专利名称：一种测定新霉素的螺旋免疫组装传感器的构建方法
技术领域：
一种测定新霉素的螺旋免疫组装传 感器，属于材料化学技术领域。
背景技术：
螺旋广泛存在于自然界中，天然大分子如DNA、蛋白质、胶原等都会呈现出神奇的螺旋结构，科学家们发现螺旋结构是这些分子能够表现出生物活性的重要因素。被这些神奇的螺旋结构所吸引，科学家们设计合成了一些螺旋聚合物。具有螺旋结构的大分子对高分子科学家有着独特的吸引力，因为合成的螺旋聚合物有着独特的性质以及广泛的用途。 螺旋大分子的潜在用途包括分子识别、手性分离、手性催化、数据存储、显示材料等。纳米颗粒(nanoparticles，Nas) —般是指尺寸至少有一维在1-100 nm间的粒子。 纳米尺度是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，处于这个区域的材料具有一些独特性质，如小尺寸效应、表面、界面效应和量子尺寸效应等。空气中纳米颗粒虽然浓度很低，但具有很高的颗粒物数目。将宏观物体细分成纳米颗粒后，它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学性质和大体积固体相比将会显著不同。纳米材料的小尺寸、化学成分、表面结构、溶解性、外形和聚集情况决定着它们特殊的物理化学性质，这些性质使得纳米材料在将来有着广泛的用途。随着纳米科技的发展，纳米粒子组装体系的研究变得日益活跃。纳米粒子的二维和三维有序组装结构也因其重要的物理和化学性质近年来受到人们的广泛重视，它们在许多领域如传感器、催化剂、磁化材料、表面增强拉曼和光学材料等有着潜在的应用。金纳米材料与螺旋聚合物组装，可通过表面等离子共振介导及手性分子诱导等机理产生圆二色谱(⑶)信号。但通过这种组装系统结合免疫识别原理用于构建小分子检测传感器尚属空白。

发明内容
本发明的目的是提供一种水溶性螺旋聚合物，通过免疫识别与金纳米粒子组装， 通过组装后产生的圆二色谱(CD)信号对新霉素进行检测。本发明的技术方案一种测定新霉素的螺旋免疫组装传感器的构建方法，包括 水溶性螺旋聚合物的制备，半抗原修饰螺旋聚合物，金纳米粒子偶联抗体，新霉素传感器的建立；具体步骤为
(1)水溶性螺旋聚合物的制备 a、4_氨基苯甲酸甲酯的制备
2. 6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g双(二亚节基丙酮)钯和3. 75g双-(三甲基硅基)胺锂，放入50mL锥形瓶中，氩气保护，加入26mL无水甲苯。橡胶塞密封锥形瓶， 室温下搅拌混合物，薄层色谱监控反应物。反应两天后，粗产物加入IOOmL乙醚稀释，同时加入少量盐酸，再加入300mL乙醚搅拌。4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗涤，空气中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并将混合物用IOOmL CH2Cl2萃取。再向其中加入IOOmL饱和NH4Cl溶液稀释。将有机层用MgSO4除水，再蒸干。粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯(1 4 ν/ν )洗脱液，最终得4-氨基苯甲酸甲酯。b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制备
氮气保护条件下将1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3.4mL甲酸和8. 51mL乙酸。在50°C 下搅拌2h后，反应物减压干燥。产物用乙醚和正己烷洗涤，室温下真空干燥过夜，得产物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯 。c、4-异氰基苯甲酸甲酯的制备
