专利名称：一种输血前血液配合试验的检测方法
技术领域：
本发明是关于一种用于输血前进行血液配合试验的方法。本发明尤其是关于一种不需使用离心机即可于输血前进行血液配合试验的方法。
背景技术：
血型(blood groups)是表现人类个体的特征，是一种遗传的表现。临床上所说的血型是指红血球表面抗原构造的差异。从广义来说，血型包括红血球、白血球、血小板、血浆等血液成分不同的抗原系统。而一般常说的ABO血型，就是指血液中红血球所带的抗原种类不同而言。例如，红血球上含有A抗原的，称为A型；含有B抗原的，称为B型；同时含有A和B两种抗原的，称为AB型；既不含A抗原又不含B抗原的称为O型。
目前人类的血型系统是根据红血球所带抗原种类的不同约可分成二十多种血型系统，其包括ABO血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Rh血型系统、Kell血型系统、Lewis血型系统、Dutty血型系统、Kidd血型系统、Diego血型系统、I血型系统…等(表一)。而在这些血型系统中，与输血关系最大的为ABO血型系统，其次为其它血型系统。
若将两个体中血型不兼容的血液滴放在玻片上混合，其中的红血球即聚集成簇，这种情形称为凝集(agglutination)。当红血球的凝集发生时，有时还伴随有溶血现象。当血型不兼容的血液输入循环血液中时，在血管内亦会发生同样的情况，此凝集成簇的红血球会堵塞微血管及溶血，且将会损害肾小管，同时亦会伴发过敏反应，其结果可危及生命。
输血是对各种原因引起的失血、贫血、低血压、低血红素等患者的一种重要医疗措施，和确保一些手术得以顺利进行的重要手段。及时且正确的输血，常可使生命垂危的患者达到起死回生的作用。但是，错误的输血，也可以夺取患者的生命。输入不兼容血型的血液，如不及时发现，会产生过敏性休克或严重的溶血反应并发急性肾功能衰竭而死亡。
1901年德斯坦纳(Landsteiner)发现了第一个血型系统，即ABO血型系统，从此为人类揭开了血型的奥秘，并使输血成为安全性较高的临床治疗手段。在准备输血时，首先必须保证供血者与受血者的ABO血型相合，因为这一系统的不兼容输血常引起严重的反应。对于白种人来说，生育年龄的妇女以及需要反复输血的病人，还必须使供血者与受血者的Rh血型相合，以避免受血者在被敏感后产生抗Rh的抗体。
在临床上即使在ABO系统血型相同的人的间进行输血，在输血前必须进行交叉配血试验(cross-match test)。这样，不但可检验血型测定是否有误，亦可发现他们的红血球或血清中，是否还存在一些其它足以引起红血球凝集反应的抗原或抗体。
交叉配血中最重要的是ABO血型配合，必需ABO血型相同，且交叉配血无凝集才能输血。已知的交叉配血法是采用室温盐水配血法，这种方法的主要缺点是只能检查出不相配合的完全抗体，而不能检查出不相配合不完全抗体，所以仅可以满足大部分输血者ABO血型配血要求。而除ABO系统以外的其它血型系统的抗体或多次接受输血患者及多次妊娠的妇女产生的抗体绝大多数为不完全抗体，在盐水介质中红血球不易产生凝集。为检查出不完全抗体常用方法有抗人类球蛋白法、蛋白酶法及胶体介质法等，这些方法亦存在一些缺点。为了输血安全及操作方便，必须改良配血方法。
近年提出的用凝聚胺(Polybrene)配制的试剂可以检查出完全抗体与不完全抗体两种性质的抗体，且能发现可引起溶血性输血反应的绝大多数抗体，此种检测方法被称为手工凝聚胺法(Manual Polybrene)。凝聚胺是一种多价阳离子氨基聚合物，它可以引起正常红血球的可逆性凝集，如果被抗体致敏的红血球与凝聚胺连在一起，就会发生不可逆凝集。
大部份发达国家已导入需使用特殊的试剂及设备(例如，抗球蛋白血清、离心机等)的标准化输血前检测的方法。然而，这些设备对落后国家来说，却是不易取得的，或因价格过高而无法购得。因此，对于这些发展中国家或落后国家来说，开发不需使用离心机或昂贵试剂的配合试验的操作程序是非常重要的。
