专利名称：负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种电极的制备方法，尤其涉及一种负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法。
背景技术：
如图4所示反映了血糖检测过程由化学反应转化为电信号的基本过程，原理是由含有葡萄糖分子的反应液(如唾液、血液等体液)在葡萄糖反应酶(如己糖激酶、葡萄糖氧化酶)的催化下进行化学分解反应，从而释放出带电粒子(如氢氧根离子、氢离子及电子)，带电粒子通过电极及连接电极的导线将带电粒子传输到电信号检测系统，根据所产生的电流大小判断反应强度，反应强度大则反应剧烈，葡萄糖含量就高；反之亦然。现有技术中，酶层主要采用在电极上直接涂布反应液的办法，即直接将葡萄糖反 应酶溶液涂在电极表面，为提高反应酶的附着强度，一般是将饱和葡萄糖反应酶溶液制成易于涂布的具有一定粘性的溶液，利用高速旋涂设备，在电极表面进行多次喷洒式旋涂。或利用丝网印刷的方式，在电极表面进行多次涂布。无论是旋涂或丝网印刷，其电极修饰均需要进行多次操作，无法用一道工序一次性完成。葡萄糖反应酶溶液无论其溶解度有多高，反应酶都是不规则的分散在溶液中的，因此涂布到电极表面以后将形成反应酶的不均匀分布，而且每个分布点的酶含量较低。葡萄糖反应酶在电极表面很难形成堆叠结构，即在某一反应点只有少量反应酶存在，在葡萄糖分解反应中很容易被消耗殆尽，该点反应进行完毕后，局部虽然形成了葡萄糖的低浓度区，葡萄糖分子会向这一反应区渗透，但由于反应酶没有可补偿性，改点不在具有反应酶，因此反应没有持续性。导致产生的电流小，且持续时间短，难于检测判断。

发明内容
本发明针对以上问题，而提出的一种负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，具有如下步骤SI.采用气泡液膜法，制得Fe3O4铁氧体的前躯体；S2.将所述铁氧体的前驱体，置于容器内200-250摄氏度烧结10_12h，制得固结铁氧体纳米粉体；S3.将己糖激酶、乙醇、水、SiO2纳米颗粒以及由步骤S2制得的铁氧体纳米粉体按一定比例投入反应容器中，在室温下，回流搅拌20-30分钟时间，使己糖激酶水解生成透明溶胶，将该溶胶转入模具中，恒温水浴，在恒温条件下烘干、研磨，制得负载有己糖激酶的纳米微球；S4.将步骤S3中制得的纳米微球，与25%乙醇溶液以摩尔比1:20—1:30配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入适量5%—10%的分析纯氨水，继续搅拌0. 5h-lh，待所述胶体在常温陈化一段时间l-2h后，制成纳米颗粒溶胶；
S5.取一清洗过的电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为6cm / min 8cm/min,提拉结束后,将所述基底静置6-12h后,制得涂膜基片；S6.将所述纳米颗粒、浓度为10%_15%的甲苯溶液、水按一定摩尔比配置成PH值为
7.8-8. 5的混合溶液，比例为每IL水加入50g纳米颗粒，IOOml甲苯溶液，将步骤S5中制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件5000-10000高斯下反应一段时间0. 5h-lh，制得负载有多层带酶微球电极。所述步骤2中向反应器中投入的反应物的比例为每IL去离子水加入己糖激酶10g，乙醇100_150ml，投入的己糖激酶与Si02纳米颗粒的质量比为1:1.5-1:2. 5，投入的铁氧体纳米粉体与Si02纳米颗粒的质量比为1:1-1:1. 5。步骤S2中的烧结时间为10小时；烧结温度为210°C。步骤4中所述纳米微球与25%乙醇溶液以摩尔比1:20配置成混合溶液。步骤4中加入适量的分析纯氨水的浓度为5%。步骤S5中基底的静置时间为8小时。 步骤S6中，甲苯溶液的浓度为10%。步骤S6中，施加水平磁场为6000-8000高斯。由于采用了上述技术方案，本发明提供的负载有己糖激酶的磁性纳米微球，具有如下优点I.反应效率提高，带酶层的纳米粒子反应体系由于纳米表面呈球状，比表面积远大于平面结构，单位体积内可以负载更多的反应酶，使得反应效率更高，反应强度更大。2.自组装形成的纳米颗粒堆砌结构，使得区域内葡萄糖反应更为彻底，可以产生的更大强度的生物电流。3.堆砌结构的纳米微粒体系，使得反应时间较传统方法更为持久，可以提供更大、更持久的电流，使得电流检测精度更高。4.由于更大的电流，产生电流的时间更持久，因此本技术可以用于检测浓度更低的葡萄糖溶液。如传统检测技术仅能应用于血液，本技术可用于葡萄糖浓度远低于血液的唾液(唾糖含量仅为血糖含量的1%)中葡萄糖含量的检测。


