专利名称：一种检测不同基质中药中两种a型单端孢霉烯族毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，特别是涉及采用气相色谱-电子捕获检测法测定，气相色谱-质谱联用确证中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法。
背景技术：
单端孢霉烯族毒素是一类由镰刀菌属中多种真菌所产生的次生代谢产物，在自然界中分布极为广泛，是自然发生的最危险的食品污染物，对人畜健康危害十分严重。由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而且上述镰刀菌中部分为产毒菌，可产生单端孢霉烯族类毒素，因此，很有必要对中药中单端孢霉烯族毒素进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。单端孢霉烯族化合物分为二大类，A型和B型，其中A型毒性最大，研究得也最多， T-2和HT-2毒素就属于A型。T-2毒素是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种，HT-2毒素是T-2毒素的代谢产物。T-2毒素在多种谷物(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦)及其制品(麦芽、啤酒、面包)中广泛存在，其毒性强烈，至今已有3种地方病(食物中毒性白细胞缺乏症、大骨节病、克山病)的病因被认为与T-2毒素有关，对人畜构成很大危害。1973年联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源，尤其是美国指责前苏联、越南在东南亚使用“黄雨(yellow rain)”毒素(其中含有T_2毒素)以后，有关Τ_2，ΗΤ-2毒素对人类健康的危害引起了各国政府和科学家的较大关注。

发明内容
到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料中Τ-2，ΗΤ-2 毒素的分析，对中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素的分析，目前还是空白。因此对中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的Τ-2，ΗΤ-2毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素的提取、净化方法，优化了气相，气质的色谱条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的Τ-2，ΗΤ-2毒素进行测定。本发明是通过采用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的Τ-2，ΗΤ-2毒素的方法，同事建立了不同基质中Τ-2，ΗΤ-2毒素的气相色谱-质谱联用确证法。具体的不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料
仪器Agilent GC-6890N气相色谱仪、Ni电子捕获检测器，美国安捷伦公司；Agilent 768 系列自动进样器，美国安捷伦公司；Varian 431气相色谱仪，美国瓦里安公司；Varian 300三重四级杆质谱仪，美国瓦里安公司；TGL-16C型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；Waring高速均质器，美国Waring公司；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；PGG-OlD型干式氮吹仪，天津艾维欧科技发展有限公司DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司T-2&HT-2test-HPLC 免疫亲和柱，美国 VICAM 公司；GF/A型玻璃微纤维滤纸，英国WHATMAN公司。对照品T-2，HT_2毒素标准品购自美国Sigma公司，纯度彡99%;N-七氟丁酰咪唑(HFBI)， 美国Afla Aesar公司；正己烷为色谱纯，天津市光复精细化工研究所；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。样品所测样品分别购自江西樟树、陕西宝鸡、江苏镇江、北京以及贵州遵义，所有样品均为市场上随机购买而来，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定，低温干燥后备用。1、气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素a.色谱条件用毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气， 进样口温度260-280°C，检测器温度290-3KTC，程序升温，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，加甲苯-乙腈溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量，加甲醇-水溶液适量，高速勻质提取，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至空气通过柱体，再以水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂适量于上述吹干样品，密封，涡旋混合，放入烘箱中反应，冷却，加正己烷适量，摇勻，加碳酸氢钠水溶液适量，涡旋，离心 3-5min,取上层有机相，加正己烷定容。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱仪，测定。2、用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度 260-280°C，程序升温，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度220_240°C，电离能量60_80eV，四级杆
6温度140-160°C，传输线温度270-290°C，溶剂延迟5-15min，全扫描。c.分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱-质谱联用仪，确证。上述的不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的测定方法，优选以下步骤1、用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用DB-1701毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气，进样口温度260-2800C，检测器温度290-310°C，程序升温，初始温度80°C，保持 anin 后以 10°C /min 速率升至 200°C，再以 5°C /min 升至 220°C，再以 2°C /min 升至 230°C， 保持13min，再以3°C /min升至270°C，再以5°C /min升至280°C保持5min，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取HT-2和T-2毒素对照品适量，加乙腈或甲醇制成每ml含30-80 μ g的溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈 (90-96 :4-10, V/V)溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末20_30g，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量l_5g，加甲醇-水溶液(80-95 5-20，V/V)适量，高速勻质提取l-5min，过滤，取5_15ml滤液加水 20-60ml稀释，震摇l-2min，静置l-3min，再震摇l-2min，静置l-3min，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液5_15ml缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至 l-5ml空气通过柱体，再以10-15ml水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使l_5ml空气通过柱体。