专利名称：通用中草药、中成药、中药保健品色谱指纹图谱制定方法
技术领域：
本发明涉及一种制定中草药、中成药、中药保健品色谱指纹图谱的方法，具体地说是利用色谱分离和分析技术，对所得到的数据进行特殊的处理，以制定出兼容性良好的中药色谱指纹图谱。本发明还涉及中药天麻指纹图谱的制定。
2.背景技术中药指纹图谱技术所采用的手段有色谱技术、光谱技术、核磁共振技术及生物技术等，其中以色谱技术最为常用和可靠。当前，由于高效液相色谱仪器的普及，其已经成为中药指纹图谱制定中的核心设备。
由于中药指纹图谱能够客观的、全面的反应药物的内在质量，在评价中药的真伪优劣时能够发挥重要作用，体现中药成分复杂的特点，所以，国家规定所有中药注射液的原料药材及其半成品和成品，都必须制定相应的指纹图谱。随着中药材GAP生产基地的建设和饮片批准文号管理制度的实施，以及人们对中药知识产权的重视程度的提高，都极大地刺激了对中药指纹图谱的需求。
中药指纹图谱的制定包括下列几个环节(1)样品采集采集10批有代表性的样品，对所采集的样品要做到定品种、定产地、定采收季节、定药用部位和定加工方法。
(2)色谱分析对所采集的样品，根据实验结果，采取适当的方法制备成样品供试液，并选用适当的标准对照品，进行色谱条件的优选。将选得的适当分离方法，用于10批样品的测定，并进行重现性、精密度、稳定性、加样回收等方法学研究。
(3)数据处理对以上10批样品经适当方法进行分离分析所得到的数据进行处理，形成共有模式。
以上环节中，样品采集和色谱分析基本上有章可循，针对不同样品采用不同方法，而数据处理这一环节是制约中药指纹图谱发展和普及的瓶颈技术。
目前，尚无得到公认的可用于中药指纹图谱数据处理的软件或方法。现有的几种软件都存在着数据导入繁琐、结果可信度不大、同类但不同厂家生产的色谱仪器所产生的数据之间不兼容，即用根据Agilent HPLC仪产生的数据制定的指纹图谱，在用以鉴别样品时，也必须用Agilent HPLC仪来产生数据，而且要保证两台仪器的相关参数完全一致才能进行。这种对不同仪器产生的数据的不兼容性，引来了很多知名专家的强烈质疑，并一直阻碍着中药指纹图谱的发展。因为这多少意味着，为了推广中药指纹图谱技术，最好全国所有单位，无论大小，都使用同一厂家同一型号的仪器。这种仪器垄断目前是不可能的，也不利于将来可能的国产色谱仪器的开发生产。
因此，开发出一种兼容性良好、可操作性强、易于普及推广、能够获得国际认可的指纹图谱数据处理方法已成当务之急。
3.发明目的本发明是为了解决中药指纹图谱的通用性问题，并对用标准中药指纹图谱来评价目标样品的真伪和品质优劣方法做出规范。本发明的另一目的是为了制定中药材天麻的HPLC指纹图谱。
4.发明内容本发明的目的在于提供一种通用的中药色谱指纹图谱的制定方法。其特征在于其特殊的数据处理方法和样品评价方法，以用来对各种类型的色谱仪器产生的色谱数据进行处理，制定出在同类型仪器(如高效液相色谱仪或气相色谱仪或高效毛细管电泳色谱仪)但不同厂家或型号的产品(如Agilent1100，Waters 515，Shimadzu 10A或未来的国产什么品牌)之间兼容性能良好的中草药、中成药或中药保健品的标准色谱指纹图谱，或根据标准指纹图谱对目标样品进行真伪及优劣的判别。
本发明的另一目的是根据中药指纹图谱制定的样品采集要求，按照上述发明的数据处理方法，制定了中药材天麻的HPLC指纹图谱。
本发明关于中药指纹图谱的制定是由如下几个环节组成的(1)样品采集根据中药指纹图谱制定的样品采集要求，对所要研究的中药材样品，选定品种、产地、药用部位、采收季节、加工方式，采集有代表性的10批次以上样品。对中成药或中药口服液的中间体或成品，收集10批样品，供实验之用。
(2)色谱数据的采集查阅文献，根据样品中所含有的化学成分的性质，选用合适的色谱仪器(HPLC或GC或HPCE)，包括合适的检测器。按照色谱分离方法学研究的一般做法，对样品提取溶剂(特殊样品可用极性大小迥异的两种溶剂分段提取，以制备两张指纹图谱)、提取方式、提取时间进行优选。如用的是紫外检测器，则要选择合适的波长，这可结合样品图谱中的色谱峰多少、响应值大小、分离度好坏等方面的因素综合考虑。若有标准对照物，可用其作为样品供试液制备及色谱方法优选的参照物。一般首选梯度洗脱的方法(GC用程序升温的方法)，以使得保留性能不同的组分先后都能被洗脱。每针要运行足够的时间(一般为60分钟左右)，以保证保留时间大的组分的色谱峰能够被图谱记录。其中要提供一张120分钟的全谱。要对系统适应性、样品稳定性、方法重现性、标准物质的加样回收率进行考察。用优选的方法，对各样品供试液进行色谱分析，得到各组数据。其中要剔除不符合《中国药典》有含量规定的样品和相应峰面积离群的样品。