为了更清楚的说明本发明的实施例或现有技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I为本发明实施例一的SEM图像图2为本发明实施例二的SEM图像图3为本发明实施例三的SEM图像图4为唾糖检测的原理示意5为依照本发明所述方法制得的电极反应体系示意图
具体实施例方式为使本发明的实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述实例I :将通过气泡液膜法和共沉积反应制备Fe3O4铁氧体的前躯体置于容器内210摄氏度烧结10h，制得固结铁氧体纳米粉体。将Ig己糖激酶、IOml乙醇、IOOml去离子水、I. 5gSiO2纳米颗粒、I. 5g铁氧体纳米粉体投入三颈瓶中，在20摄氏度温度下，回流搅拌30分钟时间，使己糖激酶水解生成透明溶胶，将该溶胶转入PVC模具中，在25摄氏度温度下，恒温水浴2小时，在42. 5°C恒温条件下烘干、研磨，制得负载有己糖激酶的纳米微球。将得到的纳米微球，与25%乙醇溶液以1:20的摩尔比配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入5%的分析纯氨水，继续搅拌lh，待所述胶体在常温陈 化一段时间Ih后，得到纳米颗粒溶胶；取一清洗过的电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为6cm / min，提拉结束后，将所述基底静置8h后，制得涂膜基片；2. 5g纳米颗粒、5ml浓度为10%的甲苯溶液、50ml去离子水按配置成PH值为7. 8的混合溶液，将制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件8000高斯下反应一段时间0. 5h，制得负载有多层带酶微球电极，制得的电极如图I所示。实施例2将通过气泡液膜法和共沉积反应制备Fe3O4铁氧体的前躯体置于容器内210摄氏度烧结10h，制得固结铁氧体纳米粉体。将Ig己糖激酶、IOml乙醇、IOOml去离子水、2. 5gSiO2纳米颗粒、2. 5g铁氧体纳米粉体投入三颈瓶中，在25摄氏度温度下，回流搅拌20分钟时间，使己糖激酶水解生成透明溶胶，将该溶胶转入PVC模具中，在25摄氏度温度下，恒温水浴2小时，在40°C恒温条件下烘干、研磨，制得负载有己糖激酶的纳米微球。将得到的纳米微球，与25%乙醇溶液以1:20的摩尔比配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入5%的分析纯氨水，继续搅拌lh，待所述胶体在常温陈化一段时间Ih后，得到纳米颗粒溶胶；取一清洗过的电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为8cm / min，提拉结束后，将所述基底静置8h后，制得涂膜基片；2. 5g纳米颗粒、5ml浓度为10%的甲苯溶液、50ml去离子水按配置成PH值为8. I的混合溶液，将制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件6000高斯下反应一段时间lh，制得负载有多层带酶微球电极。图2为制得的带酶微球电极的SEM图像。实例3 将通过气泡液膜法和共沉积反应制备Fe3O4铁氧体的前躯体置于容器内220摄氏度烧结12h，制得固结铁氧体纳米粉体。将Ig己糖激酶、IOml乙醇、IOOml去离子水、I. 5gSiO2纳米颗粒、I. 5g铁氧体纳米粉体投入三颈瓶中，在20摄氏度温度下，回流搅拌30分钟时间，使己糖激酶水解生成透明溶胶，将该溶胶转入PVC模具中，在25摄氏度温度下，恒温水浴2小时，在40°C恒温条件下烘干、研磨，制得负载有己糖激酶的纳米微球。将得到的纳米微球，与25%乙醇溶液以1:20的摩尔比配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入5%的分析纯氨水，继续搅拌lh，待所述胶体在常温陈化一段时间Ih后，得到纳米颗粒溶胶；取一清洗过的电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为6.5cm / min，提拉结束后，将所述基底静置8h后，制得涂膜基片；2. 5g纳米颗粒、5ml浓度为10%的甲苯溶液、50ml去离子水按配置成PH值为8. 2的混合溶液，将制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件7000高斯下反应一段时间0. 5h，制得负载有多层带酶微球电极，如图3所示。由本发明所述方法所制成的具有合理堆砌结构的电极反应体系中，在某一区域首先由处在该区域的葡萄糖在反应酶的催化下反应，释放出带电粒子。