专利名称：肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法
技术领域：
本发明涉及肝病标记物、其测定方法、装置和医药品的检验方法，特别是，涉及将各种肝病患者与健康人识别开从而能够进行筛选的肝病标记物、其测定方法、装置和使用了该肝病标记物的医药品的检验方法。
背景技术：
肝病包括药物性肝损伤、乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、肝癌等多种各样的肝病，另外还存在无症状的乙型病毒、丙型病毒的携带者。特别是，七成的丙型肝炎病毒(hepatitistype Cvirus :HCV)感染者由于慢性的肝脏炎症(慢性肝炎)而逐渐丧失正常的肝细胞，肝脏纤维化，然后发展为肝硬化，进而甚至发展为肝癌。据报道，10-15%的丙型慢性肝炎患者、80%的肝硬化患者会罹患肝癌。虽然慢性肝炎的状态下不会对生命造成危险，但若产生肝 癌，或者肝硬化发展而引起肝功能衰竭的话，则生命面临危险。因此，需要在早期诊断丙型肝炎、驱除病毒。丙型肝炎会无症状地从肝硬化发展为肝癌，肝脏的功能极度降低，产生倦怠感、黄疸、意识障碍等各种障碍，但目前在该阶段还没有有效的治疗法。因此，需要在肝脏的功能恶化之前，尽早检测症状的发展，实施投与干扰素等的治疗等。但是，现状是尚未确立可准确且迅速鉴定各种肝损伤的方法。通常若被怀疑是肝病，会进行问诊、视诊、触诊，同时测定血中的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、Y-谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(AL-P)JffljE酯酶(ChE)、胆红素等肝功能标记物。这些生物化学检查值存在异常时，进行乙型、丙型肝炎病毒检查、超声波检查、X射线、CT等影像检查。在癌的判断中，测定下述肿瘤标记物血中的α-胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(PIVKA-II)、癌胚胎性抗原(CEA)等蛋白质。此外，需要准确判断的情况下，进行腹腔镜检查、肝活检(需要住院一周左右)(非专利文献I)。这样为了鉴定肝病，必须接受许多检查，在得到判断之前需要花费数天。另外，腹腔镜检查、肝活检还会将患者暴露于危险之下，使其遭受肉体上的痛苦。腹腔镜检查、肝活检对患者的负担较大，因此不能为了进行病情的确认等而频繁进行。此外，在现有方法中，许多检查、判断必须由专家来进行，将负担强加于短缺的医疗工作者。因此，强烈期望一种不对患者造成负担、迅速、准确且简便的肝病的判断方法。已知的是，肝炎、肝硬化、肝癌等许多肝损伤都是因活性氧的生成(氧化应激)和将其去除的生物体防御系统的崩溃而引起的(非专利文献2)。生物体对活性氧等氧化应激的防御中的主要一种是由谷胱甘肽系统承担的。组织中以最高浓度存在的抗氧化物质包括还原型谷胱甘肽(GSH :以下称为谷胱甘肽)，通过谷胱甘肽与活性氧、亲电物质轭合，这些物质被还原，氧化应激得到抑制。但是，若谷胱甘肽减少，则组织、细胞暴露于氧化应激中，会引起各种病情(非专利文献3)。据报道，实际上肝损伤中也会因乙型、丙型肝炎病毒的感染而导致氧化应激亢进、谷胱甘肽减少，还报道了在丙型肝炎、肝硬化、肝癌的患者、小鼠中谷胱甘肽减少(非专利文献 2、4)。通过服用药物而诱发的药物性肝损伤也是因氧化应激而引起。解热镇痛药扑热息痛(APAP)在肝脏中代谢，生成高毒性的亲电物质N-乙酰对苯醌亚胺(NAQPI)。该NAQPI通过与在肝脏中以高浓度存在的谷胱甘肽(GSH)轭合，从而被解毒、排泄。但是，亲电物质大量存在时，谷胱甘肽会枯竭，从而使亲电物质在细胞内中蓄积(氧化应激)，与生物体高分子反应。已知其结果是导致细胞功能紊乱，引起药物性肝损伤等病情。迄今为止发明人等发现若对小鼠大量投与APAP，则为了解除APAP的代谢所生成的亲电物质NAQPI的毒性，谷胱甘肽减少，视晶酸与之成反比地剧增(参照图I的(B))，肝脏和血中的视晶酸的增加表明肝脏的谷胱甘肽由于亲电物质而枯竭(专利文献I、非专利文献5)。其机制如下所述。