专利名称：玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法
技术领域：
木发明涉及一种酶联免疫检测方法，特别是涉及一种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
玉米(内州)萎蔫病又称玉米细菌性萎蔫病(Goss' s bacterial wilt and blight of maize,67sw'& "er啦'c力i^3/7e/7sis subsp. /;eZv^s^e/757'50，是一禾中可以造成严重玉米损失的植物病害。1969年，该病首次在美国内不拉斯加州道森县发生，之后陆续蔓延到克罗拉罗州、伊利诺斯州、爱荷华州、肯萨斯州、密歇根州、明尼苏达州，内布拉斯加州、南达科他州和威斯康星州，至2000年己经扩散至加拿大的安大略湖区。萎蔫病的危害性和分布区域的扩张蔓延引起人们的高度重视，欧盟、加拿大等国都己经建立了该病的风险评估体系。我国于2007年5月将该病菌列入最新修订的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
玉米细菌性萎蔫病有两种主要表现形式， 一为叶片萎蔫，二为系统枯萎。该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐色，与叶脉平行，表面常有细菌溢脓。系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。玉米幼苗和成株均可发病。细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵染或者细嫩植株的根和茎杆系统侵染引起发病。苗期侵染引起萎蔫、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有吋有黑色斑点，最后干枯。
酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是实施生物检测(涉及包括人类病原菌，动植物病原菌，生物毒素，农兽药残留，蛋白质，DNA等多种/类生物体和化合物)的最为行之有效和重要的手段之一。鉴于生物素-亲和素反应体系的高亲和力和高特异性，近些年在ELISA检测中得到广泛重视。目前，国内外尚未见玉米细菌性萎蔫病菌ELISA检测研究的报道，建立灵敏、稳定的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素ELISA检测方法(biotin-avidinELISA)是玉米检疫的迫切要求。

发明内容
本发明的目的是建立一种满足特异性和高灵敏的多克隆抗体的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，并研制出试剂盒，为玉米细菌性萎蔫病菌检测提供一种高效、简便的技术手段。
4一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，所述多克隆抗体的效价在IO"以上；所述多克隆抗体采用间接ELISA法测定其特异性，其与2株玉米细菌性萎蔫病菌(ATCC 27822， ATCC33114)表现强烈反应，而与相关的其他11个病原细菌种或亚种无交叉反应，供试细菌菌体浓度为lx108—9 cfu/mL。
本发明的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤
(1) 制备免疫原供试的玉米细菌性萎蔫病菌接种于液态NBY培养基上，28 'C下恒温振荡培养，在细菌生长对数期收集菌体；12000 g离心10分钟，倒去上清液，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬，比浊法计数并定溶菌体浓度到lxlOs lxl09cfu/raL，制得细菌菌体悬液；
(2) 动物免疫取上述菌悬液按常规免疫方法对供试家兔进行免疫操作后，采集血清，并分装后于-2(TC下保存；
(3) 纯化抗体从上述血清中筛选出效价表现最高的抗血清(效价在10—4以上)进行纯化，抗体浓度定溶为l.O mg/mL,即得抗玉米细菌萎蔫病菌多克隆抗体。
本发明的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，所述步骤(3)中抗血清的纯化方法为硫酸铵沉淀法和Protein A柱亲和层析法。
