专利名称：一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米材料应用领域，具体涉及一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白 变异体(AFP-U)检测试剂盒。
背景技术：
在世界范围内，乙肝病毒和丙肝病毒肝炎及肝硬化是肝细胞肝癌(HCC)的重要危 险因素，90%以上的HCC患者被检出乙肝病毒。我国是肝癌高发国家，每年约11万患者死 于HCC，这相当于整个世界死于HCC患者的45%。临床肝癌发现时多已晚期，治疗难度大， 手术并发症多，疗效通常不好，生存期短，一般发病后生存时间仅为6个月到一年。所以，在 肝癌防治中，早期发现、早期诊断和早期治疗就显得尤为重要。甲胎蛋白(AFP)作为HCC的诊断及疗效随访观察指标已应用多年，由于AFP不够 特异从而限制了 HCC早期诊断的价值，但AFP对HCC可疑患者(指高危人群中)的筛选还 是有效的。上世纪八十年代，上海市肿瘤研究所许凯黎研究员等最早采用扁豆凝集素(LCA) 亲和放射免疫电泳方法，检测HCC病人血清中AFP-L3。发现良性肝病时肝细胞坏死后再 生时产生的AFP糖链结构，与HCC时产生的AFP糖链结构上有明显差异。进一步研究发现 AFP-L3在两支链复合型糖链的还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺上结合着α _1_6_岩藻聚糖， 该糖链结构能特异性结合LCA。研究人员将AFP分为LCA非结合型AFP_L1主要存在于良 性肝病中、AFP-L2来自孕妇，LCA结合型AFP_L3为HCC所特有，揭示了 AFP-L3是HCC恶性 程度的一个重要标志。在HCC的早期诊断中检测AFP-L3是非常有效的。据报道，AFP-L3 在小肝癌(< 2cm)可以有35%的阳性率，AFP-L3比影像学检查可以提前9_12个月发现 HCC的存在。对良性肝病特异性> 95%。AFP-L3的敏感性与HCC的临床分期相关AFP_L3 用于检测HCC的总的敏感性大约在60%左右之间。在直径小于2cm肝癌中，其敏感性只有 35-45%。随着HCC的增大，AFP-L3的敏感性也随之升高。当HCC的直径彡5cm时，AFP-L3 的敏感性可高达80-90%。AFP-L3阳性的HCC存在早期血管浸润和肝内转移的倾向。如果 α -连环蛋白缺失，那么HCC常常有肝外的转移。影像学研究发现AFP-L3阳性的HCC通常 有丰富的肝动脉血液供给，肿瘤的倍增时间较短。这就提示了 AFP-L3阳性的HCC生长的非 常快并且容易发生早期转移。AFP-L3对肝癌的诊断具有很高的准确率。HCC的早期发现可 以为患者提供更多的治疗机会，如肝癌治疗最有效的外科切除术，介入治疗等。目前，我国政府正式将AFP-L3检测纳入医保项目，人们期待操作简便、快速、稳定 性好、重复性好的AFP-L3检测方法。

发明内容
本发明旨在提供一种磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体(AFP-U)检测试 剂盒，本发明还提供一种上述磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体(AFP-U)检测 试剂盒的制备方法。
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本发明的另外一个目的是提供一种上述磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异 体(AFP-L3)检测试剂盒的用途。本发明的磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体(AFP-U)检测试剂盒含有如 下的物质含有凝集素修饰的磁珠作为固相载的缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。进一 步的描述如下一种磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体的检测试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒含有如下物质(1) 一种含有0. 