专利名称：在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法
技术领域：
本发明涉及的分析、筛选和/或衡量感兴趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/ 或酶和多肽的混合物的方法。本发明可用于检测残余的纤维素和衡量感兴趣的酶、多肽或混合物的水解活性，等等。本公开进一步涉及高通量测定法，例如，公开了用于定量感兴趣的酶或多肽在经预处理的玉米秸秆(PCQ水解中的纤维素分解活性和/或纤维素酶活性的高通量测定法。
背景技术：
目前分析、衡量或筛选感兴趣的酶、多肽或混合物的方法存在问题，且并不非常适于高通量分析。例如，一种分析经预处理的玉米秸秆(下文中称作“PCS”)水解的方法需要冗长的高压液相色谱(下文中称作“HPLC”)分析以确定糖的量。其中，PCS中的纤维素经酶法水解为葡萄糖、纤维二糖和更高级的葡聚糖。使用HPLC测量葡萄糖和纤维二糖。 本领域技术人员，已知底物的纤维素含量，可然后使用该信息计算纤维素至糖的转化百分比。因此，可测量水解中的酶的纤维素分解活性。然而HPLC步骤费时费力。使用HPLC的测定法不适于高通量分析，和/或在单一测定中快速分析多个感兴趣的酶。
已进行了使用加载于深孔板中的可移液的底物来改善HPLC测定法的尝试；然而， 仍然需要水解之后的HPLC糖分析。HPLC测定耗费时间，例如，96孔板需要大约19小时的 HPLC时间。尝试的改善充满问题，因为其在HPLC之前包括耗时的过滤、移液和稀释步骤。
已知测定法中存在的问题导致更高的研究成本，枯燥的测定法格式化(assay formatting)，以及耗时的酶活性衡量。因此，存在对具有改善的准确度和/或减少的操作时间，具有优异的准确性，优异的反应速率和/或优异的纤维素转化率(特别是当需要高通量分析时)的测定法和分析方法的持续需要。发明内容
现已发现将指示剂成分(indicator constituent)或增亮添加剂(brightening additive)如荧光指示剂化合物和/或增强剂添加至水解反应，对筛选和/或衡量感兴趣的酶、多肽和混合物在含有纤维素材料的水解反应中的性能具有显著的作用。例如，添加荧光指示剂化合物可用于检测残余的纤维素并衡量感兴趣的酶或酶混合物的水解活性。因此，现已可能在指示剂成分如荧光指示剂提供的益处下进行感兴趣的酶和/或多肽的化学测定。此外，现已可能在减少的时间中进行高通量测定。而且，现已可能以高通量形式检测出残余的纤维素并衡量感兴趣的酶、多肽或混合物的水解活性。这些方法亦可用于发现具有改善的性能特征的感兴趣的酶或感兴趣的多肽和/或对制造出的酶、肽或多肽的质量控制。在实施方案中，这些方法消除了 HPLC的使用，并且因为避免通常冗长的HPLC测定法而更快速。
本公开的第一个方面涉及分析纤维素材料的水解如木素纤维素水解中的纤维素衰变的方法。本公开的第二个方面涉及确定感兴趣的酶或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法。本公开的第三个方面涉及分析感兴趣的酶或多肽的高通量方法。本公开的第四个方面涉及分析酶或多肽性能的方法。本公开的第五个方面涉及用于衡量酶和/或多肽性能的系统。本公开的第六个方面涉及确定感兴趣的多肽是否具有纤维素分解增强活性的方法。本公开的第七个方面涉及用于如上所述本公开的诸方面的标准化方法。本公开的第八个方面涉及质量控制方法。例如，可在产生一个或多个批次的多肽或酶之后由生产商检查质量控制参数如酶活性、纤维素酶活性、纤维素分解增强活性和/ 或稳定性。此外，质量控制参数如多肽活性、酶活性、纤维素酶活性、纤维素分解增强活性和 /或稳定性可由酶或多肽的购买者检查。本公开的目标通过提供分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素的衰变的方法来实现，所述方法包括在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述方法在水解步骤之前包括 (a)将纤维素材料(如木素纤维素材料)与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。本公开的目标通过提供分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述指示剂成分是荧光指示剂化合物包括苯和联苯的苯乙烯基衍生物，芪(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2_羟喹啉 (carbostyrils)或其混合物。本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应物(hydrolyzed reaction)是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素酶活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述方法在水解之前包括下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述光信号指示感兴趣的多肽的纤维素分解活性和/或纤维素分解增强活性。
本公开的目标还通过提供分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法来实现，包括下述步骤(a)将生物质与指示剂成分如荧光化合物相接触以形成混合物；(b) 在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分例如荧光指示剂化合物的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。
本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。这些方法还可包括提供感兴趣的酶的步骤。这些方法还可包括提供感兴趣的多肽。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶(a)野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4-β-葡聚糖酶，野生型外-1，4-β-葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4- β -葡聚糖酶，突变的外-1，4- β -葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c) 变体外纤维二糖水解酶，变体内-1，4-β-葡聚糖酶，变体外-1，4-β-葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或c)的活性的片段。
本公开的目标还通过提供分析酶性能的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a) 将木素纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤 (a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的木素纤维素材料；和(d)检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。酶性能的非限定性实例包括在木素纤维素水解中纤维素衰变的指标。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶(a)野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4- β -葡聚糖酶，突变的外-1，4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外纤维二糖水解酶，变体内-1，4- β -葡聚糖酶，变体外-1，4- β -葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、 突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或c)的活性的片段。本公开的目标还通过提供分析生物质水解中纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b) 在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号， 其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶(a)野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4- β -葡聚糖酶，突变的外-1，4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外纤维二糖水解酶，变体内-1，4- β -葡聚糖酶，变体外-1，4- β -葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。