如图I所示，谷胱甘肽(Y -Glu-Cys-Gly)和视晶酸(Y-Glu-2AB-Gly)是由相同的两种酶即Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶生 物合成的三肽，差别在于底物(起始物质)是半胱氨酸(Cys )还是2-氨基丁酸(2AB)。在图I的(A)所示的通常的还原状态下，肝脏内大量存在谷胱甘肽，最初的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被反馈(FB)抑制。因此，视晶酸几乎不被生物合成。但是，如图I的(B)所示的氧化状态那样，若存在亲电物质、活性氧种，则由于解毒而消耗谷胱甘肽。通过谷胱甘肽的减少，反馈抑制被解除，
Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活化，谷胱甘肽和视晶酸被生物合成。视晶酸在肝脏内蓄积，还排泄到血中。这样通过亲电物质等而形成氧化状态时，肝脏、血液中的视晶酸增加，因此视晶酸成为氧化应激的生物标记物。另外，还有文献报道，在因肥胖而使内脏脂肪增加从而成为问题的非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD)中，氧化应激标记物血清硫氧还蛋白(TRX)对于由肝硬化向肝癌发展的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis NASH)和有一个良性过程的单纯性月旨肪月干(simplesteatosis SS)的识别是有用的(非专利文献6)。另一方面，根据基于毛细管电泳-质谱仪(CE-MS)的试样中的代谢物质测定法的、细胞内的代谢物质的网罗性的测定方法(例如，参照非专利文献7、)，为了监测人或动物的身体状态，定性地且/或定量地确定来自该人或动物的身体的液体样品的低分子化合物(代谢物质)谱和/或肽谱，此处，该液体样品的代谢物质和肽通过毛细管电泳而被分离，接着直接被离子化，然后用通过接口与计算机连接的质谱仪进行检测。为了长期监测该人或动物的身体状态，将表示该状态的参照值和样品值、以及由该值导出的偏差和一致性自动地存储在数据库中。在组合毛细管电泳和质量分析而对阴离子性化合物进行分离分析的情况下，已知一种阴离子性化合物的分离分析方法，其特征在于，使用毛细管的内表面预先包覆为阳离子性的包覆毛细管，将电渗流反转(例如，参照专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2007-192746号公报专利文献2 日本专利第3341765号公报非专利文献
非专利文献I Callewaert, N. et al. Nat. Med. 10, 429-434，2004.非专利文献2:Loguercio, Carmela et al. Free Radic. Biol. Med. 34, 1-10, 2003.非专利文献3 :Yadav, Dhiraj et al. Am. J. Gastroenterol. 97, 2634-2639, 2002.非专利文献4 Moriya, K. et al. Cancer Res. 61，4365-4370，2001.非专利文献5 Soga, T. et al. J. Biol. Chem. 281，16768-16776，2006.非专利文献6:谷川久一编“酸化^卜>、i肝疾患〈第5卷”(氧化应激与肝病<第 5 卷 >)· Me dical Tribune 公司，3-37 页，2009. 5. 7.非专利文献7 Soga, T. et al. J. Proteome Res. 2. 488-494，2003.
非专利文献8 :Soga, T. et al. J. BoiI Chem. Vol. 281, No. 24, (June16，2006) 16768-16776非专利文献9:Hirayama，A.et al. Cancer. Res. 69 (II).(JuneI, 2009)4918-4925非专利文献10 Pignatelli, B. et al. Am. J. Gastroenterol. 96, 1758-1766，2001.

