专利名称：钠(离子)诊断/测定试剂盒及钠(离子)浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钠(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠 (离子)浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
血清中钠离子含量(简称"血钠")在临床上有着非常重要的意义，医学
上有三个决定水平，依次为水平1——115mmo1/1，水平2——B5mmo1/1， 水平3——150mmo1/1。当患者血钠浓度等于或低于水平1时，可出现神志不 清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状，表明机体内水的比例大于钠， 应采用相应治疗措施；当血钠浓度低于水平2时，应查找低钠血症的原因， 进一步测定血清渗透压、血钾并进行尿液分析，以确定诊断；当血钠浓度高 于水平3时，应检查其它试验项目，寻找导致高钠血症的原因。
现有技术中测定钠离子含量的常用方法有火焰光度计法、离子选择电 极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。
火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、尿液、 脑脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一种发射光谱分析法，其结果准确可靠， 广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较 大， 一般不采用。现在主要使用内部标准法，即向标本及标准液中加进相同 浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操作时，将含锂的溶液作为稀释液， 同时测定K+、 Na+和Li+的浓度，以标本与标准液的1^+/0+与&+/1^+比值， 计算Na+、 K+浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以 忽略不计。
离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极，在专用 仪器上进行血清和尿等体液中的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，
4几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子选择电极与参比电极组 合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有①玻璃 膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电 极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有C卜电极
和F-电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有Ca2— 电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为 电极使用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法 应用也较为普遍，但是电极成本昂贵。
此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作为离 子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子有未共用电子 对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子， 从而达到测出离子浓度的目的；原子分光光度法也可用于检测血清中K+、 Na + ，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
酶法测定钠离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法都有较 好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析仪不能同时测 定钠离子和钾离子各自的含量，导致这种方法不能得到推广应用。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酉每比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联 法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钠(离子)浓度的方法，同时，本 发明还将给出用以实现该方法的钠(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不 仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钠(离子)浓度 测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明钠(离子)浓度测定方法原理如下
乳糖+水 13-半乳糖苷酶/>^+葡萄糖+半乳糖葡萄糖+磷酸根葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水 葡萄糖-6-磷酸+辅酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡糖酸内酯磷酸+
还原型辅酶
这种方法应用需要钠离子激活的卩-半乳糖苷酶(f3-galactosidase ; EC 3.2丄23)具有乳糖酶(lactase ; EC3.2丄108)的特性，酶(偶)联葡萄糖-6-磷 酸酶(glucose-6-phosphatase ; EC 3.1.3.9)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.49)酶促反应速率比色法。在 钠离子的激活下，P-半乳糖苷酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合 葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没 有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原 型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度， 可以测算钠(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钠(离子)诊断/测定试剂
盒较为理想
缓冲液画mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶10000U/L
葡萄糖-6-磷酸酶12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶12000U/L
， 藩20 mmol/L
磷酸根5 mmol/L本发明的钠(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷酸根。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、磷酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸
脱氢酶。
辅酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷 酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖、磷酸根。 试剂2
缓冲液、稳定剂、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、(3-半乳糖苷酶。 辅酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷 酸根在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钠(离子)浓度的方法，其辅酶
可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶 10000 U/L
葡萄糖-6-磷酸酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 12000 U/L
乳糖 20 mmol/L
磷酸根 5 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠(离子)样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左 右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
辅酶
乳糖
50 mmol/L 3 mmol/L
20 mmol/L 5 mmol/L
试剂2
二 ^始
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 P-半乳糖苷酶 葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
50 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钠(离子)样品与试剂
1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大
约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大
9实施例三
本实施例的钠(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括:
试剂1
=f餘
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
乳糖 磷酸根
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
葡萄糖-6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
试剂3
稳定剂
(3-半乳糖苷酶
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
试剂全
配好后，分装入瓶，制成液体」
500 mmol/L 10000U/L
:试剂，可以直接使用
测定钠(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时
间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测钠(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪
10下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪
器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.021;吸光度 时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可 达50—200mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测 试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.00016 ± 0.00008 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足 以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的钠(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下乳糖+水 <u>β-半乳糖苷酶/Na</u><u>+</u> 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+磷酸根 <u>葡萄糖-6-磷酸酶</u> 葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖-6-磷酸+辅酶 <u>葡萄糖-6-磷酸脱氢酶</u> 葡糖酸内酯磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钠(离子)的浓度大小测定结果。
2 一种钠(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1——6 mmol/L(3-半乳糖苷酶IOOO-——80000 U/L葡萄糖-6-磷酸酶1000——80000 U/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1000———80000 U/L乳糖l一50 mmol/L磷酸根1—50 mmol/L如果使用磷酸缓冲液，则不需要另外加磷酸根成分。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶、乳糖、磷酸根组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷酸根组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、乳糖、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、P-半乳糖苷酶、 葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成。辅酶、P-半乳糖苷酶、葡萄 糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷酸根在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、磷酸根组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、 辅酶、乳糖、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、葡萄糖-6-磷酸酶、 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、P-半乳糖苷酶组 成。辅酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳糖、 磷酸根在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钠(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1—4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钠(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钠(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乳糖、磷酸根、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钠(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464355SQ200710192148
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司