专利名称：Klotho蛋白的用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了 KLOTHO蛋白的用途，属于生物医药技术领域。
背景技术：
原发性肝细胞性肝癌(简称肝癌，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，2007年12月美国癌症学会(ACS)发布的数据显示肝癌年增66. 7万例，死亡59. 8万例，其中约50%的新患病例和死亡病例在中国，即肝癌对我国人民的健康威胁更大，已成为我国第二位肿瘤杀手，不仅使患者痛苦不堪，生存率低，而且给家庭、社会带来严重的经济和心理负担。Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13ql2，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成。Koltho基因的cDNA含有二段不同的片段，分别编码二种不同的蛋白一为膜型，位于细胞膜上，其胞外区的蛋白序列与葡萄糖苷酶相似；二 为分泌型，存在于血液循环中，被认为是一种肽类激素。Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等。近年来，越来越多的研究发现klotho基因可以调节IGF、TGF-i3 I、FGF等信号通路，参与氧化应激过程，并且与机体的免疫缺陷有关，提示klotho在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，并可进一步利用klotho作为肿瘤发生、分级的标志物以及作为靶点用于抗肿瘤的治疗。对现有技术的国内外文献和专利进行检索，至今未见任何KLOTHO蛋白及其相关组成成分用于肝细胞肝癌诊断和治疗的研究报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种KLOTHO蛋白在制备肝癌治疗药物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。本发明的另一个目的是提供一种KLOTHO蛋白在制备肝癌诊断制剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。本发明具有如下技术效果
(1)肝癌患者癌组织中KLOTHO蛋白表达低于癌旁组织，通过检测个体肝组织和(或)血液中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达降低预测肝癌的发生；
(2)KL0TH0蛋白对肝癌生长具有抑制作用，通过提高肝癌组织中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达水平治疗肝癌；
(3)由于klotho参与了恶性增殖、凋亡、侵袭等细胞活动相关的病理过程，因此本发明对今后深入探讨klotho与其他疾病的关系提供了经验和应用基础。


图I为肝癌及癌旁组织KLOTHO蛋白免疫组化染色(X 400)结果(A) KLOTHO蛋白在肾小管上皮细胞中强阳性表达，作为KLOTHO蛋白免疫组化染色的阳性对照；(B)KLOTHO蛋白在肝癌癌旁组织中高表达；(C) KLOTHO蛋白在肝癌组织中低表达。图2 为 Kaplan-Meier 生存曲线。图3为Klotho高表达载体pCMV6-Entry-KL上调KLOTHO蛋白的表达效果；
图4为转染Klotho高表达载体pCMV6-Entry-KL抑制肝癌H印G2细胞的增殖结果；
图5为转染Klotho高表达载体pCMV6-Entry-KL促进肝癌H印G2细胞的凋亡结果；
图6为转染klotho基因特异性siRNA抑制KLOTHO蛋白的表达效果；
图7为转染klotho基因特异性siRNA促进肝癌HepG2细胞的增殖结果；
图8为转染klotho基因特异性siRNA抑制肝癌!fepG2细胞的凋亡结果； 图9为加入外源性分泌型KLOTHO蛋白抑制肝癌HepG2细胞的增殖结果；
图10为腹腔注射外源性分泌型KLOTHO蛋白对荷瘤裸鼠肝癌组织生长的影响结果；
图11为腹腔注射外源性分泌型KLOTHO蛋白对荷瘤裸鼠肝癌组织中KLOTHO蛋白表达的影响结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明。需注意的是，以下实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中提到的KLOTHO蛋白均为氨基酸序列如SEQ NO. I所示的KLOTHO蛋白。实施例I肝癌患者癌组织中KLOTHO蛋白表达低于癌旁组织的临床意义 采用免疫组化S-P法，检测KLOTHO蛋白在由52例肝癌与54例癌旁组织组成的组织芯
片中的表达情况，并结合临床病理资料进行统计分析。结果如图I、图2、表1、2所示，表明肝癌组织中KLOTHO蛋白表达阳性率低于癌旁组织0°〈0. 05);且肝癌组织中KLOTHO蛋白表达与肝癌的临床分期呈负相关、与病例分级呈正相关0°〈0. 05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小等的相关性无统计学意义0°>0. 05)。对纳入研究的肝癌患者进行生存分析发现KLOTHO蛋白的阳性表达与患者的预后成正相关，KLOTHO蛋白阳性组的生存时间(平均生存时间为28. 132个月，95%可信区间Cl为23. 726-32. 538)比KLOTHO蛋白阴性组生存时间(平均生存时间为16. 772个月，95%可信区间Cl为11. 550-21. 993)长，Log-rank检验示两组生存率差别有统计学意义Gd=O. 016)。COX风险比例模型分析结果说明KLOTHO可作为独立的生存期预测因子(TM). 043)。KLOTHO蛋白高表达可能延缓肝癌病人的死亡，KLOTHO表达阳性的患者比klotho表达阴性的患者在某时刻死亡的相对危险度较低，为O. 397。这些结果提示KLOTHO蛋白在肝癌中的表达降低，可能参与了肝癌的发生与进展，为肝癌的诊断和预后判断提供参考依据。
权利要求
1.一种KLOTHO蛋白在制备肝癌治疗药物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
2.—种KLOTHO蛋白在制备肝癌诊断制剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
全文摘要
本发明提供了一种KLOTHO蛋白在制备肝癌治疗药物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明还提供了一种KLOTHO蛋白在制备肝癌诊断制剂中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明具有如下技术效果(1)由于肝癌患者癌组织中KLOTHO蛋白表达低于癌旁组织，通过检测个体肝组织和(或)血液中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达降低预测肝癌的发生；(2)由于KLOTHO蛋白对肝癌生长的抑制作用，通过提高肝癌组织中KLOTHO蛋白及其相关组成成分的表达水平治疗肝癌；(3)由于klotho参与了恶性增殖、凋亡、侵袭等细胞活动相关的病理过程，因此本发明对今后深入探讨klotho与其他疾病的关系提供了经验和应用基础。
文档编号G01N33/68GK102961739SQ20121053307
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者黄曙, 汤小伟, 季国忠, 范志宁, 王敏 申请人:黄曙, 南京医科大学第二附属医院