本发明在此即致力于提供一种比手工凝聚胺法操作更简单，且不需使用昂贵试剂及离心机的方法，以有效检测出血液中具有临床上重要性的抗体。

发明内容
本发明的目的，是提供一种不需使用昂贵试剂及离心机即可于输血前进行血液配合试验的方法。
本发明的另一目的，是提供一种操作人员仅需接受最少的训练即可进行血液配合试验的方法。
本发明的又一目的，是提供一种简单且快速的输血前血液配合试验的方法。
本发明所提出的在输血前进行血液配合试验的方法，是改良自手工凝聚胺法(Manual Polybrene，MP)，将原先需要试管及离心机的检测方式，改以一载体(例如，载玻片)所取代，以获得一种快速且简便的血液配合试验方法，在此称之为玻片凝聚胺法(Slide Polybrene，SP)。
其方法是通过使用一载体(例如，载玻片)，于该载体上依序加入低离子力溶液、待测病人血清(或血浆)及供血者血球(或抗体筛检血球)后混合，再加入凝聚胺溶液混合后静置。此时会很快的出现红血球凝集现象。之后，再加入再悬浮溶液，经摇晃后由凝聚胺引起的凝集会再度分散；而由抗体所引起的凝集则不会被分开，而此一凝集所产生的产物，可立即且轻易的由肉眼或放大镜(如果必要时)所观察到。
手工凝聚胺法中红血球是通过离心力的作用而使其紧靠在一起，由此增强其血球凝集效果。然而，在玻片凝聚胺法中红血球则是通过凝聚胺试剂的正电荷作用而聚集在一起，以造成非特异性红血球凝集。
本发明将通过参考下列的实施例做进一步的说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。熟悉本发明的技艺者，可做一些改良与修饰，但仍不脱离本发明的范畴。
具体实施例方式
根据本发明所提出的一种玻片凝聚胺法，其检测步骤大致上可区分成三个阶段，包含致敏阶段(sensitization phase)、凝聚胺聚集阶段(Polybreneaggregation phase)及再悬浮阶段(resuspension phase)。
其中致敏阶段，是包含将低离子力溶液加入一预先备妥的载体(例如，载玻片)上，紧接着于此载体上已滴有低离子溶液处加入待测血清(或血浆)及红血球[抗体筛检血球(antibody screening cells)或供血者的血球]盐水溶液[或10μl红血球浓厚液(packed RBCs)]。这些试剂可由搅拌棒将其混合均匀，接着于室温下静置0.5～5分钟，较佳为1～2分钟。
凝聚胺聚集阶段，是包含将凝聚胺反应溶液(working solution)加入前述玻片上的混合液中，并以涂抹棒将其混合均匀，接着于室温(约22℃)下静置0.5～5分钟，较佳为1～3分钟。红血球聚集现象通常于加入凝聚胺溶液30秒后开始出现，且于1分钟的内完成；再悬浮阶段，包含将一滴的再悬浮溶液加入上述玻片的试剂中，再以手轻轻摇晃此玻片约8～120秒，较佳为10～60秒，直到任何由凝聚胺引起的非特异性聚集被分散。而真正由抗体所引起的聚集则不会被分开，且可立即为肉眼所观察到。对于较微弱的反应来说，此一聚集产物可通过放大器来观察到。由此可快速的获得检测的结果，且于加入再悬浮液后通常不需超过3分钟即可获得检测结果。
就日常品质控制来说应包含一微弱反应抗-E或抗-D做为正控制组，且插入AB型血清做为负控制组。
前述的低离子力溶液、待测血清、红血球盐水溶液及再悬浮溶液的使用量的体积比，以再悬浮溶液的使用量为1体积份时，低离子力溶液的使用量为1.5～8体积份，较佳为2～4体积份；而待测血清的使用量为1～5体积份，较佳为1.5～2.5体积份；红血球盐水溶液的使用量为0.5～3体积份，较佳为0.75～1.5体积份。
前述的低离子力溶液可通过将葡萄糖与乙二胺四乙酸二钠盐(disodiumEDTA)溶于水中所制备。例如，将25克葡萄糖及1克乙二胺四乙酸二钠盐溶于500毫升蒸馏水中。
前述的红血球盐水溶液是以0.9％生理食盐水所调配而成，其浓度为15～25％，较佳为18～22％。
