专利名称：一种治疗骨质增生的中药组合物的指纹图谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂的质量检测方法，具体涉及一种治疗骨质增生的中药组合物的指纹图谱检测方法。
背景技术：
本发明涉及的中药组合物胶囊收载于《中国药典》(2010版)一部“成方制剂和单方制剂”中，该组合物处方由熟地黄175重量份、鸡血藤117重量份、肉苁蓉(蒸)117重量份、莱菔子(炒)58重量份、狗脊(盐制)117重量份、骨碎补117重量份、女贞子(盐制)58重量份、牛膝117重量份和淫羊藿117重量份九味药制成，具有补腰肾、强筋骨、活血止痛等功效，现代临床用于治疗增生性脊椎炎、颈椎综合症、骨刺等疾病。目前药典中关于该中药组合物胶囊的质量控制主要包括鉴别和含量测定两方面。其中鉴别项使用显微镜观察法和薄层色谱法，分别鉴定熟地黄、狗脊、牛膝和淫羊藿四种药材。含量测定项使用高效液相法测定淫羊藿中淫羊藿苷的含量。从处方组成可以发现，该中 药组合物胶囊共由九味中药制成，但药典中仅采用显微镜观察法、薄层色谱法鉴定药材和高效液相色谱法检测一味中药中指标性成分的含量，以此来控制整个中药组合物的质量，显然是不够全面的。近年来，中药指纹图谱技术已日渐成熟，能够很好的控制药品的质量，保证药品的有效性和质量可控性，已经成为一种业内公认的、可靠的、高效的技术手段，是中药质量控制的发展趋势。因此为了更全面、有效的控制该中药组合物的质量，提高其质量控制水平，和国际接轨，让临床用药安全及疗效更加有所保证，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出一种能客观、准确，全面检测该中药组合物质量的指纹图谱测定方法。

发明内容
发明目的本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种精密度高，重复性和稳定性好，能客观、全面、准确的评价中药组合物质量的指纹图谱检测方法，能更有效的保证成品的质量，对控制中药组合物的质量具有重要作用。技术方案为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为一种治疗骨质增生的中药组合物的指纹图谱检测方法，该方法包括以下步骤(I)供试品溶液的制备取中药组合物，将内容物混匀，研细，精密称定0. 5至2g,加40 60%甲醇20 30mL，超声提取30至60min，过滤，取续滤液作为供试品溶液；(2)高效液相色谱法测定标准指纹图谱取10至20批中药组合物按步骤⑴的方法制备得到供试品溶液，按下列色谱条件获得10至20批中药组合物的高效液相色谱图，以这10至20批供试品指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为标准指纹图谱；色谱条件为色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为0. 8mL/min至lmL/min ;进样量5至IOy L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为240至280nm ;检测时间50至80分钟；柱温为20至50°C ;(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱取步骤⑴制备得到的供试品溶液，按下列色谱条件获得供试品溶液指纹图谱；色谱条件为色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为0. 8mL/min至lmL/min ;进样量5至20 y L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为240至280nm ;检测时间50至80分钟；柱温为20至50°C ;取步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤⑵得到的标准指纹图谱用相似度软件评价； 所述的中药组合物由熟地黄175重量份、鸡血藤117重量份、蒸肉灰蓉117重量份、炒莱菔子58重量份、盐制狗脊117重量份、骨碎补117重量份、盐制女贞子58重量份、牛膝117重量份和淫羊藿117重量份的原料采用以下制法制成取上述2/3量的熟地黄、盐制狗脊、1/2量的淫羊藿粉碎成细粉，然后将剩余1/3量的熟地黄、1/2量的淫羊藿与鸡血藤、蒸肉苁蓉、炒莱菔子、骨碎补、盐制女贞子和牛膝加水煎煮二次，每次I. 5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，加入上述细粉及药学上可接受的辅料，混匀，干燥，粉碎，制颗粒，制成中药常规剂型；所述的中药组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或滴丸剂。作为优选方案，以上步骤⑵和步骤(3)所述的梯度洗脱顺序为0分钟时，95% 90%的水，5% 10的乙腈；20分钟时，85% 75%的水，15% 25%的乙腈；45分钟时，70% 60%的水，30% 40%的乙腈；55分钟时，60% 50%的水，40% 50%的乙腈；65分钟时，60% 50%的水，40% 50%的乙腈。