专利名称：一种龙血竭的生物活性检测方法
技术领域：
本发明涉及到医药，特别是一种龙血竭的生物活性检测方法。
背景技术：
现行中药的质量控制所采取的手段为对部分指标性成分定性或者定量检测，但由于中药中成分复杂，药效物质不明确，使得这种检测方法难以保证中药质量的稳定性，且难与药物的安全性和有效性相关联。2010年版《中国药典》大纲中指出中药的质量标准体系应由单一指标性成分定性定量向活性及生物测定的综合检测过渡。龙血竭为百合科植物剑叶龙血树Dranaena co chinchinensis (Lour. ) S. C. Chen的含脂木材经提取得到的树脂，具有活血散瘀，定痛止血，敛疮生肌等功效，用于跌打损伤，瘀血作痛，妇女气血凝滞，外伤出血，脓疮久不收口等症。目前龙血竭的质量标准主要是对龙血素B含量进行测定，而龙血竭本身化学本底比较复杂，且其中的剑叶龙血素A、龙血素B和3，4' - 二羟基-5-甲氧基二苯乙烯，经现代药理学研究证实均有一定的药效活性。因此，龙血竭的质量控制标准与药效的相关性有待于进一步研究。生物活性测定法适用于成分多样，结构复杂，理化测定不能反映生物活性和疗效的中药。因此，建立龙血竭的生物测定方法，作为化学测定方法的补充，可以从整体体现药效，完善现行的质量控制方法和标准。

发明内容
针对上述情况，本发明旨在建立一种基于生物活性检测的龙血竭质量控制方法。本发明是由以下方案实现的
1.供试品的制备将龙血竭粉碎，粉末于容器中加乙醇超声提取，离心取上清液水浴挥干乙醇，再将粉末使用二甲基亚砜制成梯度浓度溶液，作为供试品备用，龙血竭对照药材相同方法处理作为工作对照品；
2.血浆复钙时间(PRT)测定取家兔静脉血，使用枸橼酸钠抗凝，离心获得贫血小板血浆(PPP)，在试管中与同体积龙血竭二甲基亚砜溶液相混合，加入氯化钙溶液，水浴并定时倾斜试管观察，发现纤维蛋白，记录时间为血浆复钙时间(PRT)；
3.按照下列公式计算凝血时间缩短百分比
RP=(空白对照PRT-供试品PRT) +空白对照PRTX 100% ；
以RP值为纵坐标，药物浓度对数作为横坐标，寻找线性较好的剂量范围，依据《中国药典》2010版二部附录XIV生物检定统计法进行效价计算；
4.血小板聚集抑制率(AIR)测定取家兔静脉血，枸橼酸钠抗凝，离心获得富血小板血浆(PRP)，混入龙血竭药液后，加入二磷酸腺苷(ADP)溶液放入血小板聚集仪中，测定2分钟后血小板聚集率(AR)，并计算血小板聚集抑制率；血小板聚集抑制率(AIR)=(空白对照血小板聚集率-供试品血小板聚集率)+空白对照血小板聚集率X 100%;
5.以AIR为为纵坐标，药物浓度对数作为横坐标，寻找线性较好的剂量范围，依据《中国药典》2010版二部附录XIV生物检定统计法进行效价计算。


图I为供试品与工作对照品血浆复钙时间缩短率比较图 图2为供试品和工作对照品血小板聚集抑制率比较图
具体实施例方式下面通过实施例详细说明本发明。
现代药理研究表明龙血竭在治疗中医血症方面具有双向调节作用既能改善机体微循环，活血化瘀，又增加体内凝血因子，对出血患者有显著止血作用。本发明使用下列仪器与试剂离心机，湘智离心机厂，TGL16M型；分析天平，梅特勒托利多上海有限公司，PL203型；超声提取仪，宁波海曙五方超声设备有限公司，WF-500E型；血小板聚集仪，美国，AC9000型。二磷酸腺苷钠盐，氯化钙，乙醇，二甲基亚砜均为市售分析纯。
本发明实施具体步骤
一.供试品和工作对照品的制备
1.市售芒果牌龙血竭低温粉碎，过40目筛；
2.供试品粉末5g于锥形瓶中加入40mL乙醇，常温超声提取25分钟，所得提取液使用滤纸过滤，滤液60°C水浴挥干乙醇，称量干燥物重量，计算回收率；
3.干燥物溶入二甲基亚砜中，制备成相当于生药128mg/mL浓度的溶液，连续稀释获得64，32，16，8，4mg/mL浓度的溶液；
4.将龙血竭对照药材(编号121252)，按供试品处理方法处理，作为工作对照品。二.血浆复钙时间缩短率测定
1.血浆的制备家兔耳缘静脉血,取I.8mL与O. 2mL 109mmol/L枸橼酸钠在直径IOmm塑料试管内充分混合，2500r/min离心15min，取上清液即为所需血浆；
2.25mmol/L氯化|丐溶液称取O. 138g氯化|丐，加蒸懼水至50mL溶解,得到25mmol/L氯化钙溶液；
