专利名称：基于脂质体包埋多巴胺的电化学免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及电化学免疫领域，特别涉及一种基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法。
背景技术：
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居全球首位，并呈逐年增多的趋势。小细胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)是恶性程度最高的肺癌，病例占所有肺癌病例的15 20%，肿瘤细胞具有分化程度低、倍增时间短、分裂指数高、早期易出现远处转移等特异的生物学行为，对放疗和化疗高度敏感，多数患者病情发展快，短期内死亡，因此，对小细胞肺癌进行早期诊断、制定合理治疗方案及评估疗效尤为重要。目前用于肺癌辅助诊断的主要方法有胸片、CT、以及痰细胞学检查等，而血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、易于接受等特点，在肿瘤筛查、诊断、评价疗效等方面具有较大的实用价值。胃泌素释放肽(GRP)是由McDonald等在1978年从猪的胃组织中分离出一种具有促胃泌素分泌作用的胃肠道激素，是有效促分泌素或调节肽，由27个氨基酸组成的肠、脑肽。研究者发现胃泌素释放肽(GRP)可存在于正常人脑、胃的神经纤维以及胎儿肺的神经内分泌组织中。许多小细胞肺癌(SCLC)细胞株和肿瘤组织中也分泌胃泌素释放肽(GRP)， 且富含胃泌素释放肽(GRP)受体，因此，胃泌素释放肽(GRP)可以作为小细胞肺癌的标志物。但是由于胃泌素释放肽(GRP)可被肽链端解酶快速降解，所以很难在血清中检测到。 胃泌素前体释放肽O^roGRP)是胃泌素释放肽(GRP)的前体结构，由于结构稳定，因此可在血浆中稳定表达，且胃泌素前体释放肽的水平可以间接反映胃泌素释放肽(GRP)的水平和胃泌素释放肽(GRP)基因的表达水平，因此胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)作为新的标志物在小细胞肺癌(SCLC)诊断及疾病进展监测等方面的临床价值日益受到关注。日本学者山口研究表明这一标志物的敏感性为76%，特异性为97%，阳性结果预测值94%，阴性结果预测值87%，胃泌素前体释放肽(ProGRP)的水平和治疗反应具有较好的相关性。综合国内外的报道结果，胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)作为小细胞肺癌(SCLC)新的标记物，具有敏感性高、特异性强的特点，并可准确反映小细胞肺癌(SCLC)病情及对化疗的反应。因此，将对小细胞肺癌(SCLC)的诊断具有较高敏感度，特异度和准确率的胃泌素前体释放肽作为提示小细胞肺癌(SCLC)的血清肿瘤标志物，可为临床鉴定小细胞肺癌(SCLC)提供参考依据。 胃泌素前体释放肽作为血清肿瘤标志物，不仅可用于小细胞肺癌(SCLC)的早期诊断，还有助于判断治疗效果及早期发现肿瘤复发。目前，国内外采用酶联免疫方法测定胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)已处于临床应用阶段，但是酶联免疫法灵敏度不高，不易检测出痕量胃泌素前体释放肽(ProGRP)，影响对小细胞肺癌(SCLC)检测的准确性。电化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号，进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。电化学发光(ECL)与化学发光(CL)的差异在于，电化学发光(ECL)是电启动发光反应，而化学发光(CL)是通过化合物混合启动发光反应。因此，电化学发光(ECL)反应易精确控制，具有灵活性和稳定性。电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化学检测结合的一种免疫分析新方法，基于抗原和抗体的特异性反应，将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量，兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。电化学免疫分析的标记物主要有两类生物酶及电化学活性物质。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子和电活性的有机功能基团。脂质体，是由两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起避开水相，而亲水头部暴露在水相形成的具有双分子层结构的封闭囊泡，可以通过表面修饰和内部包埋成为各种功能分子的载体，而且这些功能分子的释放是可控的。因此， 提供一种灵敏度高、特异性好的基于脂质体包埋电活性分子的电化学免疫检测方法用来检测胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)，对小细胞肺癌(SCLC)的早期诊断、病情监测、判断预后及其制定合理的治疗方案和评估疗效具有重要意义。