这些野生型、 突变体和变体的组合亦涵盖于依照本公开的感兴趣的酶混合物。本文亦涵盖具有a)、b)或 c)的活性的片段。本公开的目标还通过提供确定感兴趣的酶或多肽是否影响纤维素水解的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定所述水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或多肽的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。本公开的目标还通过提供用于衡量酶和/或多肽性能的系统来实现，所述系统包含至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含至少一个用于下述的孔(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。在一个系统实施方案中，检测器位于反应介质之下，并位于反应介质所处于的平板之下。本公开的目标还通过提供标准化荧光强度数据的方法来实现，所述方法包括下述步骤(a)不添加酶或多肽，确定纤维素材料(例如PCQ的水解反应的平均荧光强度；和 (b)使用步骤(a)中确定的荧光强度标准化一种或多种第二水解反应的荧光强度。本发明的目标还在实施方案中通过提供在底物的水解反应中分析由一种或多种感兴趣的酶或多肽所致的纤维素衰变的方法来实现，所述方法包括在反应介质中水解含有纤维素的底物，然后添加指示剂成分，其中所述指示剂成分会使得纤维素染色；和检测来自指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”在本文中定义为一种或多种(几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括(1)测量总纤维素分解活性，和( 测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如^iang等，Outlook for cellulase improvement :Screening and selection strategies，2006， Biotechnology Advances M :452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No. 1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No. 1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由 hternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC) (Ghose, 1987,Measurement of cellulase activities,Pure App 1 · Chem. 59 :257-68)石角立的。
就本公开而言，纤维素分解活性使用本公开的方法确定，或如为了获得比较数据的目的，通过测量在下述条件下由纤维素分解混合物进行的纤维素材料水解的增加来确定l_20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在50-65°C进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM 乙酸钠 pH 5, ImM MnSO4, 50°C，72 小时，通过 AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)进行糖分析。
术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内-1，4-(1，3 ;l，4)-i3_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0 -D-glucan 4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1， 4-i3_D-糖苷键、混合的β_1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素成分的其它植物材料中的β_1，4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法Oiang等，2006，Biotechnology Advances 24 452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268的方法，在pH 5，40°C使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定内切葡聚糖酶活性。
术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1， 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纤维素、纤维素寡糖， 或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of ce1lobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15 160-167 ;Teeri 等，1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases :why so efficient on crystalline cellulose ？ ,Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本公开而言，根据 van Tilbeurgh 等，1982，FEBS Letters 149 152—156 及 van Tilbeurgh 和 Claeyssens，1985， FEBS Letters 187 :283-288描述的方法针对荧光性二糖衍生物4-甲基伞形基-β -D-乳糖苷来测定纤维二糖水解酶活性。
术语“ β -葡糖苷酶”在本文中定义为β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非还原 β -D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum !production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42 :55-66 ^ 基本方法测定β -葡糖苷酶活性。一个单位的β -葡糖苷酶活性定义为在40°C，pH5，以ImM 对硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷为底物，在IOOmM柠檬酸钠，0. 01% TffEEN 20中每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为由GH61A多肽催化的、增强由具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的生物学活性。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性l_50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99. 5% w/ w的纤维素分解酶蛋白，及0. 5-50% w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽的蛋白质，在50-65°C历时1-7天，与用相等的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(l-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白重量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)存在下使用 CELLUCLAST 1. 5L(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的混合物的纤维素酶蛋白加载量作为纤维素分解活性的来源。