--种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，包括以下步骤将上述的多克隆抗体进行生物素标记，制备样品提取液或菌悬液，然后在微孔板上包被样品提取液或菌悬液，之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素和PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405 nm下的吸光度值。
其中所述检测方法以健康玉米粉悬浮液作为阴性对照，玉米细菌性萎蔫病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。样本吸光度值与其所含玉米细菌性萎蔫病菌含量成正相关，采用P/N》2. 0作为阳性结果的判定标准。
其检测灵敏度达到lx106 cfu/mL。
本发明的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其中所述抗体进行生物素标记的方法为取1.0mg/mL的lmL抗体(IgG)用CBS缓冲液4°C下透析过夜，期间换3次缓冲液，加入100 ul标记试剂在室温下反应30 min，然后加入100 ul 1M Tris/HCl终止反应，用0. 85% NaCl缓冲液4"C下透析过夜，期间换3次缓冲液，得到生物素标记的抗体；其中所用的标记试剂为1 mg生物素与1 mL二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)充分溶解得到的。
其中所述样品提取液的制备方法为取30g玉米籽粒样品用无菌水冲洗3次，在300ml碳酸缓冲液中浸泡过夜，然后将种子研磨破碎，获得浓度为C. 1 g/mL的玉米组织悬浮液；所述菌悬液的制备方法为将玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉用无菌水制备成 lX10gCfU/mL的菌悬液，将等体积的此菌悬液与上述玉米组织悬浮液混合，形成5Xl()8cfu/mL 样品液，再通过倍比稀释分别配成lx108， 5X107， 107， 5X106， l(f， 5X10S， 105cfu/mLW
菌悬液。
一种根据所述的检测方法组建的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测试剂 盒，可供200孔检测用，使其包含下述组分
A、 检测抗体用生物素标记的上述的玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体；
容量0. 125mL 使用浓度0. 1 mg/mL 稀释倍数1:200
抗体液含量0.5 ug/mL 防腐剂0.05% NaN3贮藏4 。C下6个月
B、 酶标链霉亲和素复合物；
容量0.05 raL(含0.05°/。 NaN3) 稀释倍数1:500 贮藏4 。C下6个月
C、 IO倍PBST浓缩液1:10稀释后，用于稀释检测抗体、酶标链霉亲和素和洗涤酶标板； 规格60 mL/瓶 贮藏室温
D、 IO倍碳酸缓冲液(CBS) : 1:10稀释后，用于样品提取和配制封闭液； 规格60 mL/瓶 贮藏室温
E、 封闭液用1倍CBS配制的0.5 % (w/v) BSA或2% (w/v)脱脂奶粉；
F、 底物对硝基苯磷酸盐(PNPP)片剂5 mg/片；
G、 5倍底物缓冲液1: 5稀释后，用于配制显色液，pH9.8;
组分0.5 mol/L二乙醇胺缓冲液
规格10 mL/瓶 贮藏室温
H、 显色液用底物缓冲液配制的PNPP溶液，lmg/mL，现配现用；
I、 终止液2M NaOH溶液；
规格50 mL/瓶 贮藏室温
J、阳性对照玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉； K、阴性对照健康玉米籽粒粉。
本发明提供的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法及其检测试剂盒，其 中多克隆抗体的制备是用病原细菌注射免疫大白兔并经筛选获得，抗体效价在10—4(1: 10000) 以上；抗体与玉米细菌性萎蔫病菌有特异性反应，而与供试的其他病原细菌种/亚种无交叉反 应；抗体纯化后进行生物素标记，建立了生物素-亲和素间接ELISA (BA-ELISA)，检测灵敏 度达到lxl(fcfu/mL。现在通常的碱性磷酸酶标抗体式间接ELISA采用多克隆抗体直接作为检 测抗体或者用经碱性磷酸酶标记的多克隆抗体作为检测抗体，再加入通用的碱磷酶标羊抗兔
