专利名称：血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法
技术领域：
本发明属于生化检测技术领域，特别是涉及血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法。
背景技术：
近年来，随着群体蛋白质组学概念的提出和其在实际研究中的应用，实验研究和临床应用之间的距离将进一步缩短。由于人体体液中因疾病引起的蛋白质的含量及种类变化是临床上各种病症早期诊断及评价病情的重要指标，因此应用现代生物技术，寻找与疾病相关的特异性蛋白变化是当前研究的热点。然而，迄今为止能用于常规临床检测的生物标志物还非常的少。理论上，因为蛋白质的分子量较大，较难进入体液循环中，而一些蛋白
质降解后的片段，却有可能通过某种途径进入到体液或血液中。以血清为例，近年来，血清蛋白质组中的低分子量范围颇受关注。而质谱技术的迅速发展和广泛使用，又为血清蛋白质组中的低分子量范围的研究提供了有效的手段。现有的针对低分子量蛋白检测的方法一般是使用电泳等分离技术对蛋白分子量进行筛分后用富集材料将目标分析物进行富集，再辅以后续的洗脱步骤，从而进行质谱检测。这种方法步骤繁琐，且多步的分离和洗脱操作可能将微量的低分子蛋白丢失。目前，低分子量蛋白质的分析的难点主要在于1)在分离过程中容易丢失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2)在质谱鉴定过程中容易被其他高分子量蛋白质的信息掩盖；
3)更容易受到盐、表面活性剂等小分子的干扰影响质谱鉴定等。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单，灵敏度高，重现性好的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法。为此，本发明采用的技术方案是这样的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，包括以下步骤
a、根据目标蛋白分子量的大小和溶液组成，用电化学刻蚀法刻蚀一定孔径的多孔硅，将刻蚀后的多孔层从硅基底上剥离下来，进行超声破碎；超声破碎后的悬浊液经过离心干燥后，得到未经修饰的多孔硅颗粒；
b、用化学修饰法对步骤a中得到的多孔硅颗粒进行修饰，制备成可以选择性捕获蛋白质的筛分材料，使其对不同等电点的蛋白质具有特异性的捕获能力；
C、将步骤b中得到的筛分材料3 mg加入到50 uL待检血清中，低温进行振荡吸附0. 5^1h，充分作用后静置，利用多孔硅颗粒的自然沉降作用将富集了低分子量蛋白的多孔硅颗粒从溶液中分离出来；
d、从溶液中分离出的多孔硅颗粒分别用0. 2 mmol L—1的PB缓冲液和去离子水清洗，去除表面吸附的高丰度蛋白和盐类后，直接滴到MALDI靶上，室温干燥；然后将I uL有机基质溶液(2-氰基-4-羟基肉桂酸，a -CHCA)点覆在多孔硅颗粒上，室温自然干燥后将制备好的样品送入MALDI-TOF质谱仪检测；
e、根据质谱结果经数据统计处理后进行分层聚类分析，通过分析结果判断患者的病情。进一步地，步骤b中的化学修饰法具体为将多孔硅颗粒进行臭氧氧化处理5 20分钟，形成表面硅氧键；将氧化后的多孔硅颗粒浸泡在体积浓度为1%的硅烷化试剂与有机溶剂的混合溶液中反应I小时，再在烘箱中110°c干燥15分钟，蒸干后的多孔硅颗粒用乙醇浸泡洗净；根据目标蛋白的分子量选出相应孔径的多孔硅，再根据目标蛋白的性质选择相应的硅烷化试剂进行表面修饰；硅烷化试剂的种类可以采用氨基硅烷化试剂，巯基硅烷化试剂，环氧基娃烧化试剂中的一种。
更进一步地，本发明的方法还可以有以下步骤
f、余下的多孔硅颗粒可直接加入电泳缓冲液，进行凝胶电泳分析。g、使用后的多孔硅颗粒可用蛋白洗脱液洗涤后重复使用。与现有技术相比，本发明的方法具有如下有益效果