具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少 1. 01倍，更优选至少1. 05倍，更优选至少1. 10倍，更优选至少1. 25倍，更优选至少1. 5倍， 更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10 倍，并且最优选至少20倍。术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”在本文中定义为一种或多种(几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如 Siallom，D.和 Sioham，Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003,6 (3) :219-228) 半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶， 阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支链和直链糖类的异质组，所述糖类在植物细胞壁中通过氢键结合于纤维素微纤维， 交联为鲁棒的(robust)网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素多变的结构和组织需要多种酶的协同作用才能使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖基水解酶(GH)，或糖酯酶(CE)，其水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可分配至通过数字标记的GH和CE 家族。一些家族，由于总体类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，用字母标记(例如， GH-A)。对于这些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分类可从Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据(ihose和Bisaria，1987， Pure&AppI. Chem. 59 :1739-1752 测量。术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定义为水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括(1)测定总木聚糖分解活性，和( 测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard，Recentprogress in the assays of xylanolytic enzymes,2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) :1636-1647 ；Spanikova 禾口 Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by SchizophylIum commune， FEBS Letters 580(19) :4597-4601 ；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely 禾口 Kubicek，1997， The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal 321 :375_3810
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beectiwood)和落叶松木(Iarctiwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。 最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖， 如 Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3) :257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可在37°C用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在0. 01% Triton X-100和200mM磷酸钠缓冲液PH6中确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH6，从200mM磷酸钠pH 6缓冲液中作为底物的0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1. O微摩尔的天青精(azurine)。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St. Louis, MO, USA)水解的增加来确定的 Iml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠pH 5， 50 °C, 24 小时，如 Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279所述使用对羟基苯甲酸酰胼(PHBAH)测定法进行糖分析。
术语“木聚糖酶”在本文中定义为1，4-β -D-木聚糖-木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中l，4-i3_D-木糖苷键的内水解。就本公开而言，木聚糖酶活性是使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在50°C，pH 5从2g/L桦木木聚糖作为底物在50mM乙酸钠，0. 01% TWEEN 20中水解的起始期间每分钟产生1. O μ mol还原糖(以葡萄糖当量(glucose equivalents)测定，如 Lever，1972，A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279 所述)。
术语“β-木糖苷酶”在本文中定义为β-D木糖苷木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 37)， 其催化短β (1 — 4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的 D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40°C，pH 5从作为底物的 ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷在含有0. 01 % TffEEN 20的IOOmM柠檬酸钠中每分钟产生 1. Ομ mol 对石肖基苯酷阴离子(p-nitrophenolate anion)。
术语“乙酰木聚糖酯酶”在本文中定义为羧酸酯酶(EC 3. 1. 1. 72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0. 5mM乙酸对硝基苯酯作为底物，在含有0. 01% TWEEN 20的50mM乙酸钠pH 5. O中确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在PH 5，25°C每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase) ”在本文中定义为EC 3. 1. 1. 73 (IUBMBEnzyme Nomenclature)中的4_羟基-3-甲氧基肉桂酰糖水解酶，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解， 以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。 就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5. 0中的0. 5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在PH 5，25°C每分钟释放出Iymol对硝基苯酚阴离子的酶量。