发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法，使固载的胃泌素前体释放肽O^roGRP)抗体与待测样品中胃泌素前体释放肽O^roGRP)发生特异性免疫反应，再用包埋多巴胺的小单层脂质体和胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体的共耦合物检测，然后用表面活性剂TritionX-IOO破乳， 释放出电活性分子多巴胺，利用多壁碳纳米管(MWNT)修饰的玻碳电极作为工作电极，通过检测多巴胺的线性扫描伏安峰电流信号强度来检测待测样品中胃泌素前体释放肽的浓度。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了一种电化学免疫检测方法，包括如下步骤步骤1 包埋多巴胺的小单层脂质体与待检蛋白抗体共耦合物的制备在戊二醛溶液中逐滴加入包埋多巴胺的小单层脂质体，温育后透析，加入待检蛋白抗体溶液，反应后加入封闭液温育，制得包埋多巴胺的小单层脂质体与待检蛋白抗体共耦合物；步骤2 向固载了待检蛋白抗体的微孔板中加入含有不同浓度待检蛋白的标准品温育，加入封闭液温育，用PBS冲洗，向微孔板中加入所述包埋多巴胺的小单层脂质体与待检蛋白抗体共耦合物温育后，用PBS溶液冲洗，加入表面活性剂在室温下破乳，制得检测溶液；从微孔板中取所述检测溶液，转移到电化学测试池中，采用线性扫描伏安法，以多壁碳纳米管修饰的玻碳电极为工作电极，钼丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，进行电化学发光测试，以标准品中待检蛋白的浓度为横坐标，以相应的电化学峰峰电流为纵坐标，制作标准曲线；步骤3 向固载了待检蛋白抗体的微孔板中加入待检样品温育，如步骤2进行电化学发光测试，测得待测样品的电化学峰峰电流强度，从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。本发明所述的包埋多巴胺的小单层脂质体的制备方法，包括如下步骤将二棕榈酰磷脂酰胆碱与脑磷脂的混合物与氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，减压旋转蒸发后， 加入含有多巴胺的磷酸缓冲溶液，溶胀制得包埋多巴胺的多层脂质体囊泡，将所述包埋多巴胺的多层脂质体囊泡超声处理，制得包埋多巴胺的小单层脂质体。
脂质体是由两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成的具有双分子层结构的封闭囊泡，直径 25 IOOOnm不等。磷脂是一类含有磷酸的脂类，机体中主要含有两大类磷脂，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂(phosphoglyceride)；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂(sphingolipid)。具有由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)构成的亲水头 (hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobictail)。在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧。磷酸甘油酯(phosphoglycerides)主链为甘油-3-磷酸，甘油分子中的另外两个羟基都被脂肪酸所酯化，磷酸基团又可被各种结构不同的小分子化合物酯化后形成各种磷酸甘油酯。体内含量较多的是磷脂酰胆碱(卵磷脂)、 磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷酯)及磷酯酰肌醇等，每一磷脂可因组成的脂肪酸不同而有若干种。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等。卵磷脂，化学名称为磷脂酰胆碱，是存在于动植物组织以及卵黄之中的一组黄褐色的油脂性物质，其构成成分包括磷酸、胆碱、脂肪酸、 甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。DPPC, dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，二棕榈酰磷脂酰胆碱，一种化学试剂，可用于合成脂质体。脑磷脂，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸的统称，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺组成的一种磷脂，在体内广泛分布，尤富集于脑和脊髓。