1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL无水三乙胺和3mL无水CH2Cl2置入带有回流冷凝气的三口烧瓶中，温度维持在-30°C。0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2加入反应物中，0°C 搅拌反应lh，再在20V反应0. 5h，加入50mL质量浓度7. 5%碳酸氢钾水溶液。将有机层用 MgSO4除水，再蒸干。粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯(3:lv/v)洗脱液，最终得 4-异氰基苯甲酸甲酯。d、4-异氰基苯甲酸钠的制备
4_异氰基苯甲酸甲酯棕色固体0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮气保护下0°C反应1.5h。收集沉淀，乙醇洗涤，室温下真空干燥过夜。最终得4-异氰基苯甲酸钠。e、聚4-异氰基苯甲酸钠的制备
4_异氰基苯甲酸钠l.OOg置于反应瓶中，氮气保护下加入11.8mL超纯水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,过夜反应，沉淀用甲醇洗涤，真空干燥，得聚4-异氰基苯甲酸钠。f、聚4-异氰基苯甲酸的制备
0. 9g聚4-异氰基苯甲酸钠置于IM HCl溶液中，得聚4-异氰基苯甲酸，即为水溶性螺旋聚合物。(2)半抗原修饰螺旋聚合物
1 μ L碳化二亚胺(EDC)和2. 4mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)加入到0. 5mL 100 mg/mL的步骤(1)合成的聚4-异氰基苯甲酸水溶液中，反应10-15 min左右活化。活化后的聚4-异氰基苯甲酸加入Img新霉素，室温反应4h，透析除去未反应的药物小分子。 得聚4-异氰基苯甲酸-新霉素复合物，即为半抗原修饰螺旋聚合物；
(3)金纳米粒子偶联抗体
IOmL 20nM 8nm金纳米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗体，0. IM K2CO3调节 PH值为8. 0，反应Ih ；得金纳米粒子偶联抗体；
(4)新霉素传感器的建立
ImL 20nM步骤(3)合成的金纳米粒子偶联抗体加10 μ L 100mg/mL步骤(2)合成的半抗原修饰螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素标准品，反应Ih后，取组装好的体系100 μ L 于比色皿中，用水做空白对照，圆二色谱仪扫描波长200-800nm⑶值。所述8nm金纳米粒子的合成用单宁酸和柠檬酸三钠还原氯金酸合成；8nm金纳米粒子的合成方案为洁净的三口烧瓶中加入69mL超纯水，0. 9mL质量浓度1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入3. SmL质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，0. ImL质量浓度1%单宁酸溶液，0. 2mL 25mM碳酸钾溶液和17. SmL超纯水作为B液；A、B液均加热到60°C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，反应液在60°C下继续搅拌30min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流2min形成亮红色溶液，最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子， 透射电镜显示8nm。本发明的有益效果本发明提供一种水溶性螺旋聚合物聚4-异氰基苯甲酸，通过免疫识别(新霉素半抗原修饰螺旋聚合物)与金纳米粒子(偶联抗体)组装，通过组装后产生的圆二色谱(CD)信号对新霉素进行检测。


图1新霉素标准曲线
具体实施例方式实施例1
(1)水溶性螺旋聚合物的制备 a、4_氨基苯甲酸甲酯的制备