发明内容
发明要解决的问题然而，一直以来，难以通过一次检查识别并鉴定药物性肝损伤(drug inducedliver injury :DI)、无症状乙型月干炎携带者(asymptomatic hepatitis B carrier AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B :CHB)、丙型肝炎病毒携带者且ALT值正常的 HCV 阳性 ALT 持续正常者(hepatitis C with persistentlynormal ALT:CNALT)、慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C :CHC)、丙型肝硬化(cirrhosis type C:CIR)、肝癌(hepatocellularcarcinoma :HCC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等。本发明是为了消除前述现有问题而进行的，其课题在于，通过测定血液中的低分子生物标记物，能够迅速地鉴定药物性肝损伤(DI)、无症状乙型肝炎携带者(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)、慢性丙型肝炎(CHC)、丙型肝硬化(CIR)、肝癌(HCC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等肝病。用于解决问题的方案如上所述，肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝损伤与氧化应激具有很深的关系，因而可以预测到视晶酸浓度因各种肝损伤而变动。因此，从健康人(C)、药物性肝损伤(DI)、无症状乙型肝炎携带者(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)、慢性丙型肝炎(CHC)、丙型肝硬化(CIR)、肝癌(HCC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)的患者采集血液，测定血清中的视晶酸。但是，与小鼠不同，从健康人(C)、药物性肝损伤(DI)患者中几乎检测不到视晶酸。(小鼠血清中的视晶酸的浓度约为2 μ M，人血清中的浓度约为1/20左右，在健康人(C)、药物性肝损伤(DI)患者中几乎检测不到。)但是，发明人等发现了在各种肝炎患者的血清中显著增加的物质，鉴定这些物质为Y-Glu-X肽类(注Χ表示氨基酸和胺)。图2中，示意性地示出各种肝损伤患者中生物合成Y-Glu-X肽类的机制。此外，通过使用血清中的肝功能标记物AST和ALT的值和
Y-Glu-X肽类，基于多元逻辑回归(MLR)模型进行多变量分析，从而成功地将各种肝炎患者与其他对象进行区分。
根据本发现，通过测定血液中的￥-61114肽类的浓度451'41^的值，能够迅速地鉴定健康人(C)、药物性肝损伤(DI)、无症状乙型肝炎携带者(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、HCV阳性ALT持续正常者(CNALT )、慢性丙型肝炎(CHC )、丙型肝硬化(CIR)、肝癌(HCC )、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等肝病。本发明是基于上述见解 而进行的，涉及一种肝病标记物，其特征在于，其为用于检测哺乳动物的组织中的氧化应激的标记物，并且其为Y-Glu-X (X为氨基酸和胺)肽。此处，可以通过多元逻辑回归(MLR)分析选择多种Y-Glu-X (X为氨基酸和胺)肽的组合。另外，为健康人(C)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示，其为至少含有葡糖胺(Glucosamine)、y -Glu-Ala>蛋氨酸亚砜(Methioninesulfoxide)、y-Glu-Leu> Y-Glu-Val、AST、ALT、y-Glu-Phe> y-Glu-Met>
Y-Glu-Gln 的组合。另外，为药物性肝损伤(DI)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示,其为至少含有Y-Glu-牛磺酸(Taurine)、y -Glu-Leu> y -Glu-Glu>
Y-Glu-Arg> y -Glu-Ser> y -Glu-Phe> y -Glu-Met> γ-Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合，且排除比数比(odds ratio)接近I的AST、ALT和Y-Glu-Gly0此外，添加AST、ALT、
Y-Glu-Gly中的至少一个，可以提高精度。另外，为无症状乙型肝炎携带者(AHB)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表2所示,其为至少含有Y-Glu-牛磺酸(Taurine)、y -Glu-Ala>