脂质体按照其大小及和层数(脂质体中双分子层的数目)一般分为三类多层囊 (MLV)、大单层囊(LUV)和小单层囊(SUV)，其主要成分是磷脂。多层囊(MLV)，粒径在1 5ym之间；大单层囊(LUV)，为单层大泡囊，粒径在0. 1 Ιμπι;小单层囊(SUV)，粒径约 0. 02 0.08 μ m。作为优选，本发明选用小单层脂质体，便于在后续试验中破乳。脂质体具有亲油亲水性及其很强的适应性和无害的天然成分，其包裹范围很广，亲脂性物质、两性物质以及水溶性物质成分都可以被包裹，因此可作为药物或电活性物质的载体。目前，关于脂质体的相关研究已涉及药物传输，膜工程学，生物传感器等领域。通常，脂质体的大小从直径几十纳米到几十微米，相比其它几种纳米颗粒，其制备简单，能有效抑止非特异性吸咐且生物相容性好。最重要的是脂质体可以通过表面修饰和内部包埋成为各种功能分子的载体，而且这些功能分子的释放是可控的。利用脂质体作为免疫测定中的多功能载体，将不同的信号物质，如电活性物质、光活性物质、生物酶蛋白等包裹在脂质体内部水相中，其表面可以通过各种物理或化学方法修饰官能团，使得功能化的脂质体被广泛的应用于免疫传感器及基因传感器的构建中。脂质体的制备方法有多种，薄膜分散法是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理后得到小单层脂质体(小单室脂质体)。此法操作简便，脂质体结构典型， 因此，本发明采用薄膜分散法，用二棕榈酰磷脂胆碱和脑磷脂来制备脂质体。多巴胺(Dopamine)，化学名称为4-(2-乙胺基)苯_1，2_ 二醇，简称DA，化学式为C8H11NO2，摩尔质量为153. 178g/mol。多巴胺为下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，是神经氨酸酶(NA)的前体，具有良好的电化学活性，帮助细胞传送脉冲。因此，多巴胺 (Dopamine)作为电活性分子应用于电化学免疫检测技术中，具有安全无毒的特点。本发明选用多巴胺作为电活性分子，包埋于小单层脂质体中，提供了基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法，来检测待测样品中胃泌素前体释放肽的浓度。为了除去非特异性结合位点，本发明采用封闭液牛血清白蛋白。为了保证充分结合，本发明选用温育的温度为20 40°C。为了保证充分结合，本发明选用温育的时间为40 120min。作为优选，所述表面活性剂为TritonX-100。优选地，本发明所述的包埋多巴胺的小单层脂质体的制备方法，包括如下步骤步骤1 将摩尔比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；步骤2 减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL含有0. lg/mL多巴胺的磷酸缓冲溶液后，在40 60°C的水浴中溶胀40 80min，剧烈混勻制得包埋多巴胺的多层脂质体囊泡；步骤3 将所述包埋多巴胺的多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心10 20min，制得包埋多巴胺的小单层脂质体。作为优选，制得的所述包埋多巴胺的单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。本发明还提供了所述制备方法制得的包埋多巴胺的小单层脂质体。作为优选，所述多壁碳纳米管修饰的玻碳电极的制备方法为，玻碳电极经Al2O3糊抛光后超声洗涤，制得处理后玻碳电极，用浓硝酸-浓硫酸混合溶液处理多壁碳纳米管，水洗后真空干燥，分散于DMF溶液中，超声处理，制得多壁碳纳米管溶液，将所述多壁碳纳米管溶液滴加在所述处理后玻碳电极表面，制得所述多壁碳纳米管修饰玻碳电极。优选地，所述多壁碳纳米管(MWNT)修饰玻碳电极的制备方法，包括如下步骤步骤1 玻碳电极(Φ = 4mm)依次经1. 0,0. 3,0. 05 μ m的Al2O3糊抛光后用蒸馏水冲洗干净，再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤，置于室温下晾干，制得处理后玻碳电极；步骤2 用体积比为1 1的浓硝酸-浓硫酸混合溶液于80°C处理多壁碳纳米管 (MWNT) 5h，水洗后真空干燥，制得处理后多壁碳纳米管(MWNT)；步骤3 取5. Omg所述处理后多壁碳纳米管(MWNT)分散于5mL 4 6 %的DMF溶液中，超声30min，制得多壁碳纳米管(MWNT)溶液；步骤4 取6 10 μ L所述MWNT溶液滴加在所述处理后玻碳电极表面，于室温下放置晾干，制得所述多壁碳纳米管(MWNT)修饰玻碳电极，于4°C的冰箱中保存备用。二甲基甲酰胺(DMF)分子式为C3H7NO,分子量为73. 10，是一种透明液体，能和水及大部分有机溶剂互溶，是化学反应的常用溶剂。碳纳米管是继C6tl之后发现的碳的又一同素异形体，是一种具有特殊结构(径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量级，管子两端基本上都封口)的一维量子材料。