作为更优选的技术方案，以上步骤(2)和步骤(3)所述的梯度洗脱顺序为0分钟时，95%的水，5%的乙腈；20分钟时，80%的水，20%的乙腈；45分钟时，65%的水，35%的乙腈；55分钟时，55%的水，45%的乙腈；65分钟时，55%的水，45%的乙腈；流速为0. 8mL/min至lmL/min。以上所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，所述的供试品溶液指纹图谱和标准指纹图谱的相似度大于0. 85 ;本发明采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对中药组合物指纹图谱进行评价，结论客观、准确、全面。本发明所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，作为优选方案，步骤(2)和步骤
(3)所述的色谱柱为Luna C18色谱柱。由于中药组合物活性成分多，为了达到更好的分离效果，本发明筛选了不同的色谱柱①C18 柱0DS C18 (250X4. 5mm，5 y m)。②C18 柱C18 (250X4. 5mm, 5 U m)。③C18 柱luna C18 (250X4. 6mm, 5 u m)。④C18 柱C18 (250X4. 6mm, 5 u m)。试验考察结果表明Iuna C18色谱柱对中药组合物中各成分分离度高，峰形对称，分离效果较好，如图I所示，因此本发明优选Iuna C18色谱柱作为中药组合物指纹图谱测定色谱柱。本发明所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，检测波长优选270nm。中药组合物中活性成分复杂，为了能更全面的反映中药组合物中的成分，本发明测定了 210、240、270、300、330nm五个波长下的指纹图谱,经实验结果比较分析,在270nm波长下的中药组合物指纹图谱中，所反映的指纹峰较多，灵敏度高，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好，如图2所示。供试品溶液提取溶剂及其提取方法筛选中药组合物是由9味中药组成的复方制成，活性成分复杂，为了能高效地将中药组合物活性成分提取出来，全面反映其质量，本发明考察了水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇为中药组合物的提取溶剂，实验结果表明，用浓度为50%甲醇提取所得供试品溶液能够更全面的反映中药组合物中各成分，且重复性较 好，如图3所示，所以确定50%甲醇为提取溶剂；本发明在筛选出提取溶剂后又对提取方法和提取时间进行了考察，包括渗滤、超声、回流、浸溃等方法；在确定提取方法后，本发明考察了超声15min、30min和45min,实验结果表明超声提取30min对供试品活性成分的提取效率高，活性成分稳定，如图4、图5所示；因此本发明优选的中药组合物指纹图谱供试品溶液的制备方法为取中药组合物，将内容物混匀，研细，取0. 5^2. Og,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液作为供试品溶液。流动相流速的筛选本发明筛选了0. 5mL/min>0. 6mL/min>0. 8mL/min 和 lmL/min等流速对指纹图谱测定结果的影响，比较了峰形、分离度、理论塔板数等，优选的流动相流速为 lmL/min。流动相及其梯度洗脱的考察与验证中药组合物的活性成分中含有淫羊藿苷、柚皮苷、梓醇等多个活性成分，部分化合物极性非常接近，现有技术的洗脱方式不能很好的将各化合物分离，因此为了更全面反映中药组合物中活性成分，本发明对选择的流动相及其流动相的梯度洗脱方式进行了考察与验证；本发明选择的流动相为水和乙腈，首先在(T65分钟内梯度洗脱方式为0分钟时，95%的水，5%的乙腈；65分钟时，45%的水，55%乙腈；考察结果如图6-1所示，在l(T25min时间段内没有峰，而25 45min时间段内有较多峰，分离度不好，考虑在IOlOmin内将乙腈梯度洗脱到高比例，且在以后时间内使乙腈比例变化较小，则能使25 45min内较多峰分离开，因此调整梯度洗脱；调整后的梯度洗脱方式为0分钟时，95%的水，5%的乙腈；20分钟时，80%的水，20%的乙腈；45分钟时，65%的水，35%的乙腈；55分钟时，55%的水，45%的乙腈；65分钟时，55%的水，45%的乙腈；验证结果如图6_2所示，采用该梯度洗脱方式，中药组合物中主要成分在25飞Omin时间段内均能在色谱柱上达到很好的分离效果，不会出现峰重叠或拖尾现象，显示的峰数较多，信息量大，能更加客观和全面的反映中药组合物的质量。同时本发明对色谱柱的柱温进行了筛选，考察了色谱柱在20°C、25°C、28°C、30°C和35°C条件下中药组合物中各成分的分离效果，比较了分离效果、重复性、稳定性等，优选的色谱柱柱温为30°C。