专利名称：一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒
技术领域：
本发明属于酶联免疫吸附分析技术领域，涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
偶氮类染料(azo dye)是一种重要的合成染料，是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，用于多种天然和合成纤维的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。偶氮染料本身无任何直接的致癌作用，但是在体内还原分解，可形成芳香胺化合物，芳香胺在体内经过代谢活动后与靶细胞作用可能使DNA发生变化，成为人体病变的诱发因素，对人体或动物有潜在的致癌性和致突变性。由于其致癌性和致突变性，世界上很多国家都对偶氮类染料的使用实施了严格的规定。日本曾批准使用的合成色素有27种，现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种，现仅剩下7种。瑞典、 芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素，其中挪威等一些国家还完全禁止使用任何化学合成色素。此外还有一些国家已禁止在肉类、鱼类及其加工品、水果及其制品、调味品、婴儿食品、糕点等食品中添加合成色素。我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制凡是肉类及其加工品、鱼类及其加工品、醋、酱油、腐乳等调味品、水果及其制品、 乳类及乳制品、婴儿食品、饼干、糕点都不能使用人工合成色素。只有汽水、冷饮食品、糖果、 配制酒和果汁露可以少量使用，一般不得超过1/10000。目前我国批准使用的食用合成色素有9个品种，即苋菜红、诱惑红、胭脂红、新红、酸性红、柠檬黄、日落黄、靛蓝和亮蓝。日落黄是一类合成型偶氮染料，合成色素自19世纪问世以来，由于成本低廉、色泽鲜艳、着色力强、稳定、可任意调配而得到广泛运用，部分也用于食品着色。但是，由于合成色素大多属于煤焦油合成的染料，不仅本身没有营养价值，而且大多数对人体有害，因此世界卫生组织对合成食用色素的使用种类、使用量均有严格的规定。从大量研究得出的结论认为合成色素的致癌性一般可能与其多为偶氮化合物有关。偶氮色素中都含有偶氮键，它是偶氮色素的颜色载体，在强还原剂作用下，偶氮键发生断裂生成胺基化合物，最后得到2分子的芳胺， 而芳胺类物质常具有致癌性。我国市售和出口海外的蜜饯、豆制品、卤制品、饮料等均含有日落黄等类似合成食用色素，所以，日落黄检测方法的开发研究已刻不容缓。在偶氮类色素的检测中，仪器法如高效液相色谱以及液相-质谱联用是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长， 需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难以用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法，因此建立一种有效的ELISA法检测日落黄的方法具有重要意义。

发明内容本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒。本发明提供的日落黄酶联免疫检测试剂盒中试剂的组成包括A、各孔包被有包被抗原即日落黄与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；B、日落黄标准溶液0. 01ng/mL,0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL 各 1瓶；C、酶标羊抗兔抗体溶液辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液稀释成1 2000的工作浓度；D、日落黄抗体溶液人工免疫抗原免疫动物制备所得的日落黄多克隆抗体原液， 使用时用洗涤溶液稀释成1 80000工作浓度；E、发光溶液使用400ul TMB溶液、IOml pH = 5. O的柠檬酸缓冲液和2ul体积百分比为30%的H2A溶液混合而成，其中TMB溶液由10mgTMB+2ml DMSO混合而成；F、洗涤溶液为pH = 7. 5、浓度为0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有吐温-20体积分数0. 05% ；所述的磷酸盐用磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制。G、包被溶液1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于IL水中制成的溶液，调节pH = 9. 5 ；H、封闭溶液10g OVA溶于IL以上F步所述的洗涤溶液中，再加入质量分数为 0. 05% NaN3 制成。以上所述偶联物的载体蛋白为分子量范围在6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。包被酶标板的包被抗原由日落黄与卵清蛋白偶合制成，制备抗体的人工免疫原由日落黄与牛血清蛋白偶合制成。所述包被抗原浓度为1 μ g/mL。所述的试剂盒对日落黄的最大检测范围为0. 01ng/mL lOng/mL。本发明试剂盒中涉及的相关溶液的配制1、本发明中酶标板的制备本发明中包被的酶标板，是采用日落黄-OVA制成一定浓度的包被溶液，在4°C中过夜反应包被。其中包被溶液的浓度经过方阵优化实验确定。本发明采用的包被溶液是pH为9. 5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中酶标板中所包被的日落黄-OVA在碱性环境下可以很好的结合在酶标板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被蛋白浓度为1 μ g/mL。包被好的酶标板可以用含封闭溶液封闭，封闭溶液中惰性蛋白可以是0VA，需加入
