专利名称：伐地那非的抗原模拟表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及伐地那非抗原模拟表位及其应用。
背景技术：
伐地那非(vardenafil, vard)是一种由德国拜耳公司生产的磷磷酸二酯酶_5抑制剂(PDE-5 inhibitors)，用于治疗男性阴茎勃起功能障碍。天然壮阳药品被认为安全、无副作用，深受世界各地消费者的亲睐，而在天然壮阳药中违法添加PDE-5抑制剂药物，会对公众健康产生一系列副作用，如头痛、面部潮红、消化不良、视力模糊和肌肉酸痛。PDE-5抑制剂与硝酸酯药物相互作用会导致严重的低血压。因此，加强天然壮阳药物中非法添加PDE-5抑制剂的检测对人类的健康意义重大。目前，筛查违法添加的伐地那非的检测方法包括LC-MS、GC-MS和LC/ES1-MS/MS，虽然上述方法灵敏、精确、可靠，但所需设备昂贵且运行费用高，很难在基层工作中大规模开展。免疫学检测方法具有灵敏、特异、快速和廉价的特点，已广泛运用于食品和环境样品的快速检测。但是该方法必须使用vard标准品，不仅增加了检测成本，而且对检测人员及环境易造成危害，在一定程度上制约了免疫学方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。噬菌体展示技术为获得vard的代替品提供了技术支持。本发明通过用噬菌体展示肽库技 术，从肽库中筛选出能与靶分子(抗伐地那非单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，通过获得的伐地那非抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测。

发明内容
本发明以抗伐地那非单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示环七肽库，进行亲和淘选，获得了 I种伐地那非的抗原模拟表位，其氨基酸序列如下
伐地那非抗原模拟表位从噬菌体随机环七肽库中筛选的伐地那非抗原模拟表位(多肽)，其氨基酸序列为CKFPSHPYC。上述抗原模拟表位(多肽)结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，K代表赖氨酸残基,F代表苯丙氨酸残基，P代表脯氨酸残基，S代表丝氨酸残基，H代表组氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。抗原模拟表位的N末端和C末端的两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键,为环状结构。本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，优选为AAG TTTCCG TCG CAT CCT TAT。本发明提及的伐地那非抗原模拟表位(多肽)可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行伐地那非抗原模拟表位的大量制备。本发明还涉及所述伐地那非抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。本发明伐地那非抗原模拟表位(CKFPSHPYC)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有伐地那非抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将伐地那非抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替伐地那非标准品来进行免疫学检测分析。还涉及伐地那非抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

还涉及伐地那非抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。前述伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好。本发明的有益效果是本发明伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了伐地那非对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。


图1以伐地那非抗原模拟表位建立的间接竞争ELISA标准曲线。线性检测范围为(2. 4 - 32) ng/mL, IC50 为 8. 8 ng/mL。
具体实施例方式
实施例1.伐地那非抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定
I)伐地那非抗原模拟表位的亲和淘选具体方法为用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，并以终浓度100 μ g/mL包被96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用TBST (50 mM NaCl, pH 7. 5 包含 O. 1% Tween-20 (v/v))洗涤 10 次后，加入 300 μ I 封闭液(3% BSA-PBS)4°C孵育2小时。2小时后弃封闭液，用TBST洗涤5次，每孔加入100μ I噬菌体肽库(噬菌体展示环七肽库或十二肽库，购自NEB公司，用TBS 10倍稀释噬菌体原液，约1. OXlO11 pfu)，22-26°C振荡反应I小时。弃去未结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，结合上的噬菌体用O. 2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脱，并立即用15 μ I I M Tris-HCl(pH 9.1)中和。取10 μ I洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20 mL生长至对数前期的Ε. coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗伐地那非单克隆抗体浓度分别为75 μ g/mL和50 μ g/mL,所用的TBST浓度为O. 25%和O. 5%，其余步骤同上。2)阳性噬菌体克隆的鉴定从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个曬菌体斑,进行曬菌体的扩增,采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay,1-ELISA)进行阳性卩遼菌体克隆的鉴定,具体方法为首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，10 Pg/mL包被96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育I小时；投入100 μ 噬菌体斑扩增液(1. OX IO11 pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37 °C孵育I小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μ1，37 °C孵育I小时；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光显色5min，酶标仪(ThermoScientific Multiskan FC)读取450 nm处的吸收值。选取OD45c!大于阴性对照2倍的卩遼菌体克隆为阳性克隆。3)伐地那非抗原模拟表位的鉴定采用间接竞争ELISA的方法进行伐地那非抗原模拟表位的鉴定，具体方法为用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，10Kg/mL 包被酶标板，4°C 孵育过夜；第二天用 PBST (10 mM PBS, 0. 05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育I小时；投入50 μ 经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1. OXlO11 pfu)和50 μ 伐地那非标准品(浓度范围为0_20 ng/ml)，37°C孵育I小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μ1，37 孵育I小时；加入100 μ TMB底物液，避光显色5min，读取OD45tl,能结合抗伐地那非单克隆抗体，且能被伐地那非标准品所阻断的噬菌体，鉴定为伐地那非的抗原模拟表位。
