专利名称：用于检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的单克隆抗体和一种用于检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。
背景技术：
喹乙醇是喹噁啉-N-I，4- 二氧化物衍生物，化学名称是N-羟乙基-3-甲基_2_喹啉酰胺-1，4-二氧化物，具有抗菌促生长作用，广泛应用于畜牧业。毒理学研究表明，喹乙醇具有致突变、致畸和致癌性，对人和动物均能引起光敏反应。食品添加剂联合专家委员会 (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)第 36 届会议对喹乙醇的代谢途径进行了全面评价，结果表明，给药48小时后，约95%的药物随尿液和粪便排出体外，在8 20天，肌肉中MQCA的含量约占总残留的25%。在此次会议上，JECFA规定MQCA 为喹乙醇在动物体内代谢的残留标示物，在肌肉中的最高残留限量(MRLs)为4yg/kg。我国规定喹乙醇残留标示物MQCA的最大残留限量在猪肝脏为50μ g/kg，肌肉为4μ g/kg。目前，国内外关于动物组织中MQCA的检测方法很多，主要是高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等仪器分析方法，关于免疫学检测方法报道很少。Chen W等(Chen ff, Jiang Y, Zhu C Q, et al. Automated and ultrasensitive detection of methyl-3-quinoxaline-2-carboxyIic acid by using gold nanoparticles probes SIA—rt—PCR. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24 :2858-2863)报道了一种用间接竞争 ELISA 联合RT-PCR序列分析技术检测MQCA的方法，该方法灵敏度很高，在2. 5aM_250fM范围内有很好的线性关系，最低定量限I. 4aM，回收率89-108%，但是，该方法操作复杂，所需仪器设备成本较高。中国专利ZL 200610164836. O公开了一种用于3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒，该方法及试剂盒用3-甲基喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原免疫家兔得到特异性兔多克隆抗体，此抗体能特异性识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸与苯胺的反应产物，对3-甲基喹噁啉-2-羧酸原型并不能识别，因此，应用该试剂盒进行实际样品检测时，必须有一个样品衍生的过程，大大增加了检测时间和操作的复杂性，此外，该试剂盒使用的是兔多克隆抗体，不同批次的多克隆抗体的变异较大，不利于试剂盒的规模化生产与应用。相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有特异性好，灵敏度高，批间差异小，便于规模化生产等优点。因此，制备出针对MQCA原型的特异性单克隆抗体，建立基于MQCA单克隆抗体的 ELISA检测方法及试剂盒具有重要的意义。

发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能特异性识别MQCA的单克隆抗体。本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能检测MQCA的酶联免疫方法。
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本发明的第三个目的是研制适用于MQCA检测的试剂盒。本发明的第四个目的是提供所述的单克隆抗体在制备检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒中的应用。本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物组织3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留检测中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一种能识别MQCA的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10所分泌的。上述杂交瘤细胞MQCA GA/5B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :C201147。所用的免疫原是由半抗原MQCA与牛血清白蛋白偶联制备得到的。进一步，本发明提出了一种适用于MQCA残留检测的酶联免疫方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，具体如下(I)将半抗原MQCA与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；(2)将半抗原MQCA与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；(3)用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201147 的杂交瘤细胞 MQCA GA/5B10 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)将待测样品先用含10%偏磷酸的5%甲醇溶液提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水洗涤乙酸乙酯，取乙酸乙酯用氮气吹干，残渣用样品稀释液溶解，得到待测物；(7)对步骤￠)的待测物进行酶联免疫检测；步骤(6)中所述样品稀释液的组分及配比为NaCl 8. 0g、KH2PO4 O. 2g、 Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g，加双蒸水定容至 IOOOmL0本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测MQCA的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法,实现了对MQCA的酶联免疫检测。本发明的有益效果是(I)本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别MQCA原型，而专利 ZL200610164836. O只能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸与苯胺的反应产物，与专利 ZL200610164836. O公开的抗体相比，本发明的抗体特异性更强，批间差异更小，更适于批量生产。(2)检测过程中的样品处理方法简便，易操作，与专利ZL200610164836. O报道的样品处理过程相比，减少了衍生处理的过程，操作更简便。(3)本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度高、精密度好、准确性好。


图I为本发明的技术路线图。
图2为本发明MQCA残留ELISA检测方法标准曲线图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I免疫原和包被原的制备免疫原的制备准确称取MQCA 20. OOmg,完全溶解在N，N- 二甲基甲酰胺ImL中， 为A液。准确称取BSA 70. OOmg,使其充分溶解在磷酸盐缓冲液(pH7. 4) IOmL中，为B液。 磁力搅拌条件下，将A液逐滴加入到B液中，待两者混合均匀后，缓慢滴加25%戊二醛溶液 (GA) O. ImL,反应4小时。之后将反应液转入透析袋中，4°C生理盐水中透析3天，每天更换透析液3次。6000r/分钟离心5分钟，取上清液冷冻干燥，即得偶联物MQCA-GA-BSA，置_20°C 保存，作为免疫原用。包被原的制备依据免疫原制备程序，将BSA换成0VA，即得偶联物MQCA_GA_0VA， 作为包被原用。实施例2单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的制备参照薛庆善《体外培养的原理与技术》(科学出版社2001年版)中的方法以实施例I制备的偶联物MQCA-GA-BSA为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含IOOyg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100 μ g免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、 灵敏度好)停止免疫以备融合。