6IgG和/或PNP底物显色，而本发明提供的间接BA-ELISA的检测灵敏度比之提高了 5-10倍。
具体实施例方式
为进一步说明本发明，结合以下实例具体阐述-
1. 免疫原制备
供试玉米细菌性萎蔫病菌接种于液态NBY培养基上，28。C下恒温振荡培养，在细菌生长 对数期收集菌体，12000 g下离心10分钟，倒去上清液；沉淀菌体再用无菌磷酸盐缓冲液(PBS) 复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬，比浊法计数并定溶菌体浓度到lx108—9cfu/mL。
NBY培养基
牛肉汁 8 g
酵母膏 2 g
K2HP04 2 g
KH2P04, 0. 5 g
葡萄糖 5 g
MgS04. 7H20 0. 25 g
双蒸水(ddH20) 1000 mL
PBS缓冲液0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4
NaCl 8.0 g
KC1 0.2 g
KH2P04 0.2 g
Na2HP04 12H20 2 . 9 g
双蒸水(ddH20) 1000 mL
2. 动物免疫
取3 mL菌悬液(lxl08"cfu/mL)与等体积的弗氏完全佐剂混和，乳化后对供试家兔进行背 部皮下多点注射，两周后进行第一次耳缘静脉采血。第一次采血三天后进行第二次注射免疫 (方法同)，二免是用等体积的弗氏不完全佐剂，乳化后同上进行背部皮下多点注射。两周后 进行第二次耳缘静脉采血，三天后进行第三次免疫，三免与二免的方案相同；再两周后处死 动物，采集全部血清，并分装后于-2(TC下保存。
3. 抗体纯化
1)硫酸铵沉淀法
取2 mL备用抗血清,在4。C下lOOOOXg离心30min，保留上清液；向血清中边搅拌边缓 慢加入等体积的3.9 M饱和硫酸铵溶液。溶液在4t:下搅拌过夜，以使蛋白质充分沉淀。抗
7血清悬液同上离心，弃去上清液保留沉淀。沉淀物用少量ixPBS复溶，然后放入透析袋中对 PBS透析过夜，每隔约6 h更换一次透析液。收集初步纯化的抗体，待进一步纯化备用。 2)亲和层析法
Protein A柱(规格:1 mL)、交联缓冲液(MAPS II binding buffer)和洗脱缓冲液(MAPS II elute buffer)'均购自Bio-Rad公司。
A. 平衡柱体用O.Ol mol/L PBS洗脱柱子直至基线；
B. 上样吸附将以上抗体缓慢加入柱床-，
C. 洗脱杂蛋白用约5倍柱体积的MAPS II binding buffer冲洗层析柱；
D. 解吸附和收集用5倍柱体积的MAPS II elute buffer洗脱抗体，边洗脱边收集；
E. 柱的清洗和保存用约5-7倍柱体积50%甲醇冲洗(流速3ml/min),再用约8倍柱体积 的0. 1 N NaOH冲洗，然后用去离子水和20%乙醇冲洗2-3次并最后保存在20%乙醇中。
4.抗体交叉反应测定
采用通常的间接ELISA法测试了抗玉米细菌性蒌蔫病菌多克隆抗体的免疫反应性，结果 表明，本抗体对目标玉米萎蔫细菌反应强烈，而对供试的其它11种/亚种病原细菌无交叉反应。
供试病原细菌①玉米细菌性萎蔫菌C/avz'6a"er /M/c/r/ga"eraa subsp. we6rai^era^ (No.27822, No.33114，来自美国菌种保藏中心ATCC)，②玉米细菌性茎腐病菌￡rvW"/fl t'"ratovora subsp.caratovora (No. 12104，中国农科院植保所)，③玉米细菌性褐斑病菌 尸re"i/omo"flw sjr/wg"e pv.^n'"gae (No.12056，中国农科院植保所)，④玉米细菌性叶疫病菌 4cWovoracave朋e subsp.ave"ae (No丄1726，中国普通微生物保藏中心)， 玉米细菌性叶 斑病菌Xa"Ao"zo"ascaw/ eWr&pv./zo/"'co/fl(No. 1.1510,中国普通微生物保藏中心)， 玉米 细菌性枯萎病菌WewaW!' subsp.Wewwrt;(No.0085,来自南京农业大学植保系)，⑦苜 蓿细菌性萎蔫病菌am^wc/CT" m/cWga"e/w/j subsp. z'ra/力o^^ (No. 1.1908,中国普通微生物保 藏中心)'⑧番施溃疡病菌C7avz力acto"附/c/H'ga"e"5^ subsp.附z'cWgawera/s (No.12103，中国农 科院植保所)，⑨马铃薯环腐病菌C/av/6a"erm!'c/H'ga"era" subsp. ^/pectom'ctw (No.12057， 中国农科院植保所)，⑩小麦棒形杆菌C/OT沾ac^/a"g/KNo丄1909, 1.1999， 1.2000，中国普 通微生物保藏中心)。