3.直径IOmm塑料试管中将血浆与不同浓度的龙血竭溶液各O.ImL混合均匀，37°C预热3min。加入O. ImL预热到37°C的上述氯化I丐溶液，启动秒表计时，缓慢倾斜试管混合，见到纤维蛋白丝出现，记录时间，为血浆复钙时间PRT，空白对照管使用O. ImL 二甲基亚砜代替龙血竭溶液测定方法相同，记录凝血时间，按照下面公式计算血浆复钙时间缩短率
RP=(空白对照PRT-供试品PRT) +空白对照PRTX 100% ；
4.处理与效价计算
(I)效价计算
为方便计算，约定工作对照品效价为lU/mg生药，采用量反应平行线法(2 · 2)(依据《中国药典》2010版二部附录XIV生物检定统计法)对供试品与工作对照品进行比较，按如下要求工作对照品(Ps)和样品(Pt)相邻高低剂量组的比值(r)要相等，r为1:0.5，Iogr=I,各剂量组的反应个数(m)应相等；测定计算得出RP值如下表
权利要求
1.一种龙血竭的生物活性测定方法，包括以下步骤(1)供试品制备方法龙血竭低温粉碎，过40目筛，粉末5g加入40mL乙醇，常温超声提取25分钟，所得提取 液使用滤纸过滤，滤液60°C水浴挥干乙醇，称量干燥物重量，计算回收率，干燥物溶入二甲 基亚砜中，制备成相当于生药128mg/mL浓度的溶液，按照浓度比1:0. 5连续稀释获得不同 浓度的溶液；(2)工作对照品的制备方法龙血竭对照药材，按供试品相同方法处理，获得工作对照品；(3)分别进行龙血竭止血效价和活血效价的测定。
2.根据权利要求1所述的生物活性测定方法中止血效价实验，其特征在于(1)血浆的制备家兔耳缘静脉血，取1.8mL与0.2mL 109mmol/L枸橼酸钠在直径10mm 塑料试管内充分混合，2500r/min离心15min，取上清液即为所需血浆；(2)血浆复钙时间的测定直径10mm试管中将血浆与不同浓度的龙血竭溶液各0.lmL 混合均勻，37°C预热3min,加入0. lmL预热到37°C的25mmol/L氯化f丐溶液,启动秒表计时， 缓慢倾斜试管混合，见到纤维蛋白丝出现，记录时间，为血浆复钙时间PRT，空白对照管使用 0. lmL 二甲基亚砜代替龙血竭溶液；(3)按照下面公式计算血浆复钙时间缩短率RP=(空白对照PRT-供试品PRT)+空白 对照 PRTX100%。
3.根据权利要求1所述的生物活性测定方法中活血效价实验，其特征在于(1)血浆制备血浆制备取家兔耳缘静脉血，按体积比1:9加入3.28%枸橼酸钠抗凝， 500r/min离心5min,取上清液为富血小板血衆(PRP);继续离心,3000r/min离心lOmin,取 上清液为贫血小板血浆(PPP);(2)加样和检测取测定管放入搅拌珠，加PPP200i!L，预热后对凝聚仪进行调零；受试 药管加入PRP 180 u L、药液20 u L，空白对照管加入PRP180 u L、DMS020 u L ;分别预热5min 后，加入lOiiL 0. 04mol/L ADP磷酸缓冲盐溶液(pH7. 4)，2min后，记录并计算血小板聚集 抑制率；(3)按照下面公式计算，血小板聚集抑制率(AIR)=(空白对照血小板聚集率-供试品 血小板聚集率)+空白对照血小板聚集率X100%。
4.根据权利要求2、3中所述的效价测定方法中使用的剂量设置和统计方法，其特征在于依照《中国药典》2010版二部附录XIV生物检定统计法，采用量反应的平行线测定法 (2 2)法进行供试品与对工作对照品效价的对比检定设定工作对照品的效价为1. OU/mg 生药，剂量组之间浓度比r为0. 5，各剂量组反应个数m相等。
全文摘要
本发明涉及一种龙血竭的生物活性测定方法，实现了对龙血竭复杂成分的整体药效进行控制。方法是将龙血竭粉碎于乙醇中超声提取，提取物干燥后使用二甲基亚砜溶解获得溶液后，连续稀释，活得等比浓度的溶液；分别测定龙血竭的血浆复钙时间缩短率和血小板聚集抑制率，按照《中国药典》第二部附录ⅩⅣ量反应平行线法(2·2)进行效价计算。本发明操作简单易行，测试准确，可以用做有效成分不明确的龙血竭药物整体药效质量控制。
文档编号G01N33/15GK102662037SQ201210154479
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者宋美芳, 李光, 李学兰, 李宜航, 赵俊凌, 陈曦, 马小军 申请人:中国医学科学院药用植物研究所云南分所