5% -10%重量的凝集素修饰的磁珠作为固相载 体的PH为7. 1-7. 9的缓冲液，其中凝集素修饰的磁珠和其上所含的凝集素的重量百分比为 4-200 1 ；所述的缓冲液含有25mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、25mM的氯化钠 (NaCl)、2mM的氯化镁(MgCl2)和2mM的氯化钙(CaCl2)的水溶液；(2) 一种pH为7. 1-7. 9 的清洗缓冲液，上述的清洗缓冲液含有50mM的Tris-Hcl、50mM的NaCl、2mM的MgCl2和2mM 的CaCl2的水溶液；(3)和一种pH为6. 5-7. 0的洗脱缓冲液；上述的洗脱缓冲液含有0. 25M 的甲基-a-D-甘露糖(Ethy 1-a-Mannopyranoside)、50mM 的 Tris-Hcl 和 0. 5M 的 NaCl 的水 溶液。所含有的成分及应用方法为使用凝集素修饰的磁珠作为固相载体在结合缓冲 液中与待测样品中的AFP-L3结合；在清洗缓冲液中将AFP-L3与凝集素修饰的磁珠分离； 在洗脱缓冲液中将凝集素修饰的磁珠上结合的AFP-L3洗脱下来；最后利用检测系统对 AFP-L3进行定性或定量的检测。本发明所提供试剂盒中凝集素修饰的磁珠具有超顺磁和相应的磁场响应性，凝集 素修饰的磁珠可稳定的在水溶液中或水与乙醇的混合溶液(乙醇的重量为1-40% )中存在 和保存，磁珠粒径在I-IOOOOOnm之间，其中优选为300-30000nm，磁珠和凝集素的重量百分 比为200-4 1，优选为40-4 1。所述的凝集素包括扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻 凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素或槐凝集素等，是从相应的 植物种子中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结 合的能力，如扁豆与D-甘露糖、D-葡萄糖，大豆与D-半乳糖，花生与D-半乳糖、Gal (1 — 3)， 刀豆与D-葡萄糖、D-甘露糖，豌豆与D-甘露糖，荆豆与L-岩藻糖结合等。其中，优选为扁 豆凝集素。本发明所述的试剂盒，其中所述凝集素修饰的磁珠的制备方法包括吸附、偶联或 包裹。其中的优选方法为将含有氨基或羧基的固含量为0. 5% -30%磁珠与凝集素混合， 加入缩合剂反应0.5-48小时，磁分离洗涤；所述的磁珠与缩合剂的质量比是1-5 1-20 ； 所述的磁珠与亲和吸附剂混合的质量比是1-15 1-5;所述的磁珠与缩合剂的质量比是 1-5 1-20;所述的缩合剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N”-羰基 二咪唑、二环己基碳二亚胺、4- 二甲氨基吡啶或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。本发明所述的试剂盒可用于检测相当一部分肝细胞肝癌(HCC)病人特有的 AFP-L3。本发明所述试剂盒的使用步骤如下(1)取500 μ I-Iml凝集素修饰的磁珠，磁分离2_5分钟后，弃上清液；(2)在磁珠中加入500ul_lml结合缓冲液平衡反应系统，磁分离2_5分钟后，弃上
清液；
(3)在磁珠中加入475 μ l-900ul的结合缓冲液，得混合液A ；将50ul_100ul病人 血清或肝腹水加入到混合液A中，混合均勻，静置5-10分钟；磁分离，弃上清；(4)在磁珠中加入500ul_lml的Tris-Hcl清洗缓冲液清洗5 6次(旋转清洗)， 磁分离，弃上清；(5)在磁珠中加入500 μ I-Iml的含甲基_a_D_甘露糖的Tris-Hcl洗脱缓冲液，充 分混勻，室温静置5-10分钟，磁分离，收集上清，为AFP-L3分离液；用酶标法或化学发光法 定性或定量检测AFP-L3分离液。本发明所述试剂盒中的结合缓冲液的配置方法为称取3. Og三羟甲基氨基甲烷、 1. 45g氯化钠、0. 4g氯化镁、0. 