间接ELISA操作步骤
1) 菌体包被供试病原细菌用CBS缓冲液稀释定溶到lx108—9cfu/mL，每孔100 uL加入到 酶标板上，每个菌株重复3孔，4"C下过夜包被；
2) 封闭弃去反应孔上清液，PBST冲洗3次(3 min/次)，每孔加入200 2% BSA (牛
8血清蛋白，bovine serum albumin), 37°C下封闭1 h;
3) 检测抗体同上处理和冲洗，每孔加入100 A玉米萎蔫细菌抗体，工作浓度为1. 0 ug/mL， 37T下反应1 h;
4) 酶标抗体同上处理和冲洗，加入碱性磷酸氧化酶标记羊抗兔IgG (Sigma公司)，按 1: 5000倍稀释，每孔加入IOO PL, 37"C下反应1 h;
5) 显色同上处理和冲洗，每孔加入100叱PNP显色液，室温下反应30 min，用酶标仪
读取波长在405 nm下的吸光度值(optical density, OD);
6) 判定标准测试菌OD值/目标菌OD值，小于10%确定为无交叉反应，大于并等于10%
表现为有弱交叉反应；大于30%可确定为有交叉反应(抗体对该测试菌不能用)。
CBS缓冲液0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6
Na2C03 10 g
Na跳， 10 g
ddH20 1 000 mL
PBST冲洗液l倍磷酸盐缓冲液，pH 7.4
NaCl 8.0 g
KC1 0. 2 g
KH2P04 0.2 g
Na2HP0412H20 2. 9 g
吐温20 1 mL
歸< 0. 2 g
双蒸水(ddH20) 1000 mL 5.抗体生物素标记
1) 准备生物素X-NHS-Biotin (Sigma公司)
溶剂二甲基甲酰胺(dimethylformamide， DMF， HC0N(CH3)2),
或者二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO, (CH3)2S0) 标记试剂称取1 mg生物素与1 mL DMF或DMSO充分溶解 交联缓冲液10 g NaCl, 10g NaHCO" 1000 mL H20， pH 7.5 1M Tris/HCl: 121 g Tris + 1000 ml H20,用2N HC1调pH 7.4 盐水(saline): 0.85% NaCl
2) 标记取lmL IgG (lmg/mL)在交联缓冲液中透析过夜(4°C，期间换3次缓冲液)，然后加
9入100 ul标记试剂在室温(RT)下反应30 min,再加入100 ul 1M Tris/HQ终止反应，最 后在saline缓冲液中透析过夜(4°C,期间换3次缓冲液)，分装保存。
6. 样品检测
取30 g健康玉米籽粒用无菌水冲洗3次，在300 ml碳酸缓冲液中浸泡过夜，然后将种子研 磨破碎，最终获得浓度为1 mg/mL的玉米组织悬浮液。将等体积的菌悬液(lxlOVfu/mL)与 玉米组织悬浮液混合，形成5Xl(fcfu/mL样品液，再通过倍比稀释分别配成lx108， 5X107， 107， 5Xl(f， 10\ 5X105, lCfcfu/mL的菌悬液。以健康玉米籽粒提取液作为阴性对照，萎蔫 病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。结果表明，该BA-ELISA的最低检测限达到1X106 cfu/mL。
间接BA-ELISA操作步骤
1) 菌体/样品包被将以上菌体悬浮液加入酶标板，100 uL/孔，4 T下过夜包被；
2) 封闭弃去反应孔上清液，PBST冲洗3次(3 min/次)，每孔加入200叱2% BSA (牛血 清蛋白，bovine serum albumin), 37 。C下封闭2 h;
3) 生物素标记抗体同上处理和冲洗后，加入生物素标记抗体(h 500倍稀释)，每孔100叱， 37 "C下反应1 h;
4) 酶标亲和素同上处理和冲洗，每孔加入IOO叱碱性磷酸酶标-链霉亲和素(1: 5000倍 稀释)，37"C下反应1 h;
5) 显色同上处理和冲洗，每孔加入100叱PNPP显色液，室温下反应30 min，用酶标仪 读取波长在405 nm下吸光度值(optical density, OD)。