碳纳米管具有典型的层状中空结构特征，构成碳纳米管的层片之间存在一定的夹角。碳纳米管的管身是准圆管结构，由六边形碳环微结构单元组成，端帽部分由含五边形的碳环组成的多边形结构，或者称为多边锥形多壁结构。层与层之间保持固定的距离，约为0. 34nm，直径一般为2 20nm。其径向尺寸较小，管的外径一般在几纳米到几十纳米，管的内径更小，有的只有Inm左右；而其长度一般在微米级，长度和直径比非常大，可达IO3 106。因此，碳纳米管被认为是一种典型的一维纳米材料。碳纳米管的独特结构决定了它具有许多特殊的物理和化学性质。组成碳纳米管的C = C共价键是自然界最稳定的化学键，所以使得碳纳米管具有非常优异的力学性能。碳纳米管既具有碳素材料的固有本性，又具有金属材料的导电和导热性，陶瓷材料的耐热和耐腐蚀性，纺织纤维的可编织性，以及高分子材料的轻质、易加工性。碳纳米管按照石墨烯片的层数分类可分为单壁碳纳米管(Single-walled nanotubes, SffNT)和多壁碳纳米管(Multi-walled nanotubes,MffNT) 因此，本发明提供的基于所述包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法中，选用多壁碳纳米管(MWNT) 修饰玻碳电极作为工作电极。作为优选，所述线性扫描伏安法扫描范围为-0. 2 0. 8V，扫速为50mV/s。作为优选，本发明所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。肿瘤标志物(Tumor Marker)由肿瘤组织自身产生，可反映肿瘤存在和生长的一类生化物质，它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。主要有胚胎抗原、糖类抗原、天然自身抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶、激素以及某些癌基因等。肿瘤标志蛋白是由肿瘤组织自身产生，可反映肿瘤存在和生长的蛋白类物质。电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化学检测结合的一种免疫分析新方法，基于抗原和抗体的特异性反应，将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量，兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。因此，本发明提供的电化学检测方法可以通过抗原抗体的特异性反应，用来检测肿瘤标志蛋白。优选地，所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、 CYFRA21-U AFP、APT、CEA、CA242、CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、 Free β-hCG、SCCA, β2-MG。肿瘤标志蛋白按照肿瘤组织产生不同，包括分化抗原；胚胎抗原(AFP，CEA)；同工酶(NSE)；激素(HCG)；组织特异性抗原(PSA，freePSA)；粘蛋白、糖蛋白、糖脂(CA125)；电化学发光仪上常可检验一下标志物AFP、CEA、CA199、CA724、CA125、CA153、NSE、Cyfra21-l、 PSA、free PSA。AFP、APT :主要相关肿瘤肝细胞癌和生殖细胞癌；其它相关肿瘤胚胎细胞癌、卵巢畸胎瘤、胃癌、胆道癌、胰腺癌等。CEA 主要相关肿瘤广谱的肿瘤标志物；其它相关肿瘤常见于肺癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。CA242 主要相关肿瘤胰腺癌、胃、结肠癌；其它相关肿瘤肝癌、食管癌、肺癌。CA125 主要相关肿瘤卵巢癌；其它相关肿瘤肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃肠道恶性肿瘤、子宫癌。CA199 主要相关肿瘤胰腺癌、胆管癌、结直肠癌；其它相关肿瘤肝癌、胆囊癌、 胆管癌等。CA153 主要相关肿瘤乳腺癌的首选标志物；其它相关肿瘤肺癌、卵巢癌、肺腺癌、结直肠癌等均可增高。CA724 主要相关肿瘤胃癌的最佳肿瘤标志物之一；其它相关肿瘤对其他胃肠道癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等也有不同检出率。CA50 主要相关肿瘤胰腺和结、直肠癌的标志物；其它相关肿瘤胃癌、胆囊癌、 肝癌、肺癌、乳腺癌。NSE、胃泌素前体释放肽主要相关肿瘤小细胞肺癌；其它相关肿瘤肺腺癌、大细胞肺癌。CYFRA21-1 主要相关肿瘤肺鳞癌、宫颈癌、食管癌；其它相关肿瘤膀胱癌、鼻咽癌、卵巢癌、胃肠道癌。f-PSA 主要相关肿瘤前列腺癌；其它相关肿瘤某些妇科肿瘤和乳腺癌。t-PSA 主要相关肿瘤前列腺癌；其它相关肿瘤某些妇科肿瘤、多囊卵巢综合症、乳腺癌。