由于反应该区域形成葡萄糖的低浓度区，反应液中的葡萄糖由于扩散原理向低浓度区不断扩散，在耗尽首层的全部反应酶后，可以通过堆砌微粒的缝隙(葡萄糖分子尺寸原小于纳米颗粒尺寸)向下层渗透，在下层纳米颗粒表面反应酶的催化下继续反应，再次形成低浓度区，从而不断重复首层反应区域内实现的反应，直至最下层。此反应体系远优于传统技术中单层酶结构的电极，可以最大限度提高反应效率，并提高持续稳定的电流输出。如图5所示。 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，具有如下步骤 51.采用气泡液膜法，制得Fe3O4铁氧体的前躯体； 52.将所述铁氧体的前驱体，置于容器内200-250摄氏度烧结10-12h，制得固结铁氧体纳米粉体； 53.将己糖激酶、乙醇、水、SiO2纳米颗粒以及由步骤S2制得的铁氧体纳米粉体按一定比例投入反应容器中，在室温下，回流搅拌20-30分钟时间，使己糖激酶水解生成透明溶胶，将该溶胶转入模具中，恒温水浴，在恒温条件下烘干、研磨，制得负载有己糖激酶的纳米微球； 54.将步骤S3中制得的纳米微球，与25%乙醇溶液以摩尔比1:20—1:30配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入适量5%-10%的分析纯氨水，继续搅拌0. 5h-lh，待所述胶体在常温陈化一段时间l-2h后，制成纳米颗粒溶胶； 55.取一清洗过的电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为6cm / min 8cm/min,提拉结束后,将所述基底静置6-12h后,制得涂月吴基片； 56.将所述纳米颗粒、浓度为10%-15%的甲苯溶液、水按一定摩尔比配置成PH值为7. 8-8. 5的混合溶液，比例为每IL水加入50g纳米颗粒，IOOml甲苯溶液，将步骤S5中制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件5000-10000高斯下反应一段时间0. 5h-lh，制得负载有多层带酶微球电极。
所述步骤2中向反应器中投入的反应物的比例为 每IL去离子水加入己糖激酶10g，乙醇100-150ml， 投入的己糖激酶与SiO2纳米颗粒的质量比为I: I. 5-1:2. 5， 投入的铁氧体纳米粉体与SiO2纳米颗粒的质量比为1:1-1:1. 5。
2.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于步骤S2中的烧结时间为10小时；烧结温度为210°C。
3.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于所述步骤4中所述纳米微球与25%乙醇溶液以摩尔比1:20配置成混合溶液。
4.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于所述步骤4中加入适量的分析纯氨水的浓度为5%。
5.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于所述步骤S5中基底的静置时间为8小时。
6.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于所述步骤S6中，甲苯溶液的浓度为10%。
7.根据权利要求I所述的负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极的制备方法，其特征还在于所述步骤S6中，施加水平磁场为6000-8000高斯。
8.一种负载有多层己糖激酶磁性纳米微球的电极，具有 位于电极最下方的衬底， 由权利要求I所述方法制得的涂膜基片，覆盖在所述衬底的上方， 位于所述涂膜基片上方，由多层纳米微球堆砌而成的酶反应层， 所述酶反应层中的纳米微球通过磁力相互吸引固定。
全文摘要
本发明公开了一种负载有己糖激酶的磁性纳米微球的电极的制备方法，具有如下步骤将纳米微球，与25%乙醇溶液以摩尔比1:20—1:30配置成混合溶液，在室温下电磁搅拌至完全溶解；将溶解体系转移至冰水浴中，加入适量5%-10%的分析纯氨水，继续搅拌0.5h-1h，待所述胶体在常温陈化一段时间1-2h后，制成纳米颗粒溶胶；取电极基底，运用提拉法，将所述制得的纳米颗粒溶胶，在电极基地上进行涂抹，提拉速度为6cm／min~8cm/min，提拉静置后制得涂膜基片；将所述纳米颗粒、甲苯溶液、水按一定摩尔比配置成混合溶液，将制得的涂膜基片竖直浸入盛有混合溶液的反应器，给反应器施加一个水平的磁场，在磁场条件5000-10000高斯下反应一段时间0.5h-1h，制得负载有多层带酶微球电极。
文档编号G01N27/327GK102749375SQ20121024395
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者张勐, 肖红梅, 鲍文生 申请人:苏州文曦医疗电子有限公司