7. 检测玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫试剂盒的组建
组建玉米细菌性蒌蔫病菌酶联免疫检测试剂盒，可供200孔检测用，使其包含下述组分
A检测抗体(detection antibody, biotin-antibody) 用生物素标记的玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体 容量0. 125mL 抗体液含量0. 5 ug/mL 稀释倍数1:200
使用浓度0.1 mg/mL 防腐剂0.05% NaN3贮藏4 。C下6个月
B碱性磷酸酶标记链霉亲和素复合物(str印tavidin-AP conjugate)
容量0.05 mL(含O. 05% NaN:,) 稀释倍数1:500 贮藏4 。C下6个月
C IO倍PBST浓縮液(1:10稀释后，用于稀释检测抗体、酶标链霉亲和素、洗涤酶标板) 规格60 mL/瓶 贮藏室温
10D IO倍碳酸缓冲液(CBS， 1:10稀释后，用于样品提取和配制封闭液)
规格60 mL/瓶 贮藏室温
E封闭液用CBS配制的0.5呢BSA或2%脱脂奶粉(wt/vo1) F底物PNPP片剂(p-Nitr叩henylphosphat,对硝基苯磷酸盐，5 mg/片) G 5倍底物缓冲液(1: 5稀释后，用于配制显色液，pH 9.8) 组分0.5 mol/L二乙醇胺缓冲液 规格10 mL/瓶 贮藏室温
H显色液用底物缓冲液配制的PNPP溶液，lmg/mL(w/v,现配现用) 1终止液 (2M NaOH溶液)
规格50 mL/瓶 贮藏室温
J阳性对照玉米细菌性萎蔫病菌及培养基的冻干粉，使用时加入CBS缓冲液溶解备用 K阴性对照健康玉米粉，同法样品进行提取，离心后取上清液备用。
本发明中涉及的％如无特殊说明外，均指的是重量百分比。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作 出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1、一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，其特征在于所述多克隆抗体效价在1 x 10-4以上；所述多克隆抗体的特异性，其与2株玉米细菌性萎蔫病菌(ATCC 27822，ATCC 33114)表现强烈反应，而与相关的其他11个病原细菌种或亚种无交叉反应。
2、 权利要求l所述的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 制备免疫原玉米细菌性萎蔫病菌菌株(来自美国菌种保藏中心ATCC)接种于液态NBY培养基上，28 i:下恒温振荡培养；在细菌生长对数期收集菌体，12000g离心10分钟，倒去上清液，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬；用比浊法计数并定溶细菌菌体浓度到lxl08 lxl09cfu/mL;(2) 动物免疫取上述菌悬液按常规免疫方法对供试家兔进行免疫操作，定期采集血清，并分装后置于-2(TC下保存备用；(3) 纯化抗体从上述血清中筛选出效价表现最高的抗血清(效价在10—4以上)进行纯化，浓度定溶为l.O mg/niL，即得抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体。
3、 根据权利要求2所述的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体制备方法，其特征在于所述步骤(3)中抗血清的纯化方法为硫酸铵沉淀法和Protein A柱亲和层析法。
4、 一种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于将权利要求1所述的多克隆抗体进行生物素标记；制备样品提取液或细菌悬浮液，并包被在微孔板上；之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素和PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405 nm下的吸光度值。
5、 根据权利要求4所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，分设阴性和阳性对照，其特征在于以健康玉米组织悬浮液作为阴性对照，玉米细菌性萎蔫病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。