Y-Glu~Leu> y -Glu-Val > AST> y -Glu-Lys> y -Glu-Arg> y -Glu-Met> Y-Glu-Gln 的组合，且排除比数比接近I的ALT。此外，添加ALT，可以提高精度。另外，为慢性乙型肝炎(CHB)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示，其为至少含有Y -Glu-Ala、蛋氨酸亚砜(Methioninesulfoxide)、y-Glu-Leu> Y-Glu-Glu、AST、ALT、γ-Glu-Arg、y-Glu-Ser> y-Glu-His>y -Glu-Phe> y -Glu-Met> γ-Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合。另外，为HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示，其为至少含有葡糖胺(Glucosamine)、γ-Glu-Leu、Y-Glu-Val、AST、y -Glu-Gly> γ-Glu-Gln、Y-Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合,且排除比数比接近I的ALT。此外，添加ALT，可以提高精度。另外，为慢性丙型肝炎(CHC)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表3所示,其为至少含有葡糖胺(Glucosamine)、y -Glu-Lys> Y-Glu-His的组合，且排除比数比接近I的蛋氨酸亚砜(Methionine sulfoxide)和ALT。此外,添加蛋氨酸亚讽(Methionine sulfoxide)和/或ALT,可以提高精度。另外，为丙型肝硬化(CIR)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有葡糖胺(Glucosamine)、蛋氨酸亚砜(Methioninesulfoxide)、 y-Glu-Leu> y-Glu-Val> γ-Glu-Glu、 y-Glu-Gly> y-Glu-Met> γ-Glu-Gln、Y-Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合，且排除比数比接近I的AST和ALT。此外，添加AST和/或ALT,可以提闻精度。另夕卜，为肝癌(HCC)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示，其为至少含有Y -Glu-牛磺酸、Y -Glu-Glu, y -Glu-Gly,Y-Glu-Ser> Y-Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合，且排除比数比接近I的蛋氨酸亚砜(Methioninesulfoxide)>AST 和 ALT。此外，添加蛋氨酸亚讽(Methioninesulfoxide)AST、ALT中的至少一个，可以提高精度。另外，为单纯性脂肪肝(SS)识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示,其为至少含有Y-Glu-牛磺酸(Taurine)、y -Glu-Ala> y -Glu-Leu>Y-Glu-Val, y-G1u-G1u、AST、ALT、y-Glu-Thr, Y-Glu-Gln 的组合。另外，为非酒精性脂肪性肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为前述肝病标记物，如后述表4所示,其为至少含有葡糖胺(Glucosamine)、y -Glu-Ala> y -Glu-Val>
Y-Glu-Gly、y -Glu-Gln、y -Glu-瓜氨酸(Citrulline)的组合,且排除比数比接近I的AST和ALT。此外，添加AST和/或ALT，可以提高精度。
另外，本发明为肝病标记物测定方法，其特征在于，测定样品中的Y-Glu-X (X为氨基酸和胺)肽作为肝病标记物。另外，一种肝病标记物的测定装置，其特征在于，其具备以下单元由样品制作适于分析的试样的单元；以及分析单元，用于测定试样中的Y-Glu-X (X为氨基酸和胺)肽作为肝病标记物。另外，一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序在医药品的投与前和投与后采集的血液中测定前述任一项肝病标记物的浓度的工序；以及在前述医药品的投与前的血液和投与后的血液之间比较前述测定结果的工序。另外，一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序对于从由投与了医药品的一个以上个体组成的第I组中采集的血液和从由未投与前述医药品的一个以上个体组成的第2组中采集的血液，测定前述任一项的肝病标记物的浓度的工序；以及在第I组和第2组之间比较所测定的前述肝病标记物的浓度的工序。