I、本发明通过制备多孔硅颗粒达到一步分离、富集和检测血清样品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔径大小可以通过电化学刻蚀条件精确控制，根据所要筛选的蛋白质分子量大小，对相应材料的孔隙率进行选择。通过表面修饰技术可以选择性的捕获低分子量生物标记物，同时将人血清中含量丰富的高分子量蛋白质和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低丰度蛋白的降解。多孔硅颗粒的制备条件选择是该分离材料性能优越的一项关键技术。2、本发明中材料的孔径可以根据带分析目标物的大小进行随意调控，并利用多孔硅表面可进行多种化学修饰，可选择性地从待测生物样品中捕获某一种类的目标蛋白质。同时，可以通过在各检测点内修饰不同的基团，进行一种试样的多维分析检测。3、本发明中富集后的颗粒进行表面清洗后无需进行额外的洗脱除盐步骤，即可进行MALDI-T0F检测，获得高质量的肽谱。检测后多余的多孔硅颗粒可直接进行凝胶电泳分析，对感兴趣的差异蛋白进行进一步的分离鉴定。避免了样品多步处理和洗脱过程所造成的损失。4、本发明的血清直接检测方法准确、方便且快捷。整个测定过程一般可以在几分钟内就全部完成，十分迅速，简单易行，且捕获特异性高，同时不会破坏所测定的蛋白质。


图I是采用本发明对患者血清样品进行直接检测MALDI-T0F-MS结果图。
具体实施例方式实施例一多孔硅的制备
取P型掺硼硅片(100)晶型，固定在电解池中，加入0. 5ml乙醇，2-3ml质量浓度为40%的氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，钼电极为阴极，进行直流电解刻蚀和脱膜，设定电流强度为l(T80mA，刻蚀时间为5分钟，刻蚀脱膜后的多孔硅层用乙醇冲洗干净后超声粉碎15分钟，再用氮气吹干，所得的多孔硅颗粒的孔径在5 20nm ；
将上述多孔硅颗粒进行臭氧氧化处理20分钟，形成表面硅氧键；
将氧化后的多孔硅颗粒浸泡在体积浓度为1%的氨基硅烷化试剂与乙醇溶剂的混合溶液中反应I小时，再在烘箱中110°c干燥15分钟，蒸干后的多孔硅颗粒用乙醇浸泡洗净； 选择孔径为10-12nm的多孔硅，用十一碳烯酸进行表面修饰。实施例二对患者血清样品的处理检测
本实施例以26%孔隙率的经过十一碳烯酸修饰的多孔硅颗粒作为富集材料，对患者的血清样品进行直接检测和分析，其具体步骤如下
I、样品吸附
本实施例的血清样品从医院获得，血清样品的制备采用医学领域技术人员的常规操作，其中5-9为直肠癌患者血清，10-14为非癌症患者血清，制备好的血清样品储存在-80°〇的超低温冰箱。吸附将的血清样品用生理缓冲液PBS稀释10倍后取50 uL加入离心管中，再加A3 mg经过十一碳烯酸修饰的孔隙率为26%的多孔硅颗粒，得到的悬浊液在室温下振荡孵·育I h。分离将上述悬浊液静置2 min，多孔硅颗粒沉降到离心管底部，用移液枪小心的移除上清液。2、样品检测
清洗在离心管中加入100 uL清洗缓冲液(0. 2 mmol L—1的PB缓冲液)，涡旋振荡混匀后将悬浊液静置2 min，用移液枪小心的移除上清液。再在离心管中加入100 uL去离子水，涡旋振荡混匀后将悬浊液静置2 min，用移液枪小心的移除上清液。检测将清洗后的多孔硅颗粒用移液枪转移到MALDI靶上，室温自然干燥，然后将I uL的有机基质溶液(2-氰基-4-羟基肉桂酸，a -CHCA)点覆在颗粒表面，室温自然干燥；将制备好的样品送入MALDI-T0F质谱仪检测。质谱检测条件激光波长337 nm，激光脉冲频率200 Hz，加速电压20 kV，检测范围(TlO kD，延迟时间为220 ns，线性正离子模式检测。回收检测完毕后将多孔硅颗粒小心的从MALDI靶上转移到离心管中，加入蛋白洗脱液(含有体积比为25%的乙腈和75%的三氟乙酸)，振荡孵育20 min,将颗粒上吸附的蛋白洗脱下来。将上述悬浊液静置2 min，用移液枪移除上清液，溶液挥发后得到的多孔硅颗粒可重新使用。检测结果参见图I。图中，横坐标表示质谱峰的质核比，纵坐标表示质谱峰的峰强度。5-9为直肠癌患者血清样品，10-14为非癌症患者血清样品，15为未处理的血清样品。对峰位置进行容差为0. 15%的对齐处理，并将峰强度进行归一化处理，把相对信号强度低于0. 5的峰记为0，相对信号强度高于0. 5的峰记为1，将筛选挑选出来的峰用SPSS软件进行分层聚类分析，分析结果说明本方法可以对血清样品中的低丰度蛋白进行直接检测，并可以初步将正常人和癌症患者区分开，只有8号一例被归入正常人中。