作为优选方案，本发明所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，所述的高效液相色谱仪为安捷伦1100液相色谱仪。因此，本发明经过大量实验优选得到的高效液相指纹检测方法的色谱分析方法为IunaC18色谱柱,如phenomenex IunaC18,流动相为水和乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为0分钟时，95%的水，5%的乙腈；20分钟时，80%的水，20%的乙腈；45分钟时，65%的水，35%的乙腈；55分钟时，55%的水，45%的乙腈；65分钟时，55%的水，45%的乙腈；流速为lmL/min ;进样量dOy L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为270nm ；检测时间65分钟；柱温为30 0C ；有益效果本发明提供的中药组合物的指纹图谱的检测方法和现有技术相比具有以下优点本发明所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，首先通过大量实验筛选出最佳的 流动相组成及其梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱等分析条件，制定标准指纹图谱，经多次实验验证表明，本发明提供的中药组合物的指纹图谱检测方法，灵敏度、精密度高，重复性、稳定性好，能够准确测定中药组合物的指纹图谱，可以客观、全面、准确的评价中药组合物质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的诸多缺点。


图I为色谱柱选择的分析图。图2为检测波长选择的分析图。图3为提取溶剂选择的分析图。图4为提取方法选择的分析图。图5为提取时间选择的分析图。图6为梯度洗脱考察与验证的分析图。图7为中药组合物胶囊的标准指纹图谱。图8为中药组合物胶囊供试品的指纹图谱。图9为中药组合物胶囊8批样品指纹图谱。图10为中药组合物片剂8批样品指纹图谱。图11为中药组合物丸剂8批样品指纹图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例I中药组合物胶囊的测定及标准指纹图谱的获得I、中药组合物胶囊均由江苏康缘药业股份有限公司生产，取十八批，批号分别为031101、031103、031207、040105、040308、040401、040505、040601、040602、040603、050204、050301、050403、050404、050501、050502、050503、050504，按说明书内容技术方案中供试品
溶液的制备方法，取中药组合物胶囊，将内容物混匀，研细，精密称定IgJP 50%甲醇25mL，超声提取30min，过滤，取续滤液作为供试品溶液；然后按下列色谱条件获得18批次中药组合物胶囊的液相色谱图，计算相似度，以这十八批供试品指纹图谱为基础，采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算获得共有模式作为标准指纹图谱;如图7所示色谱条件为phenomenex IunaC18色谱柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为0分钟时，95%的水，5%的乙腈；20分钟时，80%的水，20%的乙腈；45分钟时，65%的水，35%的乙腈；55分钟时，55%的水，45%的乙腈；65分钟时，55%的水，45%的乙腈；流速为ImL/min ;进样量10 y L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为270nm ;检测时间65分钟；柱温为30°C ；Agilentll00液相色谱仪；Agilent LC色谱工作站。2、分别计算十八批成品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，其结果均大于0. 90，表明江苏康缘药业股份有限公司生产的中药组合物胶囊质量稳定可靠，一致性好，同时也表明本发明提供的中药组合物胶囊的指纹图谱检测方法能有效、全面控制产品质量。实施例2中药组合物胶囊指纹图谱检测方法的稳定性试验
取江苏康缘药业股份有限公司生产批号为040505的中药组合物胶囊，按说明书所述的供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，然后按说明书所述的供试品溶液指纹图谱分析方法每隔3小时测定一次指纹图谱，共测6次，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，具体实验结果如表I所示表I中药组合物胶囊指纹图谱检测方法的稳定性试验结果
权利要求