另外，本发明的肝病的诊断方法的特征在于，其包括以下工序从作为诊断对象的一个以上个体中采血的工序；通过上述任一项的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；以及将该标记物的浓度与一个以上正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。本发明的医药品的亲电性的毒副作用(投与医药品时产生的氧化应激)的诊断方法的特征在于，其包括以下工序由投与医药品前和投与医药品后的个体采血的工序；通过上述任一项的测定方法测定采集的血液中的本发明的标记物的浓度的工序；以及将该标记物的浓度与一个以上正常个体的血液中的标记物浓度进行比较的工序。此处，医药品可以为任意种类。此处，测定标记物的浓度的工序既包括分别测定从个体采集的血液的工序，也包括测定从多个个体采集的血液的血池(pool)的工序。另外，比较所测定的标记物的浓度的工序既包括逐一比较各测定中得到的浓度的工序，也包括比较各测定中得到的浓度的累加值或平均值的工序。可以使用标记物来检测组织中的氧化应激的哺乳动物，只要是能够随着组织中的氧化应激而在血中测定本发明的标记物的哺乳类，则没有限定，优选为人。对于采集用于该诊断方法的血液的哺乳动物没有特别限定，优选为其血液中存在至少一种上述标记物的哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠等啮齿类或人、猴、狗。
发明的效果根据本发明，通过测定血液中的Y-Glu-X肽类的浓度和AST、ALT的值等，能够迅速地鉴定健康人(C)、药物性肝损伤(DI)、无症状乙型肝炎携带者(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)、慢性丙型肝炎(CHC)、丙型肝硬化(CIR)、肝癌(HCC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、单纯性脂肪肝(SS)等肝病。


图I为示意性地示出由于亲电物质和活性氧(氧化应激)生物合成视晶酸的机制的图。 图2为示意性地示出在各种肝损伤患者中生物合成Y -Glu-X肽类的机制的图。图3为示出对健康人(C)和肝癌(HCC)患者的血清中的Y -Glu-X (X为氨基酸和胺)肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。图4为示出对健康人(C)和无症状乙型肝炎携带者(AHB)患者的血清中的Y-Glu-X肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。图5为示出对单纯性脂肪肝(SS)患者和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的血清中的Y -Glu-X肽类的LC-MS测定结果进行比较的图。图6为示出对健康人、各肝炎患者的血清中的AST、ALT、Y-Glu-X肽类的测定结果进行比较的图。图7为示出多元逻辑回归(MLR)模型的开发和评价的一个例子的步骤的流程图。图8为示出利用AST、ALT、Y _Glu_X肽类进行健康人的筛选检查的精度的图。图9为同样示出药物性肝损伤(DI)的筛选检查的精度的图。图10为同样示出无症状乙型肝炎携带者(AHB)的筛选检查的精度的图。图11为同样示出慢性乙型肝炎(CHB)的筛选检查的精度的图。图12为同样示出丙型肝炎病毒携带者且ALT值正常的HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)的筛选检查的精度的图。图13为同样示出慢性丙型肝炎(CHC)的筛选检查的精度的图。图14为同样示出丙型肝硬化(CIR)的筛选检查的精度的图。图15为同样示出肝癌(HCC)的筛选检查的精度的图。图16为同样示出单纯性脂肪肝(SS)的筛选检查的精度的图。图17为同样示出非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的筛选检查的精度的图。图18为示出对肝癌(HCC)患者和胃癌(gastric cancer GC)患者的血清中的
Y-Glu-X肽类的浓度进行比较的图。图19为示出用于区别肝癌(HCC)患者与慢性丙型肝炎(CHC)患者、丙型肝硬化(CIR)患者的AFP和MLR的箱线图和接受者操作特征(receiver operating curve :R0C)曲线的图。图20为示出投与了丁硫堇(buthionine sulfoximine :BS0)、马来酸二乙酯(Diethylmaleate DEM)的小鼠的肝脏中的Y _Glu_X、y -Glu-X-Gly的定量结果的图。图21为同样示出投与了 APAP的小鼠的肝脏中的Y _Glu_X、Y-Glu-X-Gly的定量结果的图。