术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”在本文中定义为α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶 (alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase activity)(EC 3.2.1.139)，其 /[崔化 α-D-葡糖苷酸水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根据 de Vries，1998，J. Bacteriol. 180 :243-249确定的。一个单位的α -葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40°C每分钟释放出Iymol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。
术语“ α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶”在本文中定义为α _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3. 2. 1. 55)，其催化对α _L_阿拉伯糖苷中的末端非还原性α _L_阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α _L_阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。 就本发明而言，α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200 μ 1的每ml的IOOmM乙酸纳pH 5中5mg的中等粘性小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland, Ltd.， Bray, Co. fficklow)在 40 "C 进行 30 分钟，接着通过 AMINEX HPX-87H 柱层析(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
术语“家族3”、“家族5”、“家族6”、“家族7”、“家族10”、“家族11”、“家族61”、 “ GH3 ”、“ GH5 ”、“ GH6 ”、“ GH7 ”、“ GHl O ”、“ GHl 1”、“ GH61”、“ Ce 13 ”、“ Ce 15 ”、“ Ce 16 ” 或 “ Ce 17 ” 在本文中定义为根据 Henrissat B·, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280 :309-316,及 Henrissat B.禾口 Bairoch Α. ,1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696 属于糖苷水解酶家族 3、5、6、7、10、11 和 61 的多肽。
纤维素材料在本文中定义为任何含有纤维素的材料。生物质初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链 β -(1-4) -D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、 阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel 等，1995，于 Handbook on Bioethanol (CharlesE. Wyman 编),pp. 105-118, Taylor&Francis, Washington D. C. ；ffyman,1994, Bioresource Technology 50 :3-16 ；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 695-719 ;Mosier 等，，1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper 主编，Volume 65, pp. 23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。 在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。 在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面， 纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的传统方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。术语“经预处理的玉米秸秆”或“PCS”在本文中定义为经过一种或多种预处理步骤的源自玉米秸秆的纤维素材料。术语“变体”在本文中定义为具有生物活性的酶或多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用另一个氨基酸替代占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；而插入意指在占据一个位置的氨基酸邻接处添加一个或多个(几个)氨基酸例如1-5个氨基酸。术语“野生型”酶在本文中定义为由天然出现的微生物如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌所表达的酶。术语“亲本酶”在本文中定义为对其进行修饰，例如取代、插入、缺失和/或截短， 以产生本公开的酶变体的酶，如感兴趣的酶。该术语亦指变体可与之相比较和比对的多肽。 所述亲本可为天然出现的(野生型)多肽或变体。例如，所述亲本蛋白可为氨基酸序列受修饰或改变的天然出现的多肽的变体。亲本亦可为等位变体，其为由占据相同染色体座的基因的两种或更多种可选形式所编码的多肽。术语“分离的多肽”在本文中定义为从来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少 20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少
90% 纯。术语“基本上纯的多肽”在本文中定义为多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0.5%，并且甚至最优选至多0%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少90%纯，优选至少92%纯，优选至少94 %纯，更优选至少95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯，更优选至少98 % 纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99. 5%纯，并且甚至最优选100%纯。所述多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即， 所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如， 这能够通过以下实现通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种成熟多肽(即，具有不同的C端和 /或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10 :1_6)来预测。
术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)来预测。
参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends Genet. 16 :276-277)的Needle程序(优选3. 0. 0版或更高版本)中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty) 10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下
(同样的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,见上文)的Needle程序(优选3· 0· 0版或更高版本)中执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下
(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
术语“多肽片段”在本文中定义为从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。