加Iml甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂50-100于上述吹干样品，密封，涡旋混合Ι-aiiin，放入烘箱中80°C反应，冷却，加正己烷，摇勻，加3-5%碳酸氢钠水溶液适量，涡旋，离心3-5min，取上层有机相50-100 μ L，加正己烷定容。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液1-2 μ L，注入气相色谱仪，测定。2、用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度 260-280°C，程序升温，初始温度为80°C，以10°C /min速率升至220°C，以2°C /min升至 2300C，再以5°C升至270°C，再以10°C升至300°C，保持5min，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度220_240°C，电离能量60_80eV，四级杆温度140-160°C，传输线温度270-290°C，溶剂延迟5-15min，全扫描，扫描范围30_800u。c.分别精密吸取对照品和样品溶液1-2 μ L，注入气相色谱-质谱联用仪，确证。本发明不同基质中两种A型单端孢霉烯族毒素的测定方法，更优选的技术方案可以按下列测定步骤进行1、用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用DB-1701毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气载气， 进样口温度270°C，检测器温度300°C，程序升温，初始温度80°C，保持^iin后以10°C /min 速率升至200°C，再以5°C /min升至220°C，再以2°C /min升至230°C，保持13min，再以3°C / min升至270°C，再以5°C /min升至280°C保持5min，不分流进样。
b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取HT-2和T-2毒素对照品适量，加乙腈制成每ml 含40 μ g的溶液；衍生化试剂的配制使用无水硫酸钠对甲苯-乙腈(95 5, V/V)溶液进行脱水干燥，取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈(95 5, V/V)溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末25g，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量2. 5g，加甲醇-水溶液(90 10，V/V) 100ml,高速勻质提取3min，过滤，取IOml滤液加水40ml稀释，震摇 lmin，静置2min，再震摇lmin，静置3min，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液IOml以1秒/滴的速度缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以IOml水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使 2-3ml空气通过柱体。准确加入1. OmL甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，50°C下氮气吹
干备用。衍生化加衍生化试剂50yL于上述吹干样品，密封，涡旋混合lmin，放入烘箱中 80°C反应40min，冷却至室温，加正己烷100 μ L，摇勻，加4%碳酸氢钠水溶液300 μ L，涡旋， 离心3min，取上层有机相90 μ L，加正己烷定容至1ml。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液1 μ L，注入气相色谱仪，测定ΗΤ-2和
Τ-2毒素含量。2、用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度沈0_观01，程序升温，初始温度80°C，保持anin后以10°C /min速率升至200°C，再以5°C /min升至220°C， 再以 2°C /min 升至 230°C，保持 13min，再以 3°C /min 升至 270°C，再以 5°C /min 升至保持5min，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度230°C，电离能量70eV，四级杆温度 150°C，传输线温度280°C，溶剂延迟lOmin，全扫描，扫描范围30_800u。c.分别精密吸取对照品和样品溶液1 μ L，注入气相色谱-质谱联用仪，确证ΗΤ-2 和Τ-2毒素。经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质两种A型单端孢霉烯族毒素的测定方法。本发明提供了不同中药中Τ-2，ΗΤ_2毒素的气相色谱-电子捕获检测法；不同中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素的气相色谱-质谱确证法。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药中 Τ-2，ΗΤ-2毒素的测定方法。1、用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素(1)衍生化过程中萃取溶液的选择分别取Τ-2，ΗΤ-2毒素各10μ (40μ g/ml)，氮气吹干，60°C衍生化60min，对文献报道的两种萃取溶液进行了比较，结果如表1-1。表1-1衍生化过程中萃取溶液的选择
权利要求
1.一种检测不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；(2)用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；
2.根据权利要求1的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气，进样口温度260-280°C，检测器温度290-3KTC，程序升温，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，加甲苯-乙腈溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量，加甲醇-水溶液适量，高速勻质提取，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至空气通过柱体， 再以水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂适量于上述吹干样品，密封，涡旋混合，放入烘箱中反应，冷却， 加正己烷适量，摇勻，加碳酸氢钠水溶液适量，涡旋，离心3-5min，取上层有机相，加正己烷定容。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱仪，测定。(2)用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度260-280°C，程序升温，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度220-240°C，电离能量60-80eV，四级杆温度 140-160°C，传输线温度270-290°C，溶剂延迟5-15min，全扫描。c.分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱-质谱联用仪，确证。