图22为同样示出投与了 APAP的小鼠的血清中的Y -Glu-X, Y -Glu-X-Gly的定量结果的图。图23为示出健康人(C)、丙型肝硬化(CIR)、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的部分数据的的图。图24为同样示出健康人(C)、丙型肝硬化(CIR)、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的另一部分数据的图。图25为同样示出健康人(C)、丙型肝硬化(CIR)、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的又一部分数据的图。图26为同样示出健康人(C)、丙型肝硬化(CIR)、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂·肪性肝炎(NASH)患者的剩余数据的图。
具体实施例方式以下，对本发明的实施方式进行详细说明。如上所述，已知肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝损伤与氧化应激具有很深的关系。因此，测定53名健康人(C)、10名药物性肝损伤(DI )、9名无症状乙型肝炎携带者(AHB)、7名慢性乙型肝炎(CHB )、10名HCV阳性ALT持续正常者(CNALT )、24名慢性丙型肝炎(CHC)、10名丙型肝硬化(CIR)、19名肝癌(HCC)Ul名非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、9名单纯性脂肪R(SS)的血清，使用毛细管电泳-飞行时间质谱仪(CE-TOFMS )法测定视晶酸浓度。但是，发现其它物质在各肝炎患者中优势增加，鉴定它们均为Y-Glu-X肽类(注X表示氨基酸和胺)。I.从血清提取代谢物质将从健康人和各种肝炎患者中采集的血清(100 μ I)加入到添加有标准物质的甲醇900 μ I中，使酶失活,停止代谢的亢进。加入400 μ I的超纯水、1000 μ I的氯仿后,在4°C下以4600g尚心5分钟。静置后，使分尚的水-甲醇相750 μ I通过分级分子量为5kDa的离心超滤器，去除蛋白质。冷冻干燥滤液后，加入50 μ I的Milli-Q水，将其供于CE-TOFMS和LC-MS测定。2.利用毛细管电泳-质谱仪(CE-TOFMS)测定血清中的代谢物使用CE-T0FMS，同时测定健康人和肝炎患者的血清中的低分子代谢产物。CE-TOFMS 分析条件a.毛细管电泳(CE)的分析条件毛细管使用熔融石英毛细管(内径50 μ m、外径350 μ m、全长100cm)。缓冲液使用IM甲酸(pH约为I. 8)。以施加电压为+30kV、毛细管温度为20°C的条件进行测定。使用加压法，在50mbar下注入试样3秒钟(约3nl )。b.飞行时间质谱仪(TOFMS)的分析条件使用正离子模式，设定为离子化电压4kV、破裂器电压75V、锥孔电压(skimmervoltage)50V、0ct RFV电压125V。干燥气体使用氮气，设定为温度300°C、压力lOpsig。鞘液使用50%甲醇溶液，为了用于质量校正而混入0.5411利血平(111/2609.2807)，以10 μ I/min输送液体。使用利血平(m/z 609. 2807)和甲醇的加合离子(m/z 83. 0703)的质量数，对得到的全部数据进行自动校正。
3.利用液相色谱仪-质谱仪(LC-MSMS)测定血清中的Y-Glu-X肽类为了高灵敏度地进行测定，使用LC-MSMS测定血清中的Y -Glu-X肽类。a.液相色谱仪(LC)的分析条件分离柱使用野村化学(Nomura Chemical Co. Ltd.)公司制造的DevelosilRPAQUE0US-AR-3(内径2mmX长度100mm，3 μ m)，柱温箱设定为30°C。注入I μ I试样。流动相A使用O. 5%甲酸、流动相B使用乙腈，利用B液为0% (0min)-l% (5min)_10% (15min)_99%(17min) -99% (19min)的流速0. 2ml/min的梯度洗脱法将Y -Glu-X肽类分离。b.三重串联四极杆质谱仪(QqQMS)的分析条件使用Applied Biosystem公司制造的API3000三重串联四极杆质谱仪，以正离子模式的MRM模式进行测定。各质谱仪的参数如下所示。
离子源喷射电压5. 5kV雾化气压力12psi气帘气压力8psi碰撞气体8unit氮气温度550°C将优化后的、用于在MRM (Multiple Reaction Monitering,多反应监测)模式下测定各Y -Glu-X肽类的MRM参数示于表I。[表I]
权利要求
1.一种肝病标记物，其特征在于，其为用于检测哺乳动物的组织中的氧化应激的标记物， 并且其为Y-Glu-X肽,其中，X为氨基酸和胺。
2.一种健康人识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有甸糖胺、Y _Glu~Ala、蛋氣酸亚讽、γ-Glu-Leu、Y -Glu-Val > AST>ALT、Y —Glu-Phe-, Y —Glu-Met-, Y-Glu-Gln 的组合。