术语“亚序列(subsequence) ”在本文中定义为从成熟编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸，其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。
术语“等位变体”在本文中定义为占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
术语“分离的多核苷酸”在本文中定义为从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10% 纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯， 并且最优选至少90%纯。
术语“基本上纯的多核苷酸”在本文中定义为不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少 99%，最优选至少99. 5%纯，并且甚至最优选至少100%纯的。优选所述多核苷酸是“基本上纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
术语“编码序列”在本文中定义为直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成或重组多核苷酸。
术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的 mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
术语“核酸构建体”在本文中定义为单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
术语“调控序列”在本文定义为对编码多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
术语“可操作地连接”在本文中定义为这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
术语“表达”在本文中定义为涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。术语“宿主细胞”在本文中定义为任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞的后代。术语“改善的性质”在本文中定义为与变体或突变体酶或多肽相关的特征，其与亲本或未突变的酶或多肽相比经改善。此类改善的性质包括但不限于增强的纤维素分解活性，改变的温度依存性活性概貌，热稳定性，PH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性， 产物稳定性，产物活性和/或化学稳定性。术语“多肽”在本文中定义为数个通过肽键连接在一起的氨基酸。多肽的非限定性实例包括多肽片段，大蛋白，小蛋白，和蛋白部分。术语“改善的产物特异性”在本文中定义为相对于亲本呈现改变的产物概貌的变体酶或多肽，其中所述改变的产物概貌改善了所述变体或多肽相对于亲本在给定应用中的性能。术语“产物概貌”在本文中定义为由酶水解产生的反应产物的化学组成。术语“突变体”在本文中定义为发生突变的生物体。术语“突变体酶”在本文中定义为来源于突变体的酶，其中将来自亲本细胞的同一酶与所述突变体酶相比时，所述突变体酶具有改变。术语“模块”在本文中定义为在系统中实现完善定义的任务的智能成分。术语“例如(e. g.) ” 一般指拉丁语短语exempli gratia的缩写。如用于本文中， “e.g. ”指一个或多个非限定性实例。所谓该术语是非限定性的，是指例示的对象并不限于提供的具体实例的范围。术语“如”用于本文中一般指一个或多个非限定性实例。本公开的这些和其他方面参照下述具体描述会是显而易见的。


图IA是显示本公开的系统的一个实施方案的图示；图IB是显示本公开的系统中的读板器模块的一个实施方案的图示。图2是显示几种3. 8 μ M FB28的稀释系列在360nm处的激发之后在460nm处的顶部读取所收集的荧光发射的图的图像表示。图3A是显示在80 μ 1体积的UV可传递微滴定板中在360nm处激发测得的荧光谱的图的图像表示。图3B是显示用8 μ M荧光增亮剂28在100 μ 1的体积的UV可传递微滴定板中在360nm处激发测得的荧光谱的图的图像表示。图3C是显示以80 μ 1体积收集的经预处理的玉米秸秆的吸光度谱的图像表示。图3D是显示80 μ 1体积的商业性木质素的吸光度谱的图像表示。图4是显示当将荧光指示剂成分添加至经水解的PCS样品时，荧光强度相对于葡萄糖释放的图的图像表示。图5A是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-A样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5A包括添加酶所得的值。图5B是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-A样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5B排除了来自未添加酶的生物质的值。图5C是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5C包括了添加酶所得的值。图5D是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5D排除了来自未添加酶的生物质的值。图5E是显示经HPLC测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-B样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5E包括了添加酶所得的值。图5F是显示经HPLC 测量的释放的葡萄糖和相应的使用PCS-C样品的荧光发射强度的图的图像表示。图5F排除了来自未添加酶的生物质的值。
图6A是显示在添加和不添加200 μ M指示剂成分时，多个对PCS-A和PCS-B的水解反应中葡萄糖浓度对酶加载的图的图像表示。图6Β是显示使用指示剂成分的水解与不使用指示剂成分的水解之间的偏差的图的图像表示。
图7是显示当通过加载指示量的纤维素酶(mg/g纤维素)将含200 μ MFB28的5% PCS-A在50°C水解超过72小时时标准化的荧光发射对时间(h)的图的图像表示。误差棒显示一标准偏差。
图8是显示分别含4、16和204 μ M FB28的1 %、3%和5% PCS-A，在50°C通过添加不同量的根据W02008/151079获得的里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素分解蛋白组合物(包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和米曲霉葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉菌株RutC30培养液)水解超过72小时的图的图像表示。释放的葡萄糖通过HPLC 测量，而纤维素转化是基于5%总固形物处的最大葡萄糖释放。
图9A是显示当用3% PCS和150 μ M FB^在COSTAR 3364平板中使用300 μ 1 反应物在50°C将PCS-A水解72小时时，估计的转化率(％)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。图9B是显示实际转化率(％ )对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示，其中实际转化率是基于来自图9A中的反应物通过HPLC测量的葡萄糖和纤维二糖。
图IOA是显示本公开的一个实施方案的分析的直方图的图像表示，其中显示了 5mg/g纤维素的加载在内侧、外侧和边缘孔中估计的转化率。图IOB是显示本公开的一个实施方案的分析的直方图的图像表示，其中显示了 8mg/g纤维素的加载在内侧、外侧和边缘孔中估计的转化率。注意RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
图11是显示存在(+)或不存在(_) 150 μ M FB28时在用第一组酶在50°C水解72 小时的3% PCS-A反应物中实际转化率(％)对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。实际转化率由葡萄糖和纤维二糖的HPLC测量来计算。实际转化率根据葡萄糖和纤维二糖的 HPLC测量来计算。图11显示了存在FB^ (实线，实心符号)和不存在FB^ (虚线，空心符号)时的不同组的酶。
