专利名称：一种甘氨酸含量的测定方法
技术领域：
本发明ー种物质含量的測定方法，尤其涉及一种甘氨酸含量的測定方法，属医药技术领域。
背景技术：
甘氨酸又名氨基こ酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。甘氨酸參与嘌呤类、叶啉类、肌酸和こ醛酸的合成，可与多种物质结合由胆汁或从 尿中排出。甘氨酸广泛应用于医药。例如，将甘氨酸与谷氨酸、丙氨酸一起使用，对防治前列腺肥大并发症、排尿障碍、频尿、残尿等症状颇有效果，其本身还能改善睡眠质量。甘氨酸单独使用可治疗重疗肌无カ等营养失调症，促进脂肪代谢；作为ー种蛋白质氨基酸可作为复方氨基酸输液和ロ服氨基酸制剂的重要原料；亦可作为原料进ー步合成DL-笨丙氨酸和L-苏氨酸等；作为原料还可以合成治疗高血压药物地拉普利、抑制胃溃疡药用碳酸钙制剂等。目前甘氨酸的相关制剂及原料的检测方法主要以滴定、衍生化为主。中国药典、日本药典、英国药典、欧洲药典采用滴定法測定甘氨酸原料含量，该方法专属性不强，容易受杂质干扰影响含量結果。中国药典与美国药典中记载甘氨酸冲洗液中甘氨酸的含量采用氢氧化钠滴定甘氨酸含量，该方法与原料滴定的缺陷一致，也容易受杂质干扰影响含量測定結果。宁嘯骏等人在《高效液相色谱法测定含乳饮料中游离甘氨酸的方法研究》一文中公开了甘氨酸的含量测定方法，将样品中游离的甘氨酸与蛋白质大分子分离，邻苯ニ甲醛(0ΡΑ)衍生，其衍生产物经高效液相色谱分离，于荧光检测器检测，测得含乳饮料中游离甘氨酸的含量。衍生化反应虽然也提高专属性，但衍生化反应容易损坏色谱柱，缩短色谱柱使用寿命，衍生化反应容易受衍生化试剂用量、种类、衍生化时间、温度等条件影响，方法的精密度、准确度、重现性等容易受到影响。可以看出，现有甘氨酸的含量检测方法均存在一定局限性和弊端。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种甘氨酸含量的測定方法，该方法操作简单、专属性强、准确度高。本发明所述技术问题由以下技术方案实现的。一种甘氨酸含量的測定方法，它应用氰基柱或氨基柱采用高效液相色谱法直接测定甘氨酸含量。上述含量測定方法，所述高效液相色谱法所使用的流动相为こ腈和磷酸盐溶液。上述含量测定方法，所述磷酸盐溶液(5-100mmol/L)与こ腈的体积比比例为10 90 60 :40，优选 25 75 35 :65。上述含量測定方法，所述磷酸盐溶液，其中磷酸盐选自磷酸氢ニ铵、磷酸ニ氢铵、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钾、磷酸ニ氢钾中的ー种或几种，优选的，上述磷酸盐溶液中加入O. 1%-5%，体积百分比的三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー种或几种。上述含量測定方法，所述磷酸盐溶液中的磷酸盐为三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー种或几种中加入磷酸后所成的盐。上述含量测定方法，所述磷酸盐溶液的pH为2. O 7. 0，优选3. O 4. 5。上述含量測定方法，所述高效液相色谱法使用的检测波长为199nm，柱温为25 45°C，流速为 O. 5 2. Oml/min。本专利发明人在采用氰基柱或氰基柱对甘氨酸进行含量测定时，发现ー个奇怪的现象，就是直接以こ臆-水为流动相，对供试品和对照品进行液相检测，在最大吸收波长 (199nm)条件下，在2个小时内无明显色谱峰出现，氰基柱基线一直很平，重复三针均无色谱峰出现。而采用氨基柱，到一定时间后发现色谱图上基线上扬，出现很大的鼓包，峰型极其不好，理论板数趋于零。分析原因可能为采用氰基柱时，以こ臆-水为流动相系统，色谱柱键合氰基的硅胶封尾不完全，硅胶上部分裸露的羟基在流动相为こ臆-水的环境下与氨基酸的氨基发生反应，导致甘氨酸直接吸附在色谱柱上而不出峰。采用氨基柱时，在こ腈-水的流动相系统条件下，氨基酸的羧酸直接与氨基柱上的氨基键合成盐而造成峰型极其不好。经过对氨基柱、氰基柱的分离原理分析、键合硅胶的性质研究、甘氨酸的分子结构和理化性质研究以及大量的科学试验，本专利发明人巧妙的解决了氰基柱、氨基柱吸附甘氨酸的现象。当采用氰基柱时，采用流动相中的铵离子封闭色谱柱上硅胶上部分裸露的羟基，从而防止氨基酸的氨基与羟基结合，影响色谱峰峰型。采用新的色谱条件后，采用氰基柱或氨基柱，甘氨酸的色谱峰出峰良好，理论板数、对称因子、保留时间等參数均能满足含量測定要求，因而完成本发明。


图I流速和pH值对保留时间影响的3D趋势 图2流速和柱温对保留时间影响的3D趋势 图3流速和pH值对对称因子影响的3D趋势 图4流速和pH值对理论板数影响的3D趋势 图5流速和柱温对理论板数影响的3D趋势 图6流速和柱温对压カ影响的3D趋势 图7进样浓度为O. 3mg/ml的色谱 图8进样浓度为O. 5mg/ml的色谱 图9进样浓度为O. 7mg/ml的色谱 图10进样浓度为O. 9mg/ml的色谱 图11进样浓度为I. Omg/ml的色谱图；图12O. 3-1. Omg/ml浓度范围内浓度与峰面积的线性关系；
