专利名称：甘氨酸诊断/测定试剂盒及甘氨酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种甘氮酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸 浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
甘氨酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品、 化肥、饲料等行业。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、医 药级、词料级和工业级四种规格产品。
在20多种氨基酸中，甘氨酸是最简单的一种，它是组成蛋白质的一种成 分，为非人体必需氨基酸。《食品添加剂使用卫生标准》规定，甘氨酸允许 使用的范围为调味料和豆奶，最大使用量是lg/kg。国家质检总局日前进行 的一项专项监督检查结果表明，国内部分乳饮料企业为提高产品中蛋白质含 量，在生产加工中违规使用价格低得多的甘氨酸代替奶粉，个别企业问题严 重。据业内人士介绍，使用甘氨酸替代奶粉，可以使产品成本至少减少一半。 人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对 氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。
目前各地方的检测标准均采用氨基氮测定法测定甘氨酸含量。较新的方 法，采用HPLC法(高效液相色谱柱后衍生法)测定其中的甘氨酸。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶双倍扩增法(Enzymatic Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法 (Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甘氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出 用以实现该方法的甘氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可 见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘氨酸浓度测定，而且测定速度 快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明甘氨酸浓度测定方法原理如下
甘氨酸+ 2 A 氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2AH2 二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶 丙酮酸脱氢酶 丙酮酸
+辅酶八+辅酶
丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶L-乳酸+辅酶 A是电子受体，例如柠檬酸铁(ferric citrate)、焦磷酸铁(ferric pyrophosphate)、延胡索酸(fUmarate)、硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate, PMS)、水合氧化铁(hydrous ferric oxide)、 ferric hydrite 等，但不仅限于上述举例。 这种方法应用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase; EC 1.4.99.5)偶 联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase; EC 1.1.1.27; EC 1丄1.28)酶促反应连续监测法/终点比色法。 氰化氢合成酶酶解甘氨酸反应产生二氧化碳，再通过偶联丙酮酸脱氢酶及乳 酸脱氢酶的作用，最终二次将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为 辅酶(在340nm处没有吸收峰)，灵敏度增加二倍；从而得以测定还原型辅 酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程 度/速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甘氨酸诊断/测定试剂盒
较为理想缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L 氰化氢合成酶 10000 U/L
丙酮酸脱氢酵 16000 U/L
乳酸脱氢酶 16000 U/L
硫酸甲酯吩嗪 0.4mmol/L 乙酰辅酶A 16mmol/L 硫酸甲酯吩嗪可以用其他电子受体取代。 本发明的甘氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸 脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A。硫酸甲酯吩嗪可以用其他电子 受体取代。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶。 还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、硫酸甲酯吩 嗪、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶。
还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、硫酸甲酯吩 嗪、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甘氨酸浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
氰化氢合成酶 10000 U/L
丙酮酸脱氢酶 16000 U/L
乳酸脱氢酶 16000 U/L
硫酸甲酯吩嗪 0.4mmol/L
乙酰辅酶A 16mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
1.8±0.7，测试主波长340mn，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟 左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓 度大小。 实施例二
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 硫酸甲酯吩嗪 乙酰辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
氰化氢合成酶 丙酮酸脱氢酶 乳酸脱氢酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10分钟，起始吸光度
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 0.4 mmol/L 16 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 16000U/L 16000U/L1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂 1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间 大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓 度大小。 实施例三
本实施例的甘氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 硫酸甲酯吩嗪 乙酰辅酶A 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸脱氢酶 乳酸脱氢酶
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 稳定剂
氰化氢合成酶 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体」
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 0.4 mmol/L 16 mmol/L
層mmol/L 500 mmol/L 16000U/L 16000U/L
100醒ol/L 500 mmol/L 10000 U/L
:试剂，可以直接使用,测定甘氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间
IO分钟，起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测甘氨酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为 负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓 度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0018;吸 光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形 范围可达8.8 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土6 %， 试 剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《1.9%;试剂的灵敏度可达 0.1099 ± 0.0505 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽 广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其方法原理如下甘氨酸+2A <u>氰化氢合成酶</u> 氰化氢+二氧化碳+2AH2二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶 <u>丙酮酸脱氢酶</u> 丙酮酸 +辅酶A+辅酶丙酮酸+还原型辅酶 <u>乳酸脱氢酶</u> L-乳酸+辅酶A是电子受体，例如柠檬酸铁(ferric citrate)、焦磷酸铁(ferricpyrophosphate)、延胡索酸(fumarate)、硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosulphate，PMS)、水合氧化铁(hydrous ferric oxide)、ferric hydrite等，但不仅限于上述举例。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出甘氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种甘氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L还原型辅酶0.1——0.35 mmol/L氰化氢合成酶1000-——,00 U/L丙酮酸脱氢酶1000-——80000 U/L乳酸脱氢酶1000-——80000 U/L硫酸甲酯吩嗪0.1——50 mmol/L乙酰辅酶Al一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。硫酸甲酯吩嗪可以用其他电子受体取代。
3. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱 氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸 脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓 冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶组成。还原 型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗉、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳 定剂、氰化氢合成酶组成。还原型辅酶、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、 乳酸脱氢酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中 的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述甘氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1一4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、硫酸甲酯吩嗪、乙酰辅酶A、氰化氢合成酶、丙酮酸脱氢酶、乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出甘氨酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464277SQ200710191430
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司