图12是显示使用多种模型时转化率(％ )对不同酶的直方图的图像表示。显示了实际HPLC测量的纤维素至葡萄糖和纤维二糖的转化率与来自荧光发射强度测量的模型的比较。注意RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
图13A是显示在两个不同PCS-A批次的72小时水解之后，估计的转化率(％ )对 HPLC测量的转化率(％ )的图的图像表示。图1 是显示作为某些剂量的放大而作图的估计的转化率(％ )对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。图13C是显示作为某些剂量的放大而作图的估计的转化率(％ )对加载(mg/g纤维素)的图的图像表示。
具体实施方式
已发现添加一种或多种结合于、染色或增亮纤维素的指示剂成分，如增亮剂或荧光指示剂化合物，有效地最大化或增加对于纤维素水解的速率，可以此速率衡量感兴趣的酶或多肽如野生型、突变体、变体和/或重组酶。此外，已发现依照本公开的方法可以在高通量测定法中实施。这节约了时间，并提供了一种或多种感兴趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物的纤维素分解活性和/或纤维素分解增强活性的准确指标。本公开的方法可用于测试大量多肽和/或酶样品(含有一种或多种感兴趣的酶和/ 或多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物)，例如对指定的生物质样品具有已知的蛋白浓度的。例如，可有效地衡量来自诱变文库、野生型筛选和/或发酵运行的感兴趣的酶和/或多肽样品。依照本公开的合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4-β-葡聚糖酶，突变的外-1， 4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和/或变体外纤维二糖水解酶，变体内-1， 4- β -葡聚糖酶，变体外-1，4- β -葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。感兴趣的酶亦可包括酶混合物如前述感兴趣的酶的组合。感兴趣的多肽的非限定性实例包括一种或多种根据 Henrissat B.,1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino—acid sequence similarities, Biochem. J. 280 :309-316,以及 Henrissat 禾口 Bairoch,1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696属于糖基水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。认为可分析多肽和酶的混合物，例如可依照本公开对突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4-β-葡聚糖酶， 突变的外-1，4-β葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶和具有纤维素分解增强活性的GH61多肽进行本测定法。不拘于本公开，认为当一种或多种指示剂成分如荧光指示剂化合物接触纤维素时，所述指示剂成分结合于或染色所述纤维素。例如，染色是在适于促进给定指示剂化合物如荧光指示剂化合物结合于纤维素的条件下进行的。认为染色步骤是有效的，因为指示剂成分如荧光指示剂化合物或染料特异性结合于纤维素的能力，凸显(highlight)纤维素与残余的反应介质和其中的其他成分的反差。尽管最小的背景凸显可不至于破坏依照本公开的方法的准确性，背景凸显(由相同或类似的指示剂成分导致)是不优选的，并应最小化或避免。不拘于本公开，认为染色或结合步骤使用所述指示剂成分和纤维素成分之间的部分的可能的相互作用。这些相互作用可包括离子键、共价键和疏水键。所述结合或染色允许在纤维素水解之后，残余的纤维素更容易观察到/测量。在实施方案中，来自指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号的强度可用于指示一种或多种感兴趣的酶的质量参数。质量参数的非限定性实例包括一种或多种感兴趣的酶的性质，一种或多种感兴趣的酶的产物特异性，一种或多种感兴趣的酶的改善的产物特异性和/或改善的性质。在实施方案中，来自指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号的强度可用于指示一种或多种感兴趣的多肽的质量参数。在实施方案中，所需的来自结合的指示剂成分如荧光指示剂化合物的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素分解。例如，信号如光信号可在一个样品中比另一个更明亮，指示更多纤维素存在于较明亮的样品中。此种指示警示本领域技术人员在较明亮的样品中的水解不如暗淡的(dull)或较不明亮的样品有效或完全。
因此，本公开除了其他方法之外，还提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和检测来自所述指示剂成分如荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。
此外，本公开除了其他方法之外，还提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料(例如木素纤维素)与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素)；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由酶水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶，单独或与感兴趣的多肽组合而水解的纤维素的量。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶，单独或与一种或多种感兴趣的多肽组合。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/ 或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分或荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶，单独或与一种或多种感兴趣的多肽组I=I ο
在实施方案中，本公开提供了分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法，包括下述步骤在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的生物质；和检测来自所述指示剂成分的信号， 其中所述信号的强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。在实施方案中，所述反应介质含有一种或多种感兴趣的酶， 单独或与一种或多种感兴趣的多肽组合。
在实施方案中，本公开提供了分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法，包括下述步骤(a)将生物质与指示剂成分如荧光化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述指示剂成分的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，所述方法包括下述步骤(a)将生物质与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。这些方法还可包括提供感兴趣的多肽的步骤。合适的感兴趣的酶的非限定性实例包括选自下组的酶(a)野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1，4_β -葡聚糖酶，突变的外-1， 4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外纤维二糖水解酶，变体内-1， 4- β -葡聚糖酶，变体外-1，4- β -葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。感兴趣的酶的其他非限定性实例包括这些野生型、突变体或变体酶的组合。感兴趣的多肽亦可通过这些方法衡量。此外，这些方法亦可包括添加感兴趣的多肽如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的步骤。