22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH 值在7. 1-7. 9之间；再加蒸馏水终体积至1000ml，最终各物质的浓度为25mM的Tris-Hcl、 25mM的NaCl、2mM的MgCl2、2mM的CaCl2、。该缓冲液起平衡反应系统，加强凝集素修饰的磁 珠与AFP-L3糖基结合作用。本发明所述试剂盒中的清洗缓冲液的配置方法为称取6. 05g三羟甲基氨基甲 烷、2. 9g氯化钠、0. 4g氯化镁、、、0. 22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸， 调节PH值在7. 1-7. 9之间；再加蒸馏水终体积至1000ml，最终各物质的浓度为5OmM的 Tris-Hcl,50mM 的 NaCl、2mM 的 MgCl2、2mM 的 CaCl2、。该缓冲液起清洗作用。本发明所述试剂盒中的洗脱缓冲液的配置方法为称取6. 05g三羟甲基氨基 甲烷、29g NaCl,48. 5g甲基_a_D_甘露糖溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调 节pH值在6. 5-7. 0之间；再加蒸馏水终体积至1000ml，最终各物质的浓度为0. 25M的 Ethyl-a-Mannopyranoside、50mM 的 Tris_Hcl、0. 5M 的 NaCl。该缓冲液能解离凝集素与 AFP-L3糖基的结合，起到分离AFP-L3的效果。本发明所述试剂盒中的检测系统主要为对AFP-L3所进行的定性或定量的检测方 法，其中包括使(但不限于)用金标试纸条对AFP-L3进行定性或半定量检测，使用(但不 限于)ELISA或化学发光法或萤光法等对AFP-L3进行定量检测。本发明应用磁性微球快速分离AFP-L3，进行定性/定量测定AFP-L3方法，具有操 作简便、快速、稳定性好、重复性好、特异性强等特点。经检测比较，本发明的AFP-L3检测， 总体使用效果优于目前已使用的AFP-L3凝集素双向电泳法及亲和吸附法等方法，还可的 作为自动化分离及定量测定AFP-L3，有利普及推广，更具有市场竞争力。因此，本发明可发 展成为新一代快速检测AFP变异体的试剂盒。为肝癌的预防、诊断、治疗提供支持。为尽早 的发现肝癌患者，提高肝癌患者的生存率及延长其生存期，发挥临床应用价值。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，但是不能限制本发明的内容。本发明中采用的磁珠或者凝集素修饰的磁珠可以从上海奥润微纳新材料科技有 限公司和陕西北美基因股份有限公司购买得到，也可以通过实施例1-3获得。实施例中采 用的正常人血清标本110例来源于肿瘤研究所体检血清；慢性乙肝300例及肝硬化200例 标本来自上海市徐汇区大华医院；肝癌标本200份来自解放军四五五医院、上海市徐汇区 大华医院、启东肝癌防冶研究所、湖南湘西中医医院。孕妇血清20份来自上海市长宁区妇 幼保健院。所有新鲜血清分离后置-20°C保存至检测。
实施例1凝集素修饰的磁珠的制备取固含量为20%的氨基或羧基化磁珠(粒径300nm)溶液ImL与含有2mg扁豆凝 集素的溶液ImL混合，加入5mg 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均勻， 室温搅拌反应48小时后，磁分离洗涤后备用，所制备的凝集素修饰的磁珠当中磁珠与所含 的凝集素的重量百分比为25 1，其可放置在水与乙醇的混合溶液(乙醇的重量为20% ) 中保存。本实施例可扩展为固含量为0. 5% -30%的氨基或羧基化磁珠。实施例2凝集素修饰的磁珠的制备取固含量为20%的氨基或羧基化磁珠(粒径IOOOOnm)溶液ImL与含有2mg扁豆 凝集素的溶液ImL混合，加入5mg 二环己基碳二亚胺，混合均勻，室温搅拌反应M小时后， 磁分离洗涤后备用，所制备的凝集素修饰的磁珠当中磁珠与所含的凝集素的重量百分比为 50 1，其可放置在水与乙醇的混合溶液(乙醇的重量为10%)中保存。