前述的凝聚胺反应溶液，是以生理食盐水所配制而成，其浓度较佳为0.1～0.15％。其配置与保存方法，可由1克凝聚胺与10毫升0.9％生理食盐水，配制成10％储存溶液(stock solution)冷冻储存。待使用时，再以0.9％生理食盐水配制成所需浓度的反应溶液。
前述的再悬浮溶液是以0.3～0.5M的柠檬酸三钠水溶液与5％葡萄糖水溶液混合所制备。前述的柠檬酸三钠水溶液与葡萄糖水溶液的混合体积比，较佳为1～2∶1。
实施例一以玻片凝聚胺法进行检测的灵敏度为检测玻片凝聚胺法对于检测不同种的异体抗体(alloantibodies)的灵敏度。在此所使用的异体抗体包含抗-E、抗-“Mia”、抗-D、抗-K、抗-Jka、抗-Jkb、抗-Dia、抗-Fya及抗Fyb，及取自于“血清、细胞及罕见血液国际免疫血液交换组织(Serum，Cells and Rare Fluids International ImmunohematologyExchange Group，SCARF)”所赠在台湾少见的抗体。
首先，先于载玻片上以蜡笔画出一尺寸约为3×1.5公分大小的椭圆形溢流环，用以避免检测过程中试剂溢流出此一范围，而造成检测结果的偏差。
之后，将三滴(每滴约50μl)低离子力溶液加入载玻片中，紧接着加入两滴待测血清及一滴的20％抗体筛检血球盐水溶液，以涂抹棒将其混合均匀后，于室温下静置约1分钟。
于前述载玻片上的试剂中加入一滴0.1％凝聚胺反应溶液，并以涂抹棒将其混合均匀，接着于室温下静置1分钟。
将一滴的再悬浮溶液加入上述载玻片上的试剂中，再以手轻轻摇晃此玻片10秒钟，使由凝聚胺引起的非特异性聚集分散开。最后，再以肉眼观察红血球的凝集结果。
血清抗体力价的测定方式，是利用半定量的方式来测定，其是以二倍稀释法所得的稀释血清再和一定量的血球作用，最后以能与红血球发生凝集反应的最高稀释倍数来表示抗体的力价。
用做为抗体力价测定的稀释剂为3％白蛋白食盐水溶液(牛血清白蛋白购自美国Sigma化学公司)。
比较实施例一以手工凝聚胺法进行检测的灵敏度使用与实施例一中相同的抗体筛检血球，以0.9％生理食盐水调配成3％的浓度。
将2滴待测血清及1滴3％抗体筛检血球加入试管中，之后摇动混合。
加0.6毫升低离子力溶液(LIM)到每一支试管中，混合后，静置1分钟。再于上述试管中加入2滴(约0.1毫升)0.05％凝聚胺溶液，混合，静置15秒。
将上述混合液以3,400rpm的转速离心10秒。去除上清液。
加入2滴(0.1毫升)的再悬浮液，缓和的混合10秒钟。倒在玻片上于3分钟内用肉眼和显微镜观察有无凝集现象(10秒内，若为凝聚胺引起的聚合应该会分散开，若为抗原抗体引起的凝集，则不会分开)。
待测血清亦以二倍稀释法稀释并与一定量的红血球作用以上述的方法进行测定，以测定出能与红血球发生凝集反应的最高稀释倍数。
比较实施例二以间接抗球蛋白法进行检测的灵敏度于试管中加入待测血清二滴，之后加入1滴与比较实施例一中相同的3％抗体筛检血球，以3,400rpm转速离心15秒，摇开，加入牛白蛋白(BovineAlbumin)溶液2滴，于37℃下静置15～30分钟。以生理食盐水清洗3～4次后，去除上清液。
加入2滴多价抗人体球蛋白试剂，经混合后再以3,400rpm离心15秒，以肉眼或显微镜观察有无凝集现象。若有凝集，则为阳性。
待测血清亦以二倍稀释法稀释并与一定量的红血球作用以上述的方法进行测定，以测定出能与红血球发生凝集反应的最高稀释倍数。
实施例一、比较实施例一与比较实施例二中不同血清样品，分别经二倍稀释法以不同的检测法，测定能与红血球发生凝集反应的最高稀释倍数，其测定结果示于表二。
综合实施例一、比较实施例一及比较实施例二，由表二中可以看出于检测抗-E时，玻片凝聚胺法(SP)及手工凝聚胺法(MP)较间接抗球蛋白法(IAT)有较高的灵敏性。而间接抗球蛋白法则较玻片凝聚胺法与手工凝聚胺法于检测抗-“Mia”、-K、-Jka及-Jkb时有较高的灵敏度。