在实施方案中，本公开提供了分析酶和/或多肽性能的方法，包括下述步骤(a) 将纤维素材料(例如木素纤维素材料)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c) 在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料(例如木素纤维素材料)；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由反应介质成分如酶和/或多肽成分水解的纤维素的量。酶性能的非限定性实例包括在木素纤维素水解中纤维素衰变的指标。合适的酶的非限定性实例包括选自下组的酶(a)野生型外纤维二糖水解酶，野生型内-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1， 4- β -葡糖苷酶，野生型纤维二糖酶或其组合；(b)突变的外纤维二糖水解酶，突变的内-1， 4-β-葡聚糖酶，突变的外-1，4-β-葡糖苷酶，突变的纤维二糖酶或其组合；和(c)变体外纤维二糖水解酶，变体内-1，4- β -葡聚糖酶，变体外-1，4- β -葡糖苷酶，变体纤维二糖酶或其组合。认为感兴趣的肽和/或肽片段对于依照本公开的分析是合适的感兴趣的组合物。在实施方案中，本公开提供了分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤在含有指示剂成分如荧光指示剂化合物的反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的生物质；和检测来自荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。在实施方案中，本公开提供了分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(C)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解所述生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数。此类方法可在系统中进行。
在实施方案中，本公开提供了确定感兴趣的酶或多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(C)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和(d)确定所述水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，感兴趣的多肽的纤维素分解增强活性，和/或由所述感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了分析纤维素材料(例如木素纤维素材料如玉米秸秆)水解中的纤维素衰变的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料(例如木素纤维素材料)与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合于纤维素的条件下水解所述含有纤维素的纤维素材料；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽水解的纤维素的量。
在实施方案中，本公开提供了用于衡量酶性能的系统，所述系统包含至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含至少一个用于下述的孔(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/ 或多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含有纤维素的纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由含有任何感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质水解的纤维素的量。在一个系统实施方案中，检测器位于反应介质之下，并位于反应容器所处于的平板之下。
在实施方案中，本公开提供了用于衡量酶性能的系统，所述系统包含至少一个反应区，其中所述反应区用于分析纤维素材料(例如木素纤维素)水解中的纤维素衰变，所述反应区包含至少一个用于下述的孔在含有指示剂成分的反应介质中在所述指示剂成分如荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由含有任何感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质水解的纤维素的量。在实施方案中，下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分如荧光指示剂化合物相接触以形成混合物； (b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触，发生在水解之前。然而，在实施方案中，涵盖了可在水解完全之后添加指示剂成分。
指示剂成分
在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解中以结合或染色水解反应介质中的纤维素。所述反应介质可含有待分析的一种或多种感兴趣的酶和/或多肽，酶混合物，多肽混合物和/或酶和多肽的混合物。在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解以指示一种或多种感兴趣的酶和/或多肽的质量参数。最优地，仅纤维素凸显于反应介质中，而指示剂化合物不凸显其他反应介质成分。然而，在实施方案中，主要是纤维素凸显于反应介质中，而少量其他成分亦由指示剂化合物凸显。应避免除了纤维素之外的反应混合物的成分的背景凸显，然而少量除了纤维素之外的其他成分的背景凸显并不会使得本公开的方法不准确。依照本公开合适的指示剂成分的非限定性实例包括苯和联苯的苯乙烯衍生物，芪衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉或其混合物。这些指示剂成分可直接添加至水解中，或通过首先将纤维素材料如木素纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物。然后可将该混合物与含有感兴趣的酶和/或多肽的反应介质相接触。在指示剂成分存在的情况下进行水解，如例如在反应介质中在所述指示剂成分会染色或结合纤维素的条件下水解含有纤维素的纤维素材料或木素纤维素材料。依照本公开使用所述指示剂成分，则来自剩余纤维素的信号可高至或强至来自未与依照本公开的指示剂成分接触的剩余纤维素的信号的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8 倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍，至少 1000倍，或至少10，000倍。此外，剩余纤维素的指标可变佳或改善至未与依照本公开的指示剂成分接触的水解反应的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍， 至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍， 至少1000倍，或至少10，000倍。例如，所述指标的改善可体现在较短时间进行测定。在实施方案中，依照本公开的方法将一种或多种指示剂成分以有效量添加至纤维素水解以指示水解中一种或多种感兴趣的酶和/或多肽的质量参数。因此，本公开的方法适于酶和/或多肽购买者检查例如产物稳定性和/或酶活性。而且，生产商可就品质保障目的来检查产物稳定性和活性。在实施方案中，依照本公开的方法包括依照本公开以足以凸显纤维素的量添加一种或多种荧光指示剂成分。在实施方案中，以足以使反应介质中的纤维素发荧光或凸显的量添加荧光指示剂成分。供依照本公开使用的合适的荧光指示剂成分的非限定性实例包括苯和联苯的苯乙烯衍生物，芪衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素， 2-羟喹啉或其混合物。这些化合物的许多化学结构示于并描述于Harold J. McElhone的 Fluorescent Whitening Agents， Kirk-Qthmer Encyclopedia of Chemical Technology， 1994 (通过全文提述并入本文)。合适的芪衍生物的非限定性实例包括4，4’ - 二氨基芪_2，2’ - 二磺酸(4， 4' -diaminostilbene-2,2 ‘ -disulfonic acid)的双三嗪基(bistriazinyl)衍生物。 其他芪衍生物包括对硝基甲苯邻磺酸(p-nitro toluene ortho-sulfonic acid)和4， 4，- 二硝基芪 _2，2，- 二磺酸 4 ' -dinitro stilibene 2. 2 ‘ disulfonic acid)。 在实施方案中，二氨基芪类(diaminostilbenes)适于用作供依照本公开使用的荧光指示剂成分。二氨基芪类的非限定性实例包括4，4’ - 二 [4-苯胺基-6-二乙基) 氨基-S-三嗪-2-基氨基]-2，2，- 二磺酸(4,4 ‘ -bis[4-anilino-6-bis(2-ethyl) amino-s-triazin-2-ylamino]-2,2' -disulfonic acid)(焚光i曾亮齐[J 28 或 Calcofluor White M2R牌增亮剂，可从SIGMA-ALDRICH 获得)，和/或BLANK0PH0R 牌增亮剂。4，4，-二 [4-苯胺基-6-二乙基)氨基_s_三嗪_2_基氨基]_2，2，-二磺酸可从SIGMA-ALDRICH 获得，并具有如下所示的化学结构。