NaN3防止变质。2、日落黄抗体溶液和酶标羊抗兔抗体溶液的制备本发明中日落黄抗体溶液、酶标羊抗兔抗体溶液浓度是决定本发明中日落黄酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。本发明中涉及的日落黄抗体溶液可以用以上F步所述的洗涤溶液配制成浓度为 0. 01 10ng/mL的抗体溶液。本发明中涉及的酶标羊抗兔抗体溶液可以用以上F步所述的洗涤溶液配制为浓度1 2000的酶标溶液。按照上述日落黄抗体溶液浓度和酶标羊抗兔抗体溶液浓度可制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到O.Olng/mL lOng/mL)及好的灵敏度 (0.024ng/mL)。3、发光溶液的配制本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢系统。所述发光液是400ul TMB溶液(10mgTMB+2ml DMS0)与IOml柠檬酸缓冲液(pH = 5. 0)和2ul 30% (v/v) H2O2溶液混合而成。 本发明的优点和积极效果本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的发光反应检测产物浓度。本发明的酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，可在食品 (如卤制品)和饮料中食用合成色素日落黄检测中发挥重要作用。

图1为本发明日落黄抗体的抑制率曲线，抗原包被浓度lyg/ml，抗体稀释倍数 1/40000，此时的IC50最小，方法的灵敏性最好。以外加药物(日落黄)浓度的log值为横坐标，吸光度与空白对照的吸光度比值Β/Β0为纵坐标作图，即可得到抑制率曲线。图2为本发明的工作曲线，将图1抑制率曲线中外加药物浓度从0. 01ng/mL lOng/mL的直线部分截取下来，即为本发明的工作曲线，即本发明对日落黄的最大检测范围为 0. 01ng/mL 10ng/mLo
具体实施方式实施例1、检测日落黄的酶联免疫试剂盒组分及制备过程1、检测日落黄的酶联免疫试剂盒的组成A、包被有包被抗原(日落黄与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；B、日落黄标准溶液0. 01ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL。C、酶标羊抗兔抗体溶液酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，装入，使用时用洗涤溶液配制成1 2000的工作浓度。D、日落黄抗体溶液用人工免疫抗原免疫动物制备所得的日落黄多克隆抗体，将所得日落黄抗体用洗涤溶液稀释成1 80000工作浓度。E、发光溶液使用400ul TMB溶液(10mgTMB+2ml DMS0)与IOml柠檬酸缓冲液 (ρΗ5. 0)和 2ul 30% (v/v) H2O2 溶液混合。F、洗涤溶液含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 5,0. lmol/L磷酸盐缓冲液。G、包被溶液1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于IL水中，调节pH9. 5。H、封闭溶液配制10g OVA溶于IL洗涤溶液中，再加入质量分数为0. 05% Ne^3制成。2、酶标板的制备用包被溶液将包被抗原稀释成1 μ g/mL,每孔加入100 μ L，36°C孵育池，倾去包被溶液，每孔加入300 μ L洗涤溶液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭溶液250 μ L，4°C过夜，倾去孔内液体，洗涤溶液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。3、免疫原的合成
权利要求
1.一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒，其特征是该试剂盒中试剂的组成包括A、各孔包被有包被抗原即日落黄与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；B、日落黄标准溶液0.01 ng/mL、0. 1 ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL、5 ng/mLUO ng/mL各 1瓶；C、酶标羊抗兔抗体溶液辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液稀释成 1:2000的工作浓度；D、日落黄抗体溶液人工免疫抗原免疫动物制备所得的日落黄多克隆抗体原液，使用时用洗涤溶液稀释成1:80000工作浓度；E、发光溶液使用400ulTMB溶液、IOml pH=5. O的柠檬酸缓冲液和2ul体积百分比为 30%的H2A溶液混合而成，其中TMB溶液由10mgTMB+2ml DMSO混合而成；F、洗涤溶液为pH=7.5、浓度为0. 1 mol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有吐温_20体积分数 0. 05% ；G、包被溶液1.59 g碳酸钠和2. 53 g碳酸氢钠溶于1 L水中制成的溶液，调节 pH=9. 5 ；H、封闭溶液10g OVA溶于1 L所述的洗涤溶液中，再加入质量分数0.05% NaR制成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6. 7 KDa 6. 8 KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包被酶标板的包被抗原由日落黄与卵清蛋白偶合制成，制备抗体的人工免疫原由日落黄与牛血清蛋白偶合制成。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被抗原浓度为1Z/g/mL。
5.根据权利要1所述的试剂盒，其特征在于日落黄的最大检测范围为0.01ng/mL^ 10 ng/mL。
全文摘要
一种日落黄的酶联免疫检测试剂盒。属于酶联免疫吸附分析技术领域。本发明提供的试剂盒中的试剂包括包被有包被抗原即日落黄与载体蛋白的偶联物的酶标板，日落黄标准溶液，酶标羊抗兔抗体溶液，日落黄抗体溶液，发光溶液，洗涤溶液，包被溶液和封闭溶液。偶联物的载体蛋白为分子量范围在6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。包被酶标板的包被抗原由日落黄与卵清蛋白偶合制成，制备抗体的人工免疫原由日落黄与牛血清蛋白偶合制成。试剂盒对日落黄的最大检测范围为0.01ng/mL~10ng/mL。本发明的酶联免疫检测试剂盒具有简单、快捷、准确、灵敏度高的特点，可在食品(如卤制品)和饮料中食用合成色素日落黄检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK102279262SQ20111018257
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者孟萌, 宋珮, 张太昌, 王鹏, 田溪, 薛虎寅, 邢玥, 郗日沫 申请人:南开大学