Free^-hCG 主要相关肿瘤妇科肿瘤和非精原性睾丸癌；其它相关肿瘤乳腺癌、精原性睾丸癌、肺癌、肝癌等。SCCA 主要相关肿瘤宫颈鳞癌；其它相关肿瘤肺鳞癌、头颈部鳞癌、食管癌以及外阴部鳞状细胞癌等。β 2-MG 主要相关肿瘤恶性肿瘤辅助性标志物，慢性淋巴细胞白血病、淋巴细胞肉瘤、多发性骨髓瘤等尤为明显。其它相关肿瘤肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及子宫颈癌中也可见升高。优选地，所述待检蛋白为胃泌素前体释放肽。作为优选，本发明提供的一种电化学免疫检测方法，包括如下步骤步骤1 包埋多巴胺的小单层脂质体与胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体共耦合物的制备在0. 5mL 2. 0 3. 0%的戊二醛溶液中逐滴加入所述包埋多巴胺的小单层脂质体，在室温下搅拌反应40 80min，在4°C下置于磷酸缓冲液中透析12h，除去过量的戊二醛分子，制得醛基化的包埋多巴胺的小单层脂质体；取200 300μ L的胃泌素前体释放肽 (ProGRP)抗体溶液，缓慢加入到200 300 μ L所述醛基化的包埋多巴胺的小单层脂质体中，充分混勻后在25°C下持续搅拌反应1 2h，加入40 80 μ L 0. 25%的牛血清白蛋白溶液，以封闭所述醛基化的包埋多巴胺的小单层脂质体表面未反应的醛基，并在25°C下温育反应1 2h，制得包埋多巴胺的小单层脂质体与胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体共耦合物，于4°C保存备用；步骤2 向固载了 ftx)GRP抗体的微孔板中加入待检样品，于37°C反应lh，再加入 80 120 μ L 0. 25% BSA溶液，以封闭非特异性异常结合位点；反应完成后用PBS冲洗去掉未结合的样品蛋白和BSA ；向微孔板中加入80 120 μ L包埋多巴胺的小单层脂质体与胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体共耦合物，在37°C下反应lh，用PBS溶液洗3次，以除去非特异性吸咐的脂质体，再加入80 120 μ L 1. 2mmol/L的TritonX-100溶液在室温下培育20min，使所述包埋多巴胺的小单层脂质体与胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体共耦合物中的脂质体破乳，制得检测溶液；从固载了胃泌素前体释放肽O^roGRP)抗体的微孔板中取80 120μ L所述检测溶液，转移到电化学测试池中，采用线性扫描伏安法(扫描范围-0. 2 0. 8V，扫速为50mV/s)，以制备好的多壁碳纳米管(MWNT)修饰的玻碳电极为工作电极，钼丝电极作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，进行电化学发光测试，以标准品中待检蛋白的浓度为横坐标，以相应的电化学峰峰电流为纵坐标，制作标准曲线；步骤3 向固载了待检蛋白抗体的微孔板中加入待检样品温育，如步骤2进行电化学发光测试，测得待测样品的电化学峰峰电流强度，从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。本发明提供了一种基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法。该检测方法通过胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体与待测样品中胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)发生特异性免疫反应，加入包埋多巴胺的小单层脂质体和胃泌素前体释放肽O^roGRP)抗体的共耦合物，经表面活性剂TritonX-IOO破乳，释放出电活性分子多巴胺，利用多壁碳纳米管(MWNT)修饰的玻碳电极作为工作电极，通过检测多巴胺的线性扫描伏安峰电流信号强度来检测待测样品中胃泌素前体释放肽的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为50 1000pg/mL，检测下限为16pg/mL，特异性好，灵敏度高，对小细胞肺癌(SCLC) 的诊断具有重要意义。


