜上直接反应的方法鉴定金标抗体的结合状况； 第四步，胶体金试纸膜的制备
用点膜机在NC膜上划线，包被原P4-OVA用于检测线的显示，羊抗鼠二抗用于对照线的显示；检测线P4-OVA的最佳包被浓度为0. 07ang/mL，对照线二抗的浓度为ang/mL。金标抗体喷涂于已处理好的玻璃纤维膜上，4 °C条件下干燥；
测试条的组装将NC膜、金标垫、吸水纸及样品垫固定于PVC底板上，然后用试纸条斩切机进行切割，试纸条大小为4mmX6cm ；
本发明试纸条的使用方法在奶牛配种后22天左右采血并分离血清，将血清滴加在试纸条的样品垫上，放平试纸条，经过5min左右就会显示出结果。第五步，结果判断本发明的孕酮试纸条的原理为竞争法。当血清中的孕酮浓度高于极限值时，血清中的孕酮会将金标垫上的金标孕酮抗体全部结合，形成的金标抗体一孕酮复合物不会被检测线截留，当该复合物层析到对照线时，会被二抗截留从而显色。因此阳性结果为检测线(T线)不显色，而对照线(C线)显色；而当血清中的孕酮浓度低于极限值时，血清中的孕酮不能将金标垫上的金标孕酮抗体全部结合，一部分金标抗体复合物会被检测线截留从而在检测线显色。因此，阴性结果为检测线(T线)和对照线(C线)均显色。 当对照线不显色时，说明试纸条已失效。
权利要求
1.一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是试纸条包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜样品垫、吸水垫、PVC底板；玻璃纤维膜样品垫、含有金标孕酮抗体的金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜的另一侧粘贴有吸水垫；硝酸纤维素膜上有乳牛孕酮人工抗原检测线和羊抗鼠二抗对照线，乳牛孕酮人工抗原检测线靠近含有金标孕酮抗体的金标垫一侧。
2.按照权利要求1所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是对照线距吸水垫近端0. 3-0. 6cm，检测线与吸水垫近端相距0. 8-1. 3cm。
3.按照权利要求1或2所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是对照线羊抗鼠二抗的喷涂浓度为0. 2-aiig/mL，检测线的乳牛孕酮人工抗原的喷涂浓度为0. 05-0. Img/ ml ο
4.按照权利要求1或2所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是试纸条大小为 6-8cmX0. 3-0. 6cm，吸水垫长 1. 8-2. 2cm、样品垫长 1. 8-2. 2cm、金标垫长 0. 6-1. 0cm、硝酸纤维素膜长2-3cm ；硝酸纤维素膜贴在底板上，与底板吸水端边缘相距1. 3-1. 8cm ；吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，样品垫、金标垫与硝酸纤维素由上而下依次交叠， 金标垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，金标垫与硝酸纤维素膜的交叠长度为0. 8-1. 3mm。
5.一种半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特征是，制备步骤如下第一步，制备胶体金加热氯金酸水溶液至沸腾，加入柠檬酸三钠水溶液，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小15nm-20nm ；第二步，制备纯化多克隆抗体采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-Ila-半琥珀酸酯分别与牛血清白蛋白、卵清白蛋白载体偶联，制备乳牛孕酮人工抗原；再用制备的人工免疫抗原与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠制备免疫血清；采用辛酸一硫酸铵法方法获得纯化孕酮多抗、并进一步提纯孕酮抗体；第三步，制备金标抗体将抗体溶液去盐，胶体金PH值在9-9. 5之间时与抗体吸附，采用离心法纯化；第四步，胶体金试纸条的制备用重量含量0. 3-0. 6%吐温的PB溶液浸泡金标垫 20-40min,烘干，将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维膜上，干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将乳牛孕酮人工抗原和羊抗鼠二抗喷成2条线，分别为检测线和对照线，再真空干燥；将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一侧，组装制成半定量检测孕酮胶体金试纸条。
6.按照权利要求5所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特征是制备胶体金时，用微波炉加热0. 005-0. 02%氯金酸水溶液至沸腾，一次性加入l_5mL 0. 5-2%的柠檬酸三钠水溶液。
7.按照权利要求5所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条的制备方法，其特征是采用辛酸一硫酸铵法方法获得孕酮多克隆抗体，再将多抗中的无效抗体去除；纯化后抗体浓度为 l_3mg/mL0
全文摘要
本发明涉及一种半定量检测孕酮胶体金试纸条及其制备方法。本发明属于奶牛妊娠诊断技术领域。半定量检测孕酮胶体金试纸条，其样品垫、含有金标孕酮抗体复合物金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上；硝酸纤维素膜上有检测线和对照线。试纸条制备制备胶体金由氯金酸和柠檬酸三钠制得；制备纯化多克隆抗体二环己基碳化二亚胺偶联法制备乳牛孕酮人工抗原；再用孕酮人工抗原免疫小鼠制备孕酮多克隆抗体；制备金标抗体胶体金与抗体吸附，离心法纯化；胶体金试纸条制备用含吐温的PB溶液浸泡金标垫，金标抗体灌注玻璃纤维膜；硝酸纤维膜用点膜机将乳牛孕酮人工抗原和羊抗鼠二抗喷成2条线。本发明操作简单，方便实用，高效快捷，便于推广。
文档编号G01N33/558GK102297966SQ20111013968
公开日2011年12月28日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者张建斌, 李天俊, 李志源, 杨百亮, 艾霞 申请人:天津农学院