2. 6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g双(二亚节基丙酮)钯和3. 75g双-(三甲基硅基)胺锂，放入50mL锥形瓶中，氩气保护，加入26mL无水甲苯。橡胶塞密封锥形瓶， 室温下搅拌混合物，薄层色谱监控反应物。反应两天后，粗产物加入IOOmL乙醚稀释，同时加入少量盐酸，再加入300mL乙醚搅拌。4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗涤，空气中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并将混合物用IOOmL CH2Cl2萃取。再向其加入IOOmL饱和 NH4Cl溶液稀释。将有机层用MgSO4除水，再蒸干。粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯(1 4 )洗脱液，最终得4-氨基苯甲酸甲酯。b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制备
氮气保护条件下将1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3.4mL甲酸和8. 51mL乙酸。在50°C 下搅拌2h后，反应物减压干燥。产物用乙醚和正己烷洗涤，室温下真空干燥过夜，得产物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯。c、4_异氰基苯甲酸甲酯的制备
1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL无水三乙胺和3mL无水CH2Cl2置入带有回流冷凝气的三口烧瓶中，温度维持在_30°C。0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2W入反应物中，0°C搅拌反应lh，再在20°C反应0. 5h，加入50mL7. 5%碳酸氢钾水溶液。将有机层用MgSO4除水， 再蒸干。粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯(3:1)洗脱液，最终得4-异氰基苯甲酸甲酯。d、4-异氰基苯甲酸钠的制备
4_异氰基苯甲酸甲酯棕色固体0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮气保护下0°C反应1.5h。收集沉淀，乙醇洗涤，室温下真空干燥过夜。最终得4-异氰基苯甲酸钠。
e、聚4-异氰基苯甲酸钠的制备
4_异氰基苯甲酸钠l.OOg置于反应瓶中，氮气保护下加入11.8mL超纯水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,过夜反应，沉淀用甲醇洗涤，真空干燥，得聚4-异氰基苯甲酸钠。
f、聚4-异氰基苯甲酸的制备
0. 9g聚4-异氰基苯甲酸钠置于IM HCl溶液中，得聚4-异氰基苯甲酸。
( 2)半抗原修饰螺旋聚合物
IuL EDC和2. 4mg su Ifo-NHS加入到0. 5mL 100 mg/mL的步骤(1)合成的聚4-异氰基苯甲酸水溶液中，反应10-15 min左右活化。活化后的聚4-异氰基苯甲酸加入I mg新霉素，室温反应4h，透析除去未反应的药物小分子。(3)金纳米粒子偶联抗体
IOmL 20nM 8nm金纳米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗体(购于北京华安麦科生物技术有限公司，北京市昌平区科技园区超前路6号)，0. IM K2CO3调节pH值为8.0， 反应Ih ；
(4)新霉素传感器的建立
ImL 20nM步骤(3)合成的抗体修饰金纳米粒子加10 μ L 100mg/mL步骤(2)合成的半抗原修饰螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素标准品，反应Ih后，取组装好的体系100 μ L 于比色皿中，用水做空白对照，圆二色谱仪扫描波长200-800nm⑶值。
权利要求
1.一种测定新霉素的螺旋免疫组装传感器的构建方法，其特征在于包括水溶性螺旋聚合物的制备，半抗原修饰螺旋聚合物，金纳米粒子偶联抗体，新霉素传感器的建立；具体步骤为(1)水溶性螺旋聚合物聚4-异氰基苯甲酸的制备a、4-氨基苯甲酸甲酯的制备b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制备c、4-异氰基苯甲酸甲酯的制备d、4-异氰基苯甲酸钠的制备e、聚4-异氰基苯甲酸钠的制备f、聚4-异氰基苯甲酸的制备(2)半抗原修饰螺旋聚合物(3)金纳米粒子偶联抗体(4)新霉素传感器的建立。