(3)数据的处理用第一个峰面积大于总峰面积5％的分离较好的非溶剂峰(保留时间较后续参选峰小)作为基准1，称其为基准峰或参比峰，后续峰面积大于5％总峰面积的峰称为参选峰，逐个除以基准峰，得到指纹图谱保留时间比率的一组数据，对各样品的相应的保留时间比率求平均数和方差。
用基准峰的峰高作为1，后续参选峰逐个除以基准峰高，得到指纹图谱峰高比率的一组数据，对各样品的相应的峰高比率求平均数和方差。
本发明的重要特点之一是上述中药色谱指纹图谱制定中的数据处理技术。
(4)中药色谱指纹图谱的制定标准的中药色谱指纹图谱应当包括原植物学名，包括拉丁名，产地，原药材的照片，样品供试液的制备，标准对照品溶液的制备，进样体积，色谱条件(包括色谱柱、柱温、波长、流动相、梯度洗脱条件或程序升温条件)，相关图谱(包括具有代表性的样品色谱图谱和对照品色谱图谱)，用于评判目标样品真伪优劣的两组数据，即用来判定目标样品真伪的保留时间比率平均数和方差及用来评价目标样品品质优劣的峰高比率的平均数和方差。此外，还要附加使用说明及知识产权的申明。
(5)中药指纹图谱在对目标样品真伪优劣评价时的应用首先，对目标样品进行具有代表性的取样，平行三份。按照标准指纹图谱提供的方法制备样品供试液和对照品溶液，用与其相同的色谱条件进行色谱分析，对于色谱仪器，同类即可，不要求同一厂家。选取其中任一样品供试液，连续进样五次，以考察系统适应性。将所得到的图谱与标准图谱比对，以确定参比峰和参选峰。用对照品来确定参比峰与参选峰是否顺序与标准图谱一致。将三份样品的参比峰与参选峰的保留时间比率及峰高比率分别进行平均。所得到的保留时间比率的平均数与标准指纹图谱提供的保留时间比率的平均数两组数据进行相关分析(可用Excel或SPSS软件处理)，其相似度应该大于或等于0.99。因为不同的色谱峰反映的是中药中所含化学成分的信息，不同的化学成分，由于其极性大小不同，其在固定相上的容量因子k值就不同，从而在色谱柱上得以分离，表现为在不同的保留时间出现色谱峰。因此，化合物色谱峰的保留时间常被用来对其进行定性鉴别。利用目标样品的保留时间的比率与标准图谱的保留时间比率进行相关分析，从其相似度大小可知前者是否来自后者所代表的某一集合，即目标样品的真伪。本法用保留时间的比率来进行相关分析，这样就克服了不同仪器由于压力、死体积、比例阀或混匀效率的差异而带来的色谱峰保留时间的较大变化。主要由流动相和固定相种类及温度决定的保留时间在不同的仪器上会发生成比例的整体变化，这样，用保留时间的比率进行比较，就消除了这种由机器带来的误差，从而使得不同仪器产生的数据之间的比较成为可行。
将三份样品的相应峰高比率的平均数与标准指纹图谱的峰高比率数据进行相关分析。因为不同来源样品，其中化学成分的含量变化较大，所以对其相似度作适当的放宽，但相似度要大于0.9。之所以用峰高比率来代替峰高或峰面积或峰面积百分数，是因为不同仪器所匹配的色谱工作站使用的单位不同，积分方式不同，手动进样和自动进样之间也有误差，最终导致数据大小相差很大，无法比较。同时，在某型号仪器上制定的分离很好的色谱峰，到另外一台仪器上可能达不到基线分离，所以峰面积百分数也会产生误差。用峰高比率就很好地解决了指纹图谱在不同仪器上的适用性问题。可根据峰高比率与标准指纹图谱相应数据的大小的比较，来判定中药品质的优劣。具体方法如下根据Beer-Lambert定律，一定浓度的某一物质，在一定波长的紫外光照射下，其吸收值是一定的，即响应值是一定的。因此，可以假设参比峰与对照品峰的响应因子为1。在制定标准指纹图谱时，先计算出每毫克对照品相当于多少峰面积，推知参比峰所对应的假定的参比物的平均量。在评价目标样品时，也同样计算出参比物的假定量，并与标准指纹图谱的平均量进行比较，从而得知其量的多少。用目标样品中参比物的假定量除以标准图谱的平均量，用其倍数乘以各参选峰的比率，所得数据与标准指纹图谱相应的数据进行比较，就能够知道其质量的优劣。
这其中，真伪判别是首要的，因此，在运用指纹图谱来评价目标样品的质量时，应该遵从保留时间优先的原则。
此处公布的利用标准指纹图谱来对目标样品进行真伪和优劣的评价的方法，也是本发明的重要特色之一。