图13 こ腈比例和流速对保留时间影响的3D趋势 图14 pH和流速对对称因子影响的3D趋势 图15pH和こ腈比例对理论板数影响的3D趋势图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进ー步详细说明，所列举实施例仅用于说明本发明而非对本发明的专利保护范围做出限制。
对照溶液与供试溶液的配置如下
对照溶液精密称取甘氨酸对照品约12. 5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇勻，即得。供试溶液精密称取甘氨酸原料药约12. 5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。实施例I
甘氨酸含量检测的色谱条件初筛。こ腈与水或磷酸盐比例见表I，检测波长199nm ;流速lml/min ;柱温30°C ;进样量5μ1。表I初筛条件及结果
jf￥ I色谱柱I乙腈I水I磷酸盐溶液 I主峰保留时间
1_,氰基柱 70_^30 O_不出峰_^
2氰基柱60 :40 0 不出峰
3氰基柱80 '_20 O 不出峰
4_,氰基柱 70_'0_30_约4分钟_'
5:氰基柱65 :0 35 不到3分钟 :
6:氨基柱70 :30 0 基线上漂，出馒头峰 :
7氨基柱60 40 O 基线上漂，出馒头峰 :
8_'氨基柱 80_^20 O_基线上漂，出馒头峰_^
9氨基柱70 :0 30 约6分钟
10[氨基柱[65 ]0 J35 m 5分钟实施例2
采用氰基柱优化色谱条件。色谱柱Venusil XBP-CN氰基柱(4. 6mmX 250mm, 5Mm);采用磷酸氢ニ铵为磷酸盐溶液，pH调节、流速、柱温见表2，检测波长199nm ;进样量5μ1。表2色谱条件3因素2水平的试验设计方案__
序号乙月青比例(%) 波长(nm) pH {g 流速(ml/min) 柱温(°C )
11701993.0 I. 535
12701993.0 I. 525
13701993.0 0.825
14701993.0 0.835
15701994.0 I. 535
16701994.0 0.825
17701994.0 I. 525
181701199 [4.0 ]θ. 8]35分别统计8组实验甘氨酸的保留时间、不对称因子、理论板数、柱压力，结果见表3。
表3因子设计的试验结果
权利要求
1.一种甘氨酸含量的測定方法，其特征在于，该方法应用氰基柱或氨基柱采用高效液相色谱法对甘氨酸进行含量測定。
2.根据权利要求I所述的含量測定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法所使用的流动相为こ腈和磷酸盐溶液。
3.根据权利要求2所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液5-lOOmmol/L，它与こ腈的(体积比)比例为10 90 60 40o
4.根据权利要求3所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液20-50mmol/L，它与こ腈的(体积比)比例为20 80 40 60o
5.根据权利要求4所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液，其中磷酸盐选自磷酸氢ニ铵、磷酸ニ氢铵、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钾、磷酸ニ氢钾中的ー种或几种。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液中加入O. 1%_5%体积百分比的三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー种或几种。
7.根据权利要求5所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液的pH为2.O .7.O。
8.根据权利要求7所述的含量測定方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液的pH为2.5 .5.5o
9.根据权利要求8所述的含量測定方法，其特征在干，所述高效液相色谱法所用检测波长为199nm，柱温为25 45°C，流速为O. 5 2. Oml/min。
全文摘要
一种甘氨酸的含量测定方法，它应用氰基柱或氨基柱采用高效液相色谱法对甘氨酸进行含量测定，具体步骤为1、取甘氨酸原料和对照品溶于水中，分别制成对照溶液和供试品溶液；2、应用氰基柱或氨基柱采用高效液相色谱法检测甘氨酸含量，以乙腈和磷酸盐的水溶液为流动相，检测波长为199nm，分别取等体积的对照溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用外标法计算甘氨酸原料含量。该方法操作简单、专属性强、准确度高。
文档编号G01N30/02GK102841151SQ201210317899
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者田建宣, 刘福利, 李慧英, 高津凤, 孟建, 田学文, 岳丽娜, 赵晓雷, 张伟锋, 李巍, 武永德 申请人:石家庄中硕药业集团有限公司