2.根据权利要求1所述的测定新霉素的螺旋免疫组装传感器的构建方法，其特征在于(1)水溶性螺旋聚合物的制备a、4-氨基苯甲酸甲酯的制备2.6g 4-溴苯甲酸甲酯，113mg三丁基膦，321g双(二亚节基丙酮)钯和3. 75g双-(三甲基硅基)胺锂，放入50mL锥形瓶中，氩气保护，加入26mL无水甲苯，橡胶塞密封锥形瓶， 室温下搅拌混合物，薄层色谱监控反应物，反应两天后，粗产物加入IOOmL乙醚稀释，同时加入少量盐酸，再加入300mL乙醚搅拌，4-氨基苯甲酸甲酯沉淀用乙醚洗涤，空气中干燥后，再加入IOOmL 2M NaOH溶液，并将混合物用IOOmL CH2Cl2萃取，再向其中加入IOOmL饱和NH4Cl溶液稀释，将有机层用MgSO4除水，再蒸干；粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯体积比1:4的混合溶剂作洗脱液，最终得4-氨基苯甲酸甲酯；b、4-甲酸氨苯甲酸甲酯的制备氮气保护条件下将1. 02g 4-氨基苯甲酸甲酯溶于3. 4mL甲酸和8. 5ImL乙酸，在50°C 下搅拌2h后，反应物减压干燥；产物用乙醚和正己烷洗涤，室温下真空干燥过夜，得产物 4-甲酸氨苯甲酸甲酯；c、4-异氰基苯甲酸甲酯的制备\1. 07g 4-甲酸氨苯甲酸甲酯，ImL无水三乙胺和3mL无水CH2Cl2置入带有回流冷凝气的三口烧瓶中，温度维持在-30°C，0. 2mL氯甲酸三氯甲酯溶于CH2Cl2加入反应物中，0°C 搅拌反应lh，再在20V反应0. 5h，加入50mL质量浓度7. 5%碳酸氢钾水溶液，将有机层用 MgSO4除水，再蒸干，粗产物用硅胶色谱纯化，正己烷乙酸乙酯体积比3:1作洗脱液，最终得4-异氰基苯甲酸甲酯；d、4-异氰基苯甲酸钠的制备\4_异氰基苯甲酸甲酯棕色固体0.654g溶解于1.8mL乙醇，再加入8. 3mL IM NaOH溶液，混合物于氮气保护下0°C反应1. 5h，收集沉淀，乙醇洗涤，室温下真空干燥过夜，最终得 4-异氰基苯甲酸钠；e、聚4-异氰基苯甲酸钠的制备·4-异氰基苯甲酸钠l.OOg置于反应瓶中，氮气保护下加入11.8mL超纯水、0. 2mL 0. 3M NiCl2 · 6H20,过夜反应，沉淀用甲醇洗涤，真空干燥，得聚4-异氰基苯甲酸钠；f、聚4-异氰基苯甲酸的制备·0. 9g聚4-异氰基苯甲酸钠置于IM HCl溶液中，得聚4-异氰基苯甲酸；(2)半抗原修饰螺旋聚合物·1 μ L碳化二亚胺EDC和2. 4mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo-NHS加入到0. 5mL 100 mg/mL的步骤(1)合成的聚4-异氰基苯甲酸水溶液中，反应10-15 min活化，活化后的聚 4-异氰基苯甲酸加入Img新霉素，室温反应4h，透析除去未反应的药物小分子；得聚4-异氰基苯甲酸-新霉素复合物，即为半抗原修饰螺旋聚合物；(3)金纳米粒子偶联抗体IOmL 20nM 8nm金纳米粒子溶液，加入200 μ L 100 μ g/mL新霉素抗体， 0. IM K2CO3调节 PH值为8. 0，反应Ih ；得金纳米粒子偶联抗体；(4)新霉素传感器的建立ImL 20nM步骤(3)合成的金纳米粒子偶联抗体加10 μ L 100mg/mL步骤(2)合成的半抗原修饰螺旋聚合物，加入0. Ι-lOOng/mL新霉素标准品，反应Ih后，取组装好的体系100 μ L 于比色皿中，用水做空白对照，圆二色谱仪扫描波长200-800nm⑶值。
全文摘要
一种测定新霉素的螺旋免疫组装传感器的构建方法，属于材料化学技术领域。本发明包括水溶性螺旋聚合物的制备，半抗原修饰螺旋聚合物，抗体偶联金纳米粒子，新霉素传感器的建立。本发明提供一种水溶性螺旋聚合物聚4-异氰基苯甲酸，通过免疫识别(新霉素半抗原修饰螺旋聚合物)与金纳米粒子(偶联抗体)组装，通过组装后产生的圆二色谱(CD)信号对新霉素进行检测。
文档编号G01N33/53GK102435727SQ20111027948
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者王利兵, 胥传来, 许宙 申请人:王利兵, 胥传来, 许宙