6、 根据权利要求5所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于其检测灵敏度达到lx106 cfu/mL。
7、 根据权利要求6所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于所述抗体进行生物素标记的方法为取lmL抗体(IgG， 1.0mg/mL)用交联缓冲液4°C下透析过夜，期间换3次缓冲液；加入100 ul标记试剂在室温下反应30 miri，加入100 ul 1MTris/HCl终止反应；然后用0. 85% NaCl缓冲液4°C下透析过夜，期间换3次缓冲液，得到标记好的生物素抗体；其中所用的标记试剂为1 mg生物素与1 mL二甲基甲酰胺(DMF)或二甲 基亚砜(DMS0)充分溶解得到的。
8、 根据权利要求7所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在 于所述样品提取液的制备方法为取30 g玉米籽粒样品用无菌水冲洗3次，在300 ml碳 酸缓冲液(CBS)中浸泡过夜，然后将种子研磨破碎，获得浓度为0. 1 g/mL的玉米组织悬浮液； 所述菌悬液的制备方法为将玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉用无菌水制备成 lxl(Tcfu/raL的菌悬液，将等体积的此菌悬液与上述玉米组织悬浮液混合，形成5X 108cfu/mL 样品液，再通过倍比稀释分别配成lx108， 5X107， 107, 5X106， 106， 5X105， 105 cfu/mL的 菌悬液。
9、 一种根据权利要求4所述的检测方法组建的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫 检测试剂盒，其特征在于供200孔检测用，使其包含下述组分A、 检测抗体权利要求1所述的经生物素标记的玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体； 容量0. 125mL 使用浓度0.1 mg/mL 稀释倍数1:200含量0.5 ug/mL 防腐剂0.05% NaN3 贮藏4 'C下6个月B、 酶标链霉亲和素复合物；容量0. 05 mL(含0.05，。 NaN3) 稀释倍数1:500贮藏4 。C下6个月C、 10倍raST浓縮液1:10稀释后，用于稀释检测抗体、酶标链霉亲和素和洗涤酶标板； 规格60 mL/瓶 贮藏室温D、 IO倍碳酸盐缓冲液(CBS) : 1:10稀释后，用于样品提取和封闭液配制； 规格60 mL/瓶 贮藏室温E、 封闭液用CBS配制的O. 5 % (w/v) BSA或2 % (w/v)脱脂奶粉；F、 底物对硝基苯磷酸盐(PNPP)片剂5 mg/片；G、 5倍底物缓冲液1: 5稀释后，用于配制显色液，pH 9.8;组分0.5 mol/L二乙醇胺缓冲液规格10 HlL/瓶 贮藏室温H、 显色液用底物缓冲液配制的PNPP溶液，lmg/mL，现配现用；I、 终止液2M NaOH溶液；规格50 mL/瓶 贮藏室温J、阳性对照玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉；K、阴性对照健康玉米籽粒粉。
全文摘要
一种针对玉米细菌性萎蔫病菌的生物素-亲和素酶联免疫检测方法，包括以下步骤制备上述的多克隆抗体、纯化并进行生物素标记；样品中细菌的提取，将样品提取液包被在微孔板上；之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素复合物及PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405nm下的吸光度值；本发明提供的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，特异性强，灵敏度高，检测灵敏度达到1×10⁶cfu/mL，操作简便快速，结果准确高效。
文档编号G01N33/531GK101498724SQ20091007761
公开日2009年8月5日 申请日期2009年1月24日 优先权日2009年1月24日
发明者斯 哈, 岭 王, 田世民, 邹明强, 涌 金, 艳 陈, 马吉湘, 齐小花 申请人:中国检验检疫科学研究院