3.根据权利要求2的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用DB-1701毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气，进样口温度260-280°C，检测器温度290-3KTC，程序升温，初始温度80°C，保持^iin后以10°C /min速率升至200°C，再以5°C /min升至220°C，再以2V /min升至230°C，保持 13min，再以3°C /min升至270°C，再以5°C /min升至280°C保持5min，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取HT-2和T-2毒素对照品适量，加乙腈或甲醇制成每 ml含30-60 μ g的溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈(90-96 4-10，V/V)溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末20-30g，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量l_5g，加甲醇-水溶液(80-95 5-20，V/V)适量，高速勻质提取3_5min，过滤，取5_15ml滤液加水40_60ml 稀释，震摇l-2min，静置2-aiiin，再震摇l-2min，静置l-3min，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液5-15ml缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至2_5ml 空气通过柱体，再以10-15ml水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使l_5ml空气通过柱体。加Iml甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂50-60于上述吹干样品，密封，涡旋混合l-2min，放入烘箱中 80°C反应，冷却，加正己烷，摇勻，加3-5%碳酸氢钠水溶液适量，涡旋，离心3-5min，取上层有机相50-100 μ L，加正己烷定容。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液1-2μ L，注入气相色谱仪，测定。(2)用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度260-280°C，程序升温，初始温度为80°C，以10°C /min速率升至220°C，以2°C /min升至230°C，再以5°C 升至270°C，再以10°C升至300°C，保持5min，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度220-240°C，电离能量60-80eV，四级杆温度 140-1600C，传输线温度270-290°C，溶剂延迟5-15min，全扫描，扫描范围30_800u。c.分别精密吸取对照品和样品溶液1-2μ L，注入气相色谱-质谱联用仪，确证。
4.根据权利要求3的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用DB-1701毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气载气，进样口温度270°C，检测器温度300°C，程序升温，初始温度80°C，保持^iin后以10°C /min速率升至 200°C，再以 5°C /min 升至 220°C，再以 2°C /min 升至 230°C，保持 13min，再以 3°C /min 升至270°C，再以5°C /min升至280°C保持5min，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取HT-2和T-2毒素对照品适量，加乙腈制成每ml含 40 μ g的溶液；衍生化试剂的配制使用无水硫酸钠对甲苯-乙腈(95 5，V/V)溶液进行脱水干燥， 取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈(95 5，V/V)溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末25g，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量2. 5g，加甲醇-水溶液 (90 10，￥八)1001111，高速勻质提取；31^11，过滤，取101111滤液加水401111稀释，震摇11^11，静置2min，再震摇lmin，静置3min，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液IOml以1秒/滴的速度缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至2-3ml空气通过柱体，再以IOml水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2-;3ml 空气通过柱体。准确加入l.OmL甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，50°C下氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂50 μ L于上述吹干样品，密封，涡旋混合lmin，放入烘箱中80°C 反应40min，冷却至室温，加正己烷100 μ L，摇勻，加4%碳酸氢钠水溶液300 μ L，涡旋，离心 3min，取上层有机相90 μ L，加正己烷定容至1ml。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液1 μ L，注入气相色谱仪，测定ΗΤ-2和Τ-2毒素含量。(2)用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度260-280°C，程序升温， 初始温度80°C，保持anin后以10°C /min速率升至200°C，再以5°C /min升至220°C，再以 20C /min 升至 230°C，保持 13min，再以 3°C /min 升至 270°C，再以 5°C /min 升至 280°C保持 5min，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度230°C，电离能量70eV，四级杆温度150°C， 传输线温度280°C，溶剂延迟lOmin，全扫描，扫描范围30_800u。c.分别精密吸取对照品和样品溶液1μ L，注入气相色谱-质谱联用仪，确证ΗΤ-2和 Τ-2毒素。
5.根据权利要求2-4的任一种所述的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法， 其特征在于该方法的样品提取过程为采用甲醇水高速勻质提取。
6.根据权利要求5的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于该方法的样品提取过程为采用甲醇水(90 10，V/V)高速勻质提取。
7.根据权利要求2-4的任一种所述的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法， 其特征在于该方法的衍生化试剂的配置方法为取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈(95 5，V/V)溶液制成溶液。
8.根据权利要求7的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于该方法该方法的衍生化试剂的配置方法中的甲苯-乙腈(95 5，V/V)溶液需加无水硫酸钠进行脱水干燥
9.根据权利要求根据权利要求2-4的任一种所述的中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于样品的衍生化条件为80°C衍生化40min，加碳酸氢钠水溶液除杂。
10.根据权利要求9的两种A型单端孢霉烯族毒素的检测方法，其特征在于样品的衍生化条件为80°C衍生化40min，冷却至室温后，加4%碳酸氢钠水溶液除杂，取上层有机相稀释至Iml后进样。
全文摘要
一种检测不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，包括样品的提取，纯化及检测，所述的样品加氯化钠后采用甲醇-水(90∶10，V/V)高速匀质提取，过滤，加水稀释，玻璃纤维膜过滤，免疫亲和柱净化后氮气吹干，加衍生化试剂80℃衍生化40min，4％碳酸氢钠水溶液萃取杂质，取上层有机相稀释进样。其中衍生化试剂的配置为无水硫酸钠对甲苯-乙腈(95∶5，V/V)溶液进行脱水干燥，取七氟丁酰咪唑适量，按照1∶3的比例加入加甲苯-乙腈(95∶5，V/V)溶液制成溶液。所述样品测定方法包括气相色谱-电子捕获检测法测定，用DB-1701毛细管色谱柱分离，程序升温，不分流进样；气-质谱联用法确证，用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，程序升温，不分流进样。
文档编号G01N30/06GK102297904SQ20101020920
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者张晓飞, 杨美华 申请人:中国医学科学院药用植物研究所