实施例二玻片凝聚胺法对不同的异体抗体的检出率为测试不同的异体抗体(alloantibodies)的检出率，在此所使用的异体抗体包含抗-“Mia”(23例)、抗-E(8例)、抗-D(5例)、抗-C(1例)、抗-Jka，-Jkb及-Jk3(共8例)、抗-Kpb(2例)、抗-Dia及-Dib(共6例)、抗-S(1例)、抗-M(4例)、抗-P1(2例)、抗-Lea及-Leb(共2例)、抗-A(10例)、抗-B(10例)、抗-H(13例)及抗-I(2例)，共85例，部分抗体是取自于“血清、细胞及罕见血液国际免免疫血液交换组织(SCARF)”。
将含有前述异体抗体抗体的抗体筛检血球以实施例一中所述的检测方法进行测试，但不经二倍稀释法稀释，以肉眼检测受测样品凝集情形，其结果示于表三。
比较实施例三手工凝聚胺法对不同的异体抗体抗体的检出率将实施例二中所使用的85例异体抗体抗体，以比较实施例一中的方法进行测试，但不经二倍稀释法稀释，以肉眼检测受测样品凝集情形，其结果示于表三。
比较实施例四间接抗球蛋白法对不同的异体抗体抗体的检出率将实施例二中所测试的85例异体抗体抗体，以比较实施例二中的方法进行测试，但不经二倍稀释法稀释，以肉眼检测受测样品凝集情形，其结果示于表三。
综合实施例二、比较实施例三及比较实施例四，由表三中可得知玻片凝聚胺法可自23个抗-“Mia”样本中检测出21个，自8个抗-E样本中检测出7个。此外，玻片凝聚胺法亦可迅速且完全的检测出ABO血型系统中不兼容的血型。此外，玻片凝聚胺法对于其它临床上重要的异体抗体也可快速的检测出，这些临床上重要的异体抗体，也包含对抗Kidd及Diego血型系统抗原的抗体。
另一方面，于85个取自病患的异体抗体中，经检测后有74个抗体可为玻片凝聚胺法所测得，包含10个抗-A及10个抗-B。而抗-Kpa仅可通过间接抗球蛋白法所测得。
虽然，两种凝聚胺法皆具有较难测得Kell血型系统的抗体的缺点。然而，在东方人的族群中K抗原出现的频率非常低(接近0％)，因此于临床医学上的重要性不大。
综合实施例一及实施例二的结果显示，玻片凝聚胺法可检测出大部分临床上重要的异体抗体，特别是抗-E及抗-“Mia”。此二种抗体是为在台湾临床医学上重要且最常见的异体抗体，且在其它的东南亚地区亦具有相似的临床重要性。白种人的MNS血型系统中，MiIII血型是属于稀有血型，然而在台湾出现旳频率为7.3％，其中以台湾原住民出现的比例最高为世界之冠。在台湾约每二百人中有一人带有能与MiIII表现型的红血球反应的抗-”Mia”抗体，因此台湾血库作业所使用的抗体筛检血球必须含有MiIII表现型的红血球，当输错血液时其排斥反应与ABO血型的反应类似。
其它异体抗体，例如抗-D、-K、-Jka、-Jkb、-Fya及-Fyb亦可为玻片凝聚胺法所测得，且其灵敏度与手工凝聚胺法相近。虽然，玻片凝聚胺法(及手工凝聚胺法)于检测抗-K时，比间接抗球蛋白法的灵敏度为低。但由于绝大多数东南亚地区的病患及捐血者皆为K抗原阴性，因此可预期抗-K的发生率应相当低。实际上的例子，台湾过去20年来仅发现一例可与Kell血型系统的抗原反应的抗体。因此，对东南亚地区而言，使用灵敏检测Kell血型系统的抗体程序，于常规的血液配合试验程序中似乎是不需要的。
综上所述，玻片凝聚胺法是为一种极快的(约五分钟)、便宜的(检测用的试剂很容易制备，且可于实验室中自己制备)，且易于操作的检测方法。操作人员仅需要一天左右的训练即可胜任此一检测工作。因此，于资源较少的国家中，尤其是输血前的配合试验主要做ABO血型系统的配合，使用玻片凝聚胺法，将可显著的改善输血安全。在这些国家中，许多临床上仍未被检测出的重要抗体，由此亦可被检测出。
在发展中国家的输血工作，不仅缺乏离心机，同时亦缺少足够的资金购买试剂以及训练新的人员。在这些国家中，可选择使用玻片凝聚胺法，用于常规的输血前检测中以改善输血病患的安全。