本发明的另一项内容是天麻药材指纹图谱的研究，具体如下取10批天麻样品的干燥60目粉末，各取0.5g，置10mL容量瓶中，加60％甲醇溶液约9mL，超声提取50min，放冷至室温，用上述甲醇溶液定容至刻度，摇匀，静置2h，上层液体3000转/min离心15min，上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液直接进样，进样量5μL。色谱条件是C18柱，柱温25℃，吸收波长为226nm，流动相A为0.1％磷酸水溶液，B为0.1％磷酸甲醇溶液，梯度洗脱，0～15min，B％为0～2％；15～60min，B％为2～45％；60～65min，B％为45～0％。相关图谱参见说明书附图，相关数据如下表所示天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表(X±SD)参比峰 参选峰1 参选峰2参选峰3参选峰4参选峰5平均数11.20045 2.114194 2.624787 2.760324 2.995108SD00.012101 0.037116 0.049847 0.052631 0.057884天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表(X±SD)参比峰 参选峰1参选峰2参选峰3参选峰4 参选峰5平均数10.207245 0.893879 1.197732 0.844632 0.705542SD00.075612 0.201240.129653 0.085216 0.068497
5.具体实施方式
实施例天麻药材指纹图谱的制定及对样品的评价植物来源本品为兰科植物天麻Gastrodia elata.B1.的干燥根茎(见

图1)。
样品采集2003年11月8日至12日，赴天麻主产地之一，安徽省金寨县燕子河乡等10个乡镇，采集了10批新鲜天麻的根茎，时值当地天麻的采收季节。
样品加工将上述采集的10批样品，分别抢水洗去泥沙，置沸水上加盖隔水蒸制2h。取出，晒至八成干时切片，晒干。
参照物溶液的制备精密称取天麻素对照品适量，加甲醇制成1mL含0.507mg的溶液，作为对照品溶液。
样品供试液的制备将上述各样品饮片，置烘箱内60℃干燥4h，取出，放冷至室温后，粉碎，过60目筛，四分法取样。准确称取上述样品0.5g，置10mL容量瓶中，加60％甲醇溶液9mL，超声提取50min，取出，放冷至室温，60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，静置2h，上层液体离心15min，3000转/min。取上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液直接进样，进样量5μL。
色谱条件仪器Agilent1100四元泵全自动进样液相色谱仪。色谱柱Lichrospher C18柱，5μm，250×4.6mm；柱温25℃。流动相A0.1％磷酸水溶液；流动相B0.1％磷酸甲醇溶液，梯度洗脱，0～15min，B％为0～2％；15～60min，B％为2～45％；60～65min，B％为45～0％。流速1mL·min-1；DAD检测器，检测波长为226nm。参比波长360nm。化学工作站A08.03，斜率5；峰宽0.05min；最小峰面积5mAU·s；最小峰高1mAU。理论板数按天麻素峰计算应不低于3500。
参照中国药典2000年版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定。
图谱所产生的相关图谱参见附图中的图2和图3。
色谱峰的选择将天麻药材各样品图谱中保留时间最小的，峰面积大于5％总峰面积，分离较好的色谱峰作为参比峰或称基准峰，此处实为天麻素的色谱峰。后续峰面积大于总峰面积的5％的色谱峰作为参选峰。参比峰与参选峰顺次编号，参比峰定为1号峰。大于5％总峰面积的色谱峰个数不会超过20个。
数据处理平均保留时间比率数据的获得将参比峰的保留时间作为1，其余参选峰的保留时间逐个除以参比峰的保留时间，所得到的比率按照编号顺次列入表内，计算每个样品相应编号峰的平均保留时间比率及方差，如下表所示天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰参选峰 参选峰参选峰 参选峰1 2 3 4 5 6平均数1 1.20045 2.114194 2.624787 2.760324 2.995108SD 0 0.012101 0.037116 0.049847 0.052631 0.057884平均峰高比率数据的获得将参比峰的峰高作为1，其余参选峰的峰高逐个除以参比峰的峰高，所得到的比率按照编号顺次列入表内，计算每个样品相应编号峰的平均峰高比率及方差，如下表所示天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰 参选峰参选峰 参选峰 参选峰12 3 4 5 6平均数10.207245 0.893879 1.197732 0.844632 0.705542SD00.075612 0.20124 0.129653 0.085216 0.068497至此，天麻药材标准指纹图谱的研制已经完成。