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实施例2.伐地那非抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争ELISA鉴定展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下进行噬菌体扩增,在第一步离心后,将800 μ 含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μ PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100 μ 碘化物缓冲液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入250 μ 无水乙醇沉淀DNA，离心后再用70%乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20 μ 灭菌水，取2 μ 进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5 PL噬菌体模板进行DNA测序，其-96 gill测序引物为5’ -hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得伐地那非抗原模拟表位的氨基酸序列CKFPSHPYC。实施例3.伐地那非抗原模拟表位作为竞争抗原在ELISA中的应用(I)样品提取
称取5g待测样品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman I号滤纸进行过滤后,取I ml滤液加入4 ml PBS(磷酸盐缓冲液，pH=7. 2)混匀后，即为样品提取液，待用。(2)包被及封闭用10 mM PBS (pH 7.4)稀释抗伐地那非单克隆抗体，10 Pg/ml包被酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 °C孵育I小时后，用PBST洗板6次待用。( 3 )标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体(1. OX IO11 pfu)和一系列不同浓度的50 μ 伐地那非标准品，37°C孵育I小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育I小时。然后用TMB底物显色，读取OD45tlt5以伐地那非浓度对数为横坐标，结合率(加入伐地那非的孔的OD45tl/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线(图1)。(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体(1. OX IO11 pfu)和待测样品提取液，37°C孵育I小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育I小时。然后用TMB底物显色，读取0D·，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中伐地那非的含量。实施例4.伐地那非抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用(I)样品提取
称取5g样品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman I号滤纸进行过滤后,取Iml滤液加入4ml PBS (磷酸盐缓冲液，pH=7. 2)混匀后，即为样品提取液，待用。(2)包被及封闭
用10 mM PBS (pH 7.4)稀 释展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体(2. OX IO11pfu), 100 μ 包被于酶标板，4°C孵育过夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 °C孵育I小时后，用PBST洗板6次待用。( 3 )标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 抗伐地那非单克隆抗体(O. 5 ng/ml)和一系列不同浓度的50 μ 伐地那非标准品，37°C孵育I小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小时。然后用TMB底物显色，读取0D45(I。以伐地那非浓度对数为横坐标，结合率(加入伐地那非的孔的OD450/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 抗伐地那非单克隆抗体(O. 5ng/ml)和一系列不同浓度的50 μ 伐地那非标准品，37 °C孵育I小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小时。然后用TMB底物显色，读取0D45(I。以伐地那非浓度对数为横坐标，结合率(加入伐地那非的孔的OD450/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线
实施例5.伐地那非抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用(I)样品提取
称取5g样品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman I号滤纸进行过滤后,取I ml滤液加入4毫升PBS (磷酸盐缓冲液，pH=7. 2)混匀后，即为样品提取液，待用。(2)噬菌体及控制线的点阵
用10 mM PBS (pH 7.4)稀释展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体(2. OX IO11pfu)，用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上(孔径O. 2-0. 45微米)，作为检测线；将0. 5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上(位于检测线的上方，距离大于5毫米)，作为控制线。(3)胶体金标记伐地那非抗体
将伐地那非抗体逐滴加入胶体金溶液(pH=8. 2)中，边滴边搅拌，30分钟后，取1% PEG加入上述溶液中，继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的10% BSA溶液，搅拌15分钟后，静置30分钟，离心后去上清，得到胶体金标记的伐地那非抗体溶液。(4)胶体金检测卡的组装