表一部份已知血型系统及其特异抗体

表二以玻片凝聚胺法(SP)、手工凝聚胺法(MP)及间接抗球蛋白法(IAT)检测异体抗体的力价的比较抗-方法E E E E EEE*“Mia” “Mia” “Mia” “Mia” “Mia”玻片凝聚胺法1 4 8 16128 512 2001 2 2 4 8手工凝聚胺法1 8 128 641024 2048 1600 2 2 4 16 8间接抗球蛋白法 1 8 2 1 512 256 2001 4 16 64 32抗-方法D*K#K#Jka#Jkb#Jkb#Dia#Fya#Fyb#Fyb玻片凝聚胺法1600 2162 416 2 4 4 1手工凝聚胺法6400 1161 416 16 64 1616间接抗球蛋白法 3200 64 512 4 832 4 1288 4备注*为美国食品药物管理局(FDA)核准的商业单株抗体(monoclonal antibodie)#为美国食品药物管理局(FDA)核准的商业抗血清。
表三不同检测方法对不同的异体抗体所能检测出的病患个数抗- 病患数玻片凝聚胺法手工凝聚胺法 间接抗球蛋白法“Mia” 2321 2323E 8 7 8 7D 5 5 5 5C 1 1 1 1Jka.Jka.Jk3 8 5 8 8Kpb2 0 0 2Dia.Dib6 3 6 6S 1 1 1 1M 4 4 4 2P1 2 2 2 0Lea.Leb2 2 2 1A 10 10 1010B 10 10 1010H*1 1 1 1I 2 2 2 0总数85 74 8377备注*为孟买表现型(Bombay phenotype)
权利要求
1.一种血液配合试验的检测方法，其步骤包含(A)取用一载体；(B)于该载体上加入低离子力溶液、待测血清或血浆，以红血球食盐水溶液，经混合后静置1～2分钟；(C)于该载体上再加入凝聚胺食盐水溶液，经混合后静置1～3分钟；(D)于该载体中再加入再悬浮溶液，轻摇10～60秒；(E)观察红血球凝集的情形，其中该红血球食盐水溶液的浓度为18～22％，且该凝聚胺食盐水溶液的浓度为0.1～0.15％。
2.如权利要求1所述的检测方法，其中该低离子力溶液、该待测血清或血浆、该红血球食盐水溶液，以及该凝聚胺食盐水溶液的使用量，以该再悬浮溶液的使用量为1体积份时，该低离子力溶液的使用量为2～4体积份；该待测血清或血浆的使用量为1.5～2.5体积份；该红血球盐水溶液的使用量为0.75～1.5体积份。
3.如权利要求2所述的检测方法，其中该一体积份是为20～200微升。
4.如权利要求1所述的检测方法，其中该步骤(B)中的该低离子力溶液是以葡萄糖及乙二胺四乙酸二钠盐溶于蒸馏水中所制备。
5.如权利要求1所述的检测方法，其中该步骤(D)中的该再悬浮液是以0.3～0.5M的柠檬酸三钠水溶液与5％葡萄糖水溶液混合所制备，其中该柠檬酸三钠水溶液与该葡萄糖水溶液的体积混合比为1～2∶1。
6.如权利要求1所述的检测方法，其中该步骤(A)中的该载体为载玻片。
7.如权利要求1或6所述的检测方法，其中该载体上进一步设置一溢流环。
全文摘要
本发明是有关一种简易且快速的血液配合试验的检测方法，可于输血前有效检测出供血者与受血者的血液是否配合(或相容)，以提高输血安全。本方法是改良自手工凝聚胺法(MP)，在不需使用试管或离心机的情况下，仅需通过使用一玻片，即可有效的检测出病患血清(或血浆)中的红血球异体抗体(alloantibodies)。本发明所提出的方法，极适用于资源缺乏的地区或发展中国家，特别是血球上K抗原频率极低的族群。
文档编号G01N33/543GK1614424SQ20031010429
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月6日 优先权日2003年11月6日
发明者林妈利 申请人:财团法人台湾基督长老教会马偕纪念社会事业基金会马偕纪念医院