综上所述，完整的中药色谱指纹图谱应该包括下列几个方面(1)物名称(包括拉丁名)和药用部位；(2)材产地和加工方法；(3)相关图谱原药材的照片、标准品的色谱图、具有代表性的样品的色谱图；(4)样品供试液及对照品溶液的制备方法及进样体积；(5)色谱条件色谱柱、柱温、波长、流动相、流速、HPLC的梯度洗脱条件或GC的程序升温条件、运行时间；(6)标准数据平均保留时间比率加方差及平均峰高比率加方差；(7)使用说明及知识产权申明。
为了证明上述用Agilent1100HPLC仪制定的天麻药材的指纹图谱的通用性，特安排用常见的另外两种HPLC仪器进行了验证，即Waters515和Shimadzu10AHPLC仪。
用Shimadzu10A HPLC仪进行的验证样品供试验液的制备及色谱条件同天麻指纹图谱所提供的方法，进行色谱分析。得到的样品及标准品色谱图参见图4和图5。对所得到的数据按照本发明所制定的方法处理后如下样品保留时间比率数据表参比峰 参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰峰号1 2 3 4 5 6保留时间1 1.135075 1.941408 2.332722 2.448788 2.621612比率天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰1 2 3 4 5 6平均数1 1.20045 2.114194 2.624787 2.760324 2.995108SD0 0.012101 0.037116 0.049847 0.052631 0.057884所得到样品保留时间比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.998754。
样品峰高比率的数据表参比峰 参选峰 参选峰参选峰参选峰 参选峰峰号12 3 4 5 6峰高比率 10.106817 0.789209 1.178913 0.643444 0.650626天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰1 2 3 4 5 6平均数1 0.207245 0.893879 1.197732 0.844632 0.705542SD0 0.075612 0.20124 0.129653 0.085216 0.068497所得到样品峰高比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.982696。
用Waters HPLC仪进行的验证如下样品供试验液的制备及色谱条件同天麻指纹图谱所提供的方法，用Waters515HPLC泵，Millennium色谱工作站进行色谱分析。得到的样品色谱图参见图6。对所得到的数据按照本发明所制定的方法处理后如下样品保留时间比率数据表参比峰参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰峰号1 2 3 4 56保留时间1 1.141998 2.007957 2.428077 2.54142 2.749207比率天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰参选峰 参选峰参选峰参选峰1 2 3 4 5 6平均数1 1.20045 2.114194 2.624787 2.760324 2.995108SD0 0.012101 0.037116 0.049847 0.052631 0.057884所得到样品保留时间比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱保留时间平均比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.999668。