权利要求
1.一种分析纤维素材料水解中纤维素的衰变的方法，包括在含有指示剂成分的反应介质中在指示剂成分会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的纤维素材料；和检测来自所述指示剂成分的信号，其中所述信号的强度指示由感兴趣的酶水解的纤维素的量。
2.权利要求1的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
3.权利要求1或2的方法，其中所述指示剂成分是荧光指示剂化合物，包括荧光团，高波长荧光团，苯和联苯的苯乙烯基衍生物，芪(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羟喹啉(carbostyril)，或二氨基芪或其混合物。
4.权利要求1或2的方法，其中所述指示剂成分是4，4’_二 [4-苯胺基-6-二 O-乙基)氨基-S-三嗪-2-基氨基]_2，2，- 二磺酸。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述感兴趣的酶包含一种或多种(几种)选自下组的酶纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
6.权利要求1-5任一项的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料与指示剂成分相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的多肽的反应介质相接触。
7.权利要求6的方法，其中所述多肽是具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
8.一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤在含有荧光指示剂化合物的反应介质中在所述荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
9.权利要求10的方法，在水解之前进一步包括下述步骤(a)将纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；和(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶的反应介质相接触。
10.一种分析感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的高通量方法，包括下述步骤(a)将生物质与荧光化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中信号强度预示生物质水解中感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的质量参数，且其中所述反应混合物配置于包含至少两个孔的多孔板。
11.一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽的反应介质相接触；(C)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)确定水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和/或感兴趣的多肽影响纤维素水解。
12.—种分析酶性能的方法，所述方法包括下述步骤(a)将木素纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解含纤维素的木素纤维素材料；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由所述酶水解的纤维素的量。
13.一种分析生物质水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤(a)将生物质与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解所述含有纤维素的生物质；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示生物质水解中感兴趣的酶的质量参数。
14.一种确定感兴趣的酶是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤(a)将纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与适于纤维素水解的含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会改变纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解所述纤维素材料；和(d)确定所述水解反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶水解的纤维素的量。
15.一种分析木素纤维素水解中纤维素衰变的方法，包括下述步骤(a)将木素纤维素与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会结合纤维素的条件下水解含有纤维素的玉米秸秆；和(d)检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由所述酶水解的纤维素的量。
16.一种用于衡量酶性能的系统，包含至少一个反应区，其中所述反应区用于分析木素纤维素水解中的纤维素衰变，所述反应区包含至少一个用于下述的孔(a)将木素纤维素材料与荧光指示剂化合物相接触以形成混合物；(b)在步骤(a)同时或之后将所述混合物与含有感兴趣的酶的反应介质相接触；(c)在反应介质中在所述荧光指示剂化合物会使得纤维素染色的条件下水解所述含有纤维素的木素纤维素材料；和至少一个检测器，其适于检测来自所述荧光指示剂化合物的信号，其中所述信号的强度指示由所述酶水解的纤维素的量。
17.—种标准化用于确定生物样品中目标纤维素的量的方法的方法，包括下述步骤(a)在反应体积中测量样品中目标纤维素的荧光强度；(b)确定不添加酶的底物的水解的平均荧光强度；和(c)通过将目标纤维素的荧光强度从未添加酶的水解反应的平均强度减去来标准化目标纤维素测量。
18.—种标准化荧光强度数据的方法，所述方法包括下述步骤(a)确定不添加酶的 PCS水解反应的平均荧光强度；和(b)使用步骤(a)中确定的荧光强度标准化一种或多种第二水解反应的荧光强度。
19.一种确定感兴趣的酶和感兴趣的多肽是否影响纤维素水解的方法，包括下述步骤在含有荧光指示剂化合物的反应介质中在荧光指示剂化合物会影响纤维素并产生指示纤维素存在的光信号的条件下水解纤维素材料；和确定水解的反应物是否具有所需的光信号，其中所述所需的光信号指示感兴趣的酶和感兴趣的多肽的纤维素分解活性，和/或由所述感兴趣的酶和感兴趣的多肽水解的纤维素的量。
全文摘要
通过使用指示剂成分如荧光剂在纤维素材料水解过程中衡量感兴趣的酶和/或多肽和/或混合物，导致酶和/或多肽的有效的高通量分析。还公开了用于除了分析其他之外，分析经预处理的玉米秸秆(PCS)水解的高通量测定。
文档编号G01N33/50GK102498401SQ201080041334
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月13日 优先权日2009年7月17日
发明者K.麦克法兰, M.马尔滕 申请人:诺维信公司