3.—种药物性肝损伤识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有 Y-Glu-牛磺酸、γ-Glu-Leu、y-Glu-Glu, y-Glu-Gly,Y-Glu-Arg> y -Glu-Ser> y -Glu-Phe> y -Glu-Met> Y-Glu-瓜氨酸的组合。
4.一种无症状乙型肝炎携带者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有 Y-Glu-牛磺酸、Y -Glu-Ala, Y-Glu-Leu、Y-Glu-Val、AST、Y-Glu-Lys> γ-Glu-Arg、y -Glu-Met> Y-Glu-Gln 的组合。
5.一种慢性乙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有Y-Glu-Ala、蛋氨酸亚砜、Y-Glu-Leu、Y-Glu-Glu、AST、ALT、Y-Glu-Arg> y -Glu-Ser> y -Glu-His> y -Glu-Phe> y -Glu-Met> Y-Glu-瓜氨酸的组合。
6.一种HCV阳性ALT持续正常者识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有甸糖胺、Y _Glu-Leu、Y-Glu-Val、AST、Y -Glu-Gly> Y -Glu-Gln>Y-Glu-瓜氨酸的组合。
7.—种慢性丙型肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有葡糖胺、Y-Glu-Lys、Y-Glu-His的组合。
8.—种丙型肝硬化识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有葡糖胺、蛋氨酸亚砜、Y-Glu-Leu、Y-Glu-Val, y-Glu-Glu,Y-Glu-Gly> Y -Glu-Met> Y -Glu-Gln> Y _Glu-瓜氣酸的组合。
9.一种肝癌识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有 Y -Glu-牛磺酸、Y -Glu-Glu, Y -Glu-Gly, y -Glu-Ser, y -Glu-瓜氨酸的组合。
10.一种单纯性脂肪肝识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有 Y-Glu-牛磺酸、Y-Glu-Ala、y-Glu-Leu, y-Glu-Val,Y-Glu-Glu, AST, ALT, y-Glu-Thr, Y-Glu-Gln 的组合。
11.一种非酒精性脂肪性肝炎识别用的肝病标记物，其特征在于，其为权利要求I所述的肝病标记物， 并且其为至少含有甸糖胺、Y -Glu~Ala、Y _Glu~Val > y -Glu-Gly > y -Glu-Gln、Y-Glu-瓜氨酸的组合。
12.一种肝病标记物的测定方法，其特征在于，测定样品中的Y-Glu-X肽作为肝病标记物，其中，X为氨基酸和胺。
13.一种肝病标记物的测定装置，其特征在于，其具备以下单元 由样品制作适于分析的试样的单元；以及 分析单元，用于测定试样中的Y-Glu-X肽作为肝病标记物，其中，X为氨基酸和胺。
14.一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序 在医药品的投与前和投与后采集的血液中测定权利要求f 10中任一项所述的肝病标记物的浓度的工序；以及 在所述医药品的投与前的血液和投与后的血液之间比较所述测定结果的工序。
15.一种医药品的检验方法，其特征在于，其包括以下工序 对于从由投与了医药品的一个以上个体组成的第I组中采集的血液和从由未投与所述医药品的一个以上个体组成的第2组中采集的血液，测定权利要求f 11中任一项所述的肝病标记物的浓度的工序；以及 在第I组和第2组之间比较所测定的所述肝病标记物的浓度的工序。
全文摘要
迅速鉴定肝病。测定血液中的γ-Glu-X(X为氨基酸和胺)肽类的浓度或AST、ALT的值，由该测定值进行例如多元逻辑回归(MLR)，从而鉴定健康人(C)、药物性肝损伤(DI)、无症状乙型肝炎携带者(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、HCV阳性ALT持续正常者(CNALT)、慢性丙型肝炎(CHC)、丙型肝硬化(CIR)、肝癌(HCC)、单纯性脂肪肝(SS)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等肝病。
文档编号G01N33/50GK102971632SQ20118003020
公开日2013年3月13日 申请日期2011年5月17日 优先权日2010年6月18日
发明者曽我朋义, 杉本昌弘, 末松诚, 斋藤贵史, 河田纯男 申请人:学校法人庆应义塾