1.一种治疗骨质增生的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)供试品溶液的制备取中药组合物，将内容物混匀，研细，精密称定0.5至2g，力口40 60%甲醇20 30mL，超声提取30至60min，过滤，取续滤液作为供试品溶液； (2)高效液相色谱法测定标准指纹图谱取10至20批中药组合物按步骤(I)的方法制备得到供试品溶液，按下列色谱条件获得10至20批中药组合物的高效液相色谱图，以这10至20批供试品指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为标准指纹图谱； 色谱条件为色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min至lmL/min ;进样量5至20 y L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为240至280nm ;检测时间50至80分钟；柱温为20至50°C ; (3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱取步骤(I)制备得到的供试品溶液，按下列色谱条件获得供试品溶液指纹图谱； 色谱条件为色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为0. 8 mL/min至lmL/min ;进样量5至IOy L ;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为240至280nm ;检测时间50至80分钟；柱温为20至50°C ; 取步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的标准指纹图谱用相似度软件评价； 所述的中药组合物由熟地黄175重量份、鸡血藤117重量份、蒸肉苁蓉117重量份、炒莱菔子58重量份、盐制狗脊117重量份、骨碎补117重量份、盐制女贞子58重量份、牛膝117重量份和淫羊藿117重量份的原料采用以下制法制成 取上述2/3量的熟地黄、盐制狗脊、1/2量的淫羊藿粉碎成细粉，然后将剩余1/3量的熟地黄、1/2量的淫羊藿与鸡血藤、蒸肉苁蓉、炒莱菔子、骨碎补、盐制女贞子和牛膝加水煎煮二次，每次I. 5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，加入上述细粉及药学上可接受的辅料，混匀，干燥，粉碎，制颗粒，制成中药常规剂型； 所述的中药组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或滴丸剂。
2.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的梯度洗脱顺序为 0分钟时，95% 90%的水，5% 10%的乙腈； 20分钟时，85% 75%的水，15% 25%的乙腈； 45分钟时，70% 60%的水，30% 40%的乙腈； 55分钟时，60% 50%的水，40% 50%的乙腈； 65分钟时，60% 50%的水，40% 50%的乙腈。
3.根据权利要求2所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的梯度洗脱顺序为 0分钟时，95%的水，5%的乙腈； 20分钟时，80%的水，20%的乙腈； 45分钟时，65%的水，35%的乙腈； 55分钟时，55%的水，45%的乙腈； 65分钟时，55%的水，45%的乙腈。
4.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱柱为Luna C18色谱柱。
5.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)流动相的流速为lmL/min。
6.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的供试品溶液指纹图谱和标准指纹图谱的相似度大于0. 85。
7.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱条件中，进样量为IOiiL;多波长紫外一可见光检测器，检测波长为270nm ;检测时间65分钟；柱温为30°C。
8.根据权利要求I所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的相似度软件为国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。
全文摘要
本发明公开了一种治疗骨质增生的中药组合物的指纹图谱检测方法，该方法包括供试液的制备，标准指纹图谱的建立和供试液指纹图谱的测定。经实验验证表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，相似度高，可以客观、全面、准确的评价该中药组合物的质量。
文档编号G01N30/02GK102768251SQ20121027216
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者李家春, 毕宇安, 王振中, 秦建平, 章晨峰, 萧伟 申请人:江苏康缘药业股份有限公司