本实施例可扩展 为使用1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N, N” -羰基二咪唑、二环己基碳二 亚胺、4- 二甲氨基吡啶或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种缩合剂。 实施例3凝集素修饰的磁珠的制备取固含量为20%的不含有氨基或羧基化磁珠(粒径500nm)溶液lmL，先冻干后 再与含有2mg花生凝集素的溶液ImL混合，充分振荡混合均勻，室温孵化48小时后，磁分 离洗涤后备用，所制备的凝集素修饰的磁珠当中磁珠与所含的凝集素的重量百分比为 200 1。本实施例可扩展为使用扁豆凝集素、大豆凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、 豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素或槐凝集素中的一种或2-4种。实施例4凝集素修饰的磁珠的应用1.测试方法主要过程500 μ I-Iml的凝集素修饰的磁珠，磁分离1_2分钟后，弃上清液，加入 500ul-lml结合缓冲液平衡反应系统，磁分离2-5分钟后，弃上清液。加入450 μ 1 (结合缓冲 液)25mM Tris-Hcl、25mM NaCl，、2mM MnCl、2mM CaCl2, pH7. 1 pH7. 9，得混合液 Α。将病人 血清加入到混合液A中，混合均勻，静置10分钟；磁分离，弃上清，加入500 μ 1-1000 μ 1 (清 洗缓冲液)50mM Tris-Hcl,2mM MnCl2,2mM CaCl2, ρΗ7· 1_ρΗ7· 9，清洗 5-6 次，力口 入 250 μ 1-500 μ 1 (洗脱缓冲液液)0. 25ΜΕthy 1 -a-mannopyranoside>25mM Tris_Hcl、50mM NaCl,pH6. 5_pH7. 0，充分混勻，室温静置5分钟。磁分离，收集上清，为AFP-L3分离液；化学 发光法定量检测AFP-L3分离液(或用金标试纸条进行定性或半定量的检测)。注由于凝集素修饰的磁珠保存液含有20%乙醇，因此操作时，必须用结合缓冲 液清洗1-2次进行平衡。2.凝集素修饰的磁珠分离AFP-L3定量测定部分病例结果的分析其中凝集素修饰的磁珠可从陕西北美基因股份有限公司购买或采用实施例1的 方法制备。
权利要求
1.一种磁分离法主导的快速肝癌甲胎蛋白变异体的检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒含有如下物质(1) 一种含有0.5%-10%重量的凝集素修饰的磁珠作为固相载体的PH 为7. 1-7. 9的结合缓冲液，其中，所述的凝集素为扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀 豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素或槐凝 集素；凝集素修饰的磁珠和磁珠所含的凝集素的重量百分比为4-200 1;所述的缓冲液含 有25mM的Tris-Hcl、25mM的氯化钠、2mM的氯化镁和2mM的氯化钙的水溶液；(2) —种pH 为7. 1-7. 9的清洗缓冲液，上述的清洗缓冲液含有50mM的1Tris-HcljOmM的氯化钠、2mM的 MgCl2和2mM的CaCl2的水溶液；(3)和一种pH为6. 5-7. 0的洗脱缓冲液；上述的洗脱缓冲 液含有0. 25M的甲基-a-D-甘露糖、50mM的Tris-Hcl和0. 5M的氯化钠的水溶液；所述的 Tris为三羟甲基氨基甲烷。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠粒径在 I-IOOOOOnmo
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠粒径为 300-30000nm。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素修饰的磁珠和凝集素的重 量百分比为4-200 1。
5.如权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述的凝集素为扁豆凝集素.