权利要求
1.血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，包括以下步骤 a、根据目标蛋白分子量的大小和溶液组成，用电化学刻蚀法刻蚀一定孔径的多孔硅，将刻蚀后的多孔层从硅基底上剥离下来，进行超声破碎；超声破碎后的悬浊液经过离心干燥后，得到未经修饰的多孔硅颗粒； b、用化学修饰法对步骤a中得到的多孔硅颗粒进行修饰，制备成可以选择性捕获蛋白质的筛分材料，使其对不同等电点的蛋白质具有特异性的捕获能力； C、将步骤b中得到的筛分材料3 mg加入到50 uL待检血清中，低温进行振荡吸附0.5 1h，充分作用后静置，利用多孔硅颗粒的自然沉降作用将富集了低分子量蛋白的多孔硅颗粒从溶液中分离出来； d、从溶液中分离出的多孔硅颗粒分别用0.2 mmol L—1的PB缓冲液和去离子水清洗，去除表面吸附的高丰度蛋白和盐类后，直接滴到MALDI靶上，室温干燥；然后将I uL有机基质溶液(2-氰基-4-羟基肉桂酸，a -CHCA)点覆在多孔硅颗粒上，室温自然干燥后将制备好的样品送入MALDI-T0F质谱仪检测； e、根据质谱结果经数据统计处理后进行分层聚类分析，通过分析结果判断患者的病情。
2.如权利要求I所述的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，其特征在于在步骤b中，将多孔硅颗粒进行臭氧氧化处理5 20分钟，形成表面硅氧键；将氧化后的多孔硅颗粒浸泡在体积浓度为1%的硅烷化试剂与有机溶剂的混合溶液中反应I小时，再在烘箱中110°C干燥15分钟，蒸干后的多孔硅颗粒用乙醇浸泡洗净；根据目标蛋白的分子量选出相应孔径的多孔硅，再根据目标蛋白的性质选择相应的硅烷化试剂进行表面修饰；硅烷化试剂的种类可以采用氨基硅烷化试剂，巯基硅烷化试剂，环氧基硅烷化试剂中的一种。
3.如权利要求I所述的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，其特征在于还包括步骤f，余下的多孔硅颗粒可直接加入电泳缓冲液，进行凝胶电泳分析。
4.如权利要求I所述的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，其特征在于还包括步骤g，使用后的多孔硅颗粒可用蛋白洗脱液洗涤后重复使用。
全文摘要
本发明公开了血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法，包括步骤是用电化学刻蚀法刻蚀多孔硅，超声破碎；离心干燥得到多孔硅颗粒；将多孔硅颗粒制备成可以选择性捕获蛋白质的筛分材料；将筛分材料加入待检血清中，低温振荡吸附静置，将多孔硅颗粒分离；用PB缓冲液和去离子水清洗后，直接滴到MALDI靶上，室温干燥；然后将有机基质溶液点覆在多孔硅颗粒上，室温自然干燥后将制备好的样品送入MALDI-TOF质谱仪检测；根据质谱结果经数据统计处理后进行分层聚类分析，通过分析结果判断患者的病情。本发明提供了一种操作简单，灵敏度高，重现性好的血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法。
文档编号G01N27/62GK102798658SQ20121025292
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者邬建敏, 谈洁, 赵伟洁 申请人:浙江大学