样品峰高比率的数据表参比峰 参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰峰号1 2 3 4 5 6峰高比率1 0.068525 0.672982 1.460918 1.103939 0.969475天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率数据表(X±SD)参比峰参选峰参选峰参选峰参选峰参选峰1 2 3 4 5 6平均数 1 0.207245 0.893879 1.197732 0.844632 0.705542SD 0 0.075612 0.20124 0.129653 0.085216 0.068497所得到样品峰高比率经过与上述天麻药材标准指纹图谱峰高平均比率在Excel和SPSS软件中进行相关分析，其相似度均为0.967993。
6.本发明的积极效果以上实验证明，本发明所制定的中药色谱指纹图谱在同类不同厂家的仪器之间有很好的适应性，为通用指纹图谱。这种兼容性不仅对现有仪器设备打破可能产生的垄断有利，也为将来国产仪器的研究开发留下了一条技术后路。按照本发明的方法，可以对某种中药的指纹图谱制定后印刷销售，也可制成软盘或光盘或在线销售。
通用性和易于推广普及是本发明的最大特点。
权利要求
1.一种制定中草药、中成药、中药保健品色谱指纹图谱的方法，其特征在于将某一种药物有代表性的10批次样品，分别用高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)或高效毛细管电泳色谱(HPCE)分离、分析，用所得到的各样品中的化学成分的相对保留时间比率的平均数及峰高比率的平均数来制定药物色谱指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的相对保留时间的比率，其特征是用第一个(保留时间较后续参选峰小)峰面积大于总峰面积5％的分离较好的非溶剂峰作为基准1，称其为基准峰或参比峰，后续峰面积大于5％总峰面积的峰称为参选峰，逐个除以基准峰，得到指纹图谱保留时间比率的一组数据，对各样品的相应的保留时间比率求平均数和方差。
3.根据根据权利要求1所述的峰高的比率，其特征是用基准峰的峰高作为1，后续参选峰逐个除以基准峰，得到指纹图谱峰高比率的一组数据，对各样品的相应的峰高比率求平均数和方差。
4.根据权利要求2所得到的平均保留时间比率和根据权利要求3所得到的平均峰高的比率，结合根据权利1所得到的色谱图，包括标准对照品的色谱图，连同原药材的实物照片，样品供试液的制备方法以及色谱条件，共同构成某药物的标准色谱指纹图谱。
5.根据权利要求4所开发的计算机软件。
6.根据权利要求1中的相应方法，可用不同或相同厂家的同类仪器，对未知样品进行分离分析，将其保留时间数据根据权利要求2所述方法进行处理，得到的相对保留时间比率与标准指纹图谱的平均相对保留时间比率用Excel软件或SPSS软件进行相关分析，相似度大于0.99，时间比率大小在标准指纹图谱平均相对保留时间比率的误差范围之内。
7.根据权利要求1中的相应方法，可用不同或相同厂家的同类仪器，对未知样品进行分离分析，将其峰高数据根据权利要求3所述方法进行处理，得到的峰高比率与标准指纹图谱的平均峰高比率用Excel软件或SPSS软件进行相关分析，相似度大于0.9。
8.根据权利要求5所得到的样品与标准指纹图谱的保留时间相似度，集合两者的色谱图谱，用来判别样品的真伪。
9.根据权利要求6所得到的样品与标准指纹图谱的峰高相似度，集合两者的色谱图谱，用来判别样品的品质的优劣。
10.根据权利要求1和权利要求2和权利要求3，制定了天麻的HPLC指纹图谱，其特征在于用C18柱，柱温25℃，吸收波长为226nm，流动相A为0.1％磷酸水溶液，B为0.1％磷酸甲醇溶液，梯度洗脱，0～15min，B％为0～2％；15～60min，B％为2～45％；60～65min，B％为45～0％；流速为1mL·min-1。
全文摘要
本发明公开了一种制定中药指纹图谱的方法。它是以经高效液相或气相或毛细管电泳色谱分析得到的化学成分的相对保留时间的比率及峰高比率来制定指纹图谱的。用其与样品按照同样色谱方法得到的数据经过相关分析，即可求出相似度，从而判别样品的真伪和优劣。本发明数据处理简单，在同类型不同厂家仪器之间的通用性强，有利于制定中药的国际化标准。本发明尚公布了天麻的指纹图谱。
文档编号G01N30/00GK1667411SQ20041001427
公开日2005年9月14日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者徐自升, 徐漫 申请人:徐自升, 徐漫