6.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，(1)所述凝集素修饰的磁珠的制备方法包括吸附、偶联或包裹的方法，或者将含有或不 含有氨基或羧基的固含量为0. 5% -30%磁珠与凝集素混合，加入缩合剂反应0. 5-48小时， 磁分离洗涤除去未反应的缩合剂；所述的磁珠与缩合剂的质量比是1-5 1-20;所述的磁 珠与亲和吸附剂混合的质量比是1-15 1-5;所述的缩合剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐、N, N”-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶或N-羟基琥 珀酰亚胺中的一种或两种；所述的缩合剂如权利要求1所述；(2)所述的结合缓冲液的配置方法为称取3.Og三羟甲基氨基甲烷、1.45g氯化钠、 0. 4g氯化镁、0. 22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在7. 1-7. 9 ； 再加蒸馏水终体积至1000ml、；(3)将(1)的凝集素修饰的磁珠和(2)的结合缓冲液配置成为有0.5% -10%重量的凝 集素修饰的磁珠作为固相载体的PH为7. 1-7. 9缓冲液；(4)所述的清洗缓冲液的配置方法为称取6.05g三羟甲基氨基甲烷、2. 9g氯化 钠、0. 4g氯化镁、、、0. 22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在 7. 1-7. 9 ；再加蒸馏水终体积至IOOOml ；(5)所述的洗脱缓冲液的配置方法为称取6.05g三羟甲基氨基甲烷、29g氯化钠、 48. 5g甲基-a-D-甘露糖溶解于950ml蒸馏水中，加入少量浓盐酸，调节pH值在6. 5-7. 0 ； 再加蒸馏水终体积至1000ml。
7.—种如权利要求1所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于检测肝癌 甲胎蛋白变异体。
8.如权利要求7所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒的使用是将凝集 素修饰的磁珠作为固相载体在结合缓冲液中与待测样品中的AFP-L3结合；在清洗缓冲液中将AFP-L3与凝集素修饰的磁珠分离；在洗脱缓冲液中将凝集素修饰的磁珠上结合的 AFP-L3洗脱下来；利用检测系统对洗脱下来AFP-L3进行定性或定量的检测。
9.如权利要求5或8所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒的使用(1)取 500 μ I-Iml含有0. 5% -10%重量的凝集素修饰的磁珠的ρΗ为7. 1-7. 9的缓冲液，在放置 磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清液获得含有70% -99. 8%重量的凝集素 修饰的磁珠；(2)在(1)获得的磁珠中加入500ul-lmlpH为7.1_7. 9的结合缓冲液，充分混勻平衡反 应系统后，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清液；(3)在(2)获得的磁珠中加入475μ l-900ul的ρΗ为7. 1-7. 9结合缓冲液，得混合液 A ；将25ul-100ul血清或肝腹水样品加入到混合液A中，混合均勻，静置5_10分钟；在放置 磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清；(4)在(3)获得的磁珠中加入500ul-lmlpH为7.1-7. 9的的Tris-Hcl清洗缓冲液清洗 5-6次(旋转清洗)，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分离2-5分钟后，弃上清；(5)在(4)获得的磁珠中加入500μ I-Iml的含甲基_a_D_甘露糖的Tris-Hcl ρΗ为 6. 5-7. 0的洗脱缓冲液，充分混勻，室温静置5-10分钟，在放置磁铁的磁架上静置进行磁分 离2-5分钟后，收集上清液，为含有肝癌甲胎蛋白变异体的分离液；(6)用金标试纸条对( 获得的肝癌甲胎蛋白变异体分离液进行定性或半定量检测， 或者用酶标法、化学发光法或萤光法进行定性或定量检测(5)获得的肝癌甲胎蛋白变异体 分离液。
全文摘要
本发明涉及一种快速磁分离法主导的肝癌甲胎蛋白变异体(AFP-L3)检测试剂盒。制备方法和用途。所述试剂盒含有如下物质(1)一种含有0.5％-10％重量的凝集素修饰的磁珠作为固相载体的pH为7.1-7.9的结合缓冲液；(2)一种pH为7.1-7.9的清洗缓冲液；(3)一种pH为6.5-7.0的洗脱缓冲液。该试剂盒可以简便、快速的检测肝肝癌甲胎蛋白变异体。
文档编号G01N33/68GK102147415SQ20101061936
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者梁晓飞, 洪锦兴, 王维林, 薛建祥, 许凯黎, 陈复华 申请人:上海市肿瘤研究所