将胶体金标记的伐地那非抗体点喷于胶金垫上(1.O微克/毫升)，将样品垫、胶金垫，点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装，切成试纸条，装入检测卡中待用。(5)样品的检测
将样品提取液加入样品垫中，静置10分钟，若样品中含有伐地那非且超过胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域不显色，而控制线区域显色；若样品中不含有伐地那非且低于胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域显色，控制线区域也显色。若控制线区域不显色，表明试纸条失效。

实施例5伐地那非抗原模拟表位的大量制备
(I)以曬菌体扩增的方式
将展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体加入至20 ml接种有ER 2738的培养物中，37度220 rpm振荡培养4. 5 h。将培养物转入另一离心管中，4 V 10000 rpm离心10 min，将上清的上部80 %转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4 °C下静置120min。4°C 10000 rpm离心PEG/NaCL静置溶液15 min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入ImL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。(2)以伐地那非抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备A. PCR扩增伐地那非抗原模拟表位的外源编码基因
PCR反应体系(50 μ
10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2. 5 mM)4 M-L
M13KE insert extension primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌体DNA模板I μ
Pyrobest DNA Polymerase0. 5 M-L
灭菌 ddH2037. 5 μ PCR反应条件
95 0C5 min接着 95 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec,72°C 10 min 共 30 cycles。采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。伐地那非抗原模拟表位的编码基因序列为AAG TTT CCG TCG CAT CCT TAT0B.外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII，NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。C.酶切后产物的连接及转化
将质粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩尔比)混匀，于16 °C水浴连接12 h,取10 μ L连接产物加至100 μ L感受态细胞TBl中，充分混匀。冰浴30 min后，42 V水浴热激90 S，立即冰浴5 min后补加600 μ L LB液体培养液，37 °C, 200 rpm培养I h，10000rpm离心2 min,吸去上清留取约200 μ L,涂布于LB-A固体(Ampr)培养基中，37 °C过夜培养，得到阳性克隆。伐地那非抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5 mL LB-A，0. 2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按I %接种量(v/v)接种于50 mL的LB_A，0. 2 %蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37°C，220 r/min振荡培养，当培养物细菌浓度0D600达到O. 6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为O. 2 mmol/L,220 r/min振荡培养，将诱导物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，离心20 min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g细胞湿重)，加入EDTA至I mM，室温下震荡5-10min,8000 g,4°C,离心20 min,弃上清,沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgS04,冰上震荡10min,8000 g,4°C,离心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7. 4,获得伐地那非抗原模拟表位-MBP融合蛋白。SEQUENCE LISTING
<110>南昌大学
〈120〉伐地那非的抗原模拟表位及其应用
〈130〉I
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉9
〈212〉PRT〈213〉人工序列
〈400〉I
Cys Lys Phe Pro Ser His Pro Tyr CysI5
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉DNA〈213〉人工序列
〈400〉 2
aagtttccgt cgcatcctta t2权利要求
1.伐地那非的抗原模拟表位，其特征在于氨基酸序列为CKFPSHPYC。
2.编码权利要求1所述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列AAGTTT CCG TCG CAT CCT TAT。
4.如权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有伐地那非抗原模拟表位的噬菌体粒子；所述化学合成指依据模拟表位模拟表位氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行伐地那非抗原模拟表位的大量制备。
5.权利要求1所述抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于伐地那非抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
7.如如权利要求5所述应用，其特征在于伐地那非抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及伐地那非的抗原模拟表位，其氨基酸序列为CKFPSHPYC。本发明伐地那非抗原模拟表位可以替换价格昂贵的伐地那非标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于伐地那非的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然伐地那非分子相似的免疫反应特性，效果非常好，减少了伐地那非对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。
文档编号G01N33/68GK103044526SQ20121056137
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者何庆华, 许杨, 刘星 申请人:南昌大学