专利名称：用于检测β-受体兴奋剂的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及ー种能识别8种0 -受体兴奋剂的单克隆抗体及酶联免疫方法和试剂盒。
背景技术：
^ 一受体兴奋剂是一组结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯こ醇胺类衍生物，能与动物体内大多数组织细胞上的￠-肾上腺素能受体结合，并激活￠-肾上腺素能受体，从而加速细胞内脂肪的分解和游离脂肪酸的氧化.因此，P —受体兴奋剂的主要功效是促进动物肌肉组织的增长，減少胴体脂肪的含量，提高瘦肉率.与此同时，可以不同程度的提高生长速度和饲料利用率。欧盟和其他ー些国家和地区立法禁止使用@ 一受体兴奋剂，我国农业部第235号公告规定禁止在动物性食品中使用。 有效控制￠-受体兴奋剂类药物滥用和残留，检测方法是关键。国内外文献中关于@ -受体兴奋剂残留检测方法，虽然仪器检测的灵敏度和准确度越来越优化和提高，但是有其难以避免的缺陷，有的提取方法繁琐，有的采用的仪器设备一般实验室少有配备(如超临界萃取)，并且检测所需时间长，不利于大批量样品的筛选，不能快速的在现场进行检測。酶联免疫分析方法(ELISA)可以克服仪器分析的缺陷，是ー种有效的大批量残留筛选方法，在此类药物上的应用有着很大的发展前景。酶联免疫分析法是将抗原抗体反应与现代测试手段结合的超微量分析法，集现代测试方法的高灵敏度和抗原-抗体反应的强特异性于一体(李俊锁等，2002)。相对于仪器分析法，免疫学分析法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性強、检测费用低等优点，适用于大批量样品的初筛。Guy等(1993)将沙丁胺醇与牛血清蛋白结合制备完全抗原，免疫新西兰大白兔后得到对沙丁胺醇等5种P -受体兴奋剂类药物偶交叉反应的多克隆抗体，其建立的酶免疫方法检测尿液样品中沙丁胺醇含量，最低检测限为0. 14ng。Lei等(2008)用沙丁胺醇为半抗原制备的单克隆抗体对沙丁胺醇、克伦特罗、特布他林、肾上腺素有交叉反应，建立的ELISA方法最低检测限可达0. 052ng/mL。上述研究中多克隆抗体的灵敏度较高，但不利于标准化；单克隆抗体虽利于标准化生产，但是灵敏度又不够，且检测的药物种类有限。因此，制备ー种灵敏度高的能用于检测多种3-受体兴奋剂的单克隆抗体和酶联免疫试剂盒，并建立相应的ELISA检测方法具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种能识别八种P -受体兴奋剂(克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、克伦丙罗、马喷特罗、特布他林和妥洛特罗)的单克隆抗体以及酶联免疫方法和试剂盒，本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测3-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在P-受体兴奋剂检测中的应用。上述目的是通过以下技术方案实现的
ー种能识别P -受体兴奋剂的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC N0:C201187的杂交瘤细胞Sal所分泌的。所述的杂交瘤细胞Sal，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCN0:C201187o所述的单克隆抗体在制备检测P -受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒中的应用。包含所述的单克隆抗体的试剂盒。所述试剂盒是用于检测￠-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在P -受体兴奋剂检测中的应用。进ー步，本发明提供了一种检测P -受体兴奋剂的酶联免疫方法，包括以下步骤

(I)将半抗原琥珀酸酐沙丁胺醇(SAL-SA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(SAL-SA-BSA)；(2)将半抗原对氨基苯甲酸沙丁胺醇(SAL-ABA)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(SAL-ABA-0VA)；(3)利用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC N0:C201187的杂交瘤细胞Sal ；(4)利用保藏号为CCTCC N0:C201187的杂交瘤细胞Sal制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)样品前处理猪尿样品加こ腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用こ酸こ酯反萃，再取こ酸こ酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物；( 7 )对步骤(6 )的待测物进行检测。所述的酶联免疫方法在P -受体兴奋剂检测中的应用。本发明的有益效果是I.本发明制备的单克隆抗体能够识别8种P -受体兴奋剂类药物，识别范围广；2.本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及建立的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的3 -受体兴奋剂类残留，同时具有精密度高、灵敏度好的特点。


图I为本发明的技术路线图。图2为本发明的以克伦特罗为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线，X轴为克伦特罗(CL)标准溶液浓度对数值，Y轴为克伦特罗标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B。)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步说明，但不限制本发明。实施例I免疫原和包被原的制备I. I沙丁胺醇免疫半抗原(SAL-SA)的合成沙丁胺醇免疫半抗原(SAL-SA)依如下路线合成称取沙丁胺醇碱SOmg (0. 33mmol)用IOmL甲醇溶解，旋转蒸发为黄色油状物，再加16mL无水こ醇溶解，并不断搅拌，然后逐滴加入丁ニ酸酐36mg (溶于吡啶溶液中，0.36mmol)。出现白色混浊后，用薄层色谱检测琥拍酸酐的结构。在室温条件下反应3h后,停止搅拌，2750r/min离心15min,弃去上清液，用无水こ醇洗涤沉淀物3次，蒸干溶剂所得白色固体即为半抗原SAL-SA。
权利要求
1.一种能识别￠-受体兴奋剂的单克隆抗体，其特征在于它是由保藏号为CCTCCN0:C201187的杂交瘤细胞Sal所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞Sal，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201187。
3.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测￠-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒中的应用。
4.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒是用于检测￠-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在￠-受体兴奋剂检测中的应用。
7.—种检测3 -受体兴奋剂的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将半抗原琥珀酸酐沙丁胺醇与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； (2)将半抗原对氨基苯甲酸沙丁胺醇与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原制备保藏号为CCTCCN0:C201187的杂交瘤细胞Sal ； (4)利用保藏号为CCTCCN0:C201187的杂交瘤细胞Sal制备单克隆抗体； (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)样品前处理猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物； (7)对步骤(6)的待测物进行检测。
8.权利要求7所述的酶联免疫方法在￠-受体兴奋剂检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别β-受体兴奋剂的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞Sal所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201187。本发明还公开了用于检测β-受体兴奋剂的酶联免疫方法和试剂盒及其在β-受体兴奋剂检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体能够识别8种β-受体兴奋剂类药物，识别范围广，本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的β-受体兴奋剂残留。
文档编号G01N33/577GK102768278SQ201210176538
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘振利, 彭大鹏, 潘源虎, 王玉莲, 章玲燕, 袁宗辉, 陶燕飞 申请人:华中农业大学