在融合前3天(最好与上次免疫相隔3周以上)给免疫合格的小鼠腹腔注射含 IOOyg免疫原的蛋白溶液(不加佐剂)，强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3 5 X IO7个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合(比例为I : 10 5 : 10)。1500r/分钟离心5 分钟，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37 °C水浴中，将吸有O. 8mL预温至37°C的50% PEG (购自Amersco)的ImL 刻度吸管插入到管底，60秒内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90 秒，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL预温至37°C的RPMI 1640基础培养液(购自Hyclone)沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第I分钟逐滴加入lmL(3sec/滴)，第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL(5分钟内加完)。加完第一个IOmL后，接着沿管壁补加RPMI 1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次， 混匀。1500r/分钟离心5分钟，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基(购自 Amersco)轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。 一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37V 5% CO2培养箱中培养。从融合当天算起为O天，前面3天尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。 第3天每孔补加I滴HAT完全培养基并观察集落生长情况；第5天每孔吸出1/2培养上清 (100 μ L)，再加入I滴HT完全培养基(购自Amersco)；以后每隔3天同上法吸去1/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的偶联物MQCA-GA-0VA为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌MQCA抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌MQCA抗体的杂交瘤细胞。对该杂交瘤细胞进行染色体计数,平均值为 101. 3条，高于亲本细胞的染色体数目(SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条)，说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞命名为MQCA GA/5B10，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO :C201147。腹水单抗制备与鉴定在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射 O. 5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO: C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种O. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgGl亚型。实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立3. I试剂配制碳酸盐缓冲液(pH9. 6):准确称取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超纯水溶解， 定容至1000mL。洗涤液(pH7.4):准确称取 NaCl 8. 00g，KH2PO4 0. 20g，Na2HPO4 · 12H20 2.90g，KCl 0. 20g,少量超纯水溶解，加入吐温200. 50mL,定容至1000mL。磷酸盐缓冲液(pH7. 4):准确称取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20 2. 90g, KCl 0. 20g,少量超纯水溶解，定容至IOOOmL0封闭液准确称取卵清蛋白10. OOg,加入磷酸盐缓冲液IOOOmL,搅拌混匀直至蛋
白完全溶解。底物混合液准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入 100 μ L底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。终止液准确量取浓硫酸IOOmL,缓慢滴加到800mL超纯水中。3. 2方阵滴定法采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将包被原MQCA-GA-0VA倍比稀释成8、4、2、1、0. 5μ g/mL，从第一至第五行依次横向加入96孔酶标板，包被。使用磷酸盐缓冲液将单克隆抗体倍比稀释成I : 8000、1 16000,1 32000、 I 64000,1 128000,1 256000，从第一至第六列依次纵向加入96孔酶标板，做间接 ELISA0方阵滴定结果见表I，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。从表I中选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合(2， 64000)，(I，32000)和(0.5，8000)。表I MQCA GA/5B10单克隆抗体方阵滴定
权利要求
1.一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为 CCTCC NO C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO C201147o
3.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒。
5.一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下(1)将半抗原3-甲基喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；(2)将半抗原3-甲基喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCCNO C201147 的杂交瘤细胞 MQCA GA/5B10 ；(4)用保藏号为CCTCCNO C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将待测样品先用含10%偏磷酸的5%甲醇溶液提取，再用乙酸乙酯萃取，然后用饱和食盐水洗涤乙酸乙酯，取乙酸乙酯用氮气吹干，残渣用样品稀释液溶解，得到待测物；(7)对步骤￠)的待测物进行酶联免疫检测，其中样品稀释液的组分及配比为=NaCl 8. 0g、KH2PO4 O. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl0.2g,加双蒸水至1000mL。
6.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物组织3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)的特异性单克隆抗体，本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞MQCAG GA/5B10所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOC201147。本发明还公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法及试剂盒。与现有技术相比，本发明首次制备得到可识别MQCA的单克隆抗体，检测过程中的样品处理方法更加简便，易操作，具有检测灵敏度高、精密度强、准确性好等优点。
文档编号G01N33/577GK102585005SQ20121004517
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者刘振利, 周琪, 张西亚, 彭大鹏, 潘源虎, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞, 黄玲利 申请人:华中农业大学