图1示实施例5中基于所述包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法制得的胃泌素前体释放肽O^roGRP)标准曲线，横坐标为胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)标准品的浓度，单位为pg/mL;纵坐标为检测得到多巴胺(DA)的峰电流均值，单位为μΑ。图2示实施例6中基于所述包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法制得的胃泌素前体释放肽O^roGRP)标准曲线，横坐标为胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)标准品的浓度，单位为pg/mL;纵坐标为检测得到多巴胺(DA)的峰电流均值，单位为μΑ。图3示实施例7中基于所述包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法制得的胃泌素前体释放肽O^roGRP)标准曲线，横坐标为胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)标准品的浓度，单位为pg/mL;纵坐标为检测得到多巴胺(DA)的峰电流均值，单位为μΑ。图4示实施例8中基于所述包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法制得的胃泌素前体释放肽O^roGRP)标准曲线，横坐标为胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)标准品的浓度，单位为pg/mL;纵坐标为检测得到多巴胺(DA)的峰电流均值，单位为μΑ。
具体实施例方式本发明公开了一种基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明本发明中二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、脑磷脂(PE)、多巴胺(DA)、胃泌素前体释放肽O^roGRP)、胃泌素前体释放肽(ftx)GRP)抗体、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均购自美国 Sigma公司；多壁碳纳米管(MWNT)购自中国科学院成都有机化学有限公司；人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心，检测组(患者血清)156名，其中男78名，女
978名；对照组(正常人血清)100名，其中男50名，女50名。实施例1制备包埋多巴胺的小单层脂质体将摩尔比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与 IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL含有0. lg/mL多巴胺的磷酸缓冲溶液后，在40°C 的水浴中溶胀80min，剧烈混勻制得包埋多巴胺的多层脂质体囊泡；将所述包埋多巴胺的多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心15min，制得包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述包埋多巴胺的小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。实施例2制备包埋多巴胺的小单层脂质体将摩尔比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与 IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL含有0. lg/mL多巴胺的磷酸缓冲溶液后，在50°C 的水浴中溶胀60min，剧烈混勻制得包埋多巴胺的多层脂质体囊泡；将所述包埋多巴胺的多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心lOmin，制得包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述包埋多巴胺的小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。实施例3制备包埋多巴胺的小单层脂质体将摩尔比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与 IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL含有0. lg/mL多巴胺的磷酸缓冲溶液后，在60°C 的水浴中溶胀40min，剧烈混勻制得包埋多巴胺的多层脂质体囊泡；将所述包埋多巴胺的多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心20min，制得包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述包埋多巴胺的小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。实施例4包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学检测将实施例1至3中制备的包埋多巴胺的小单层脂质体进行电镜扫描，所述包埋多巴胺的小单层脂质体轮廓清晰，粒径为0. 02 0. 08 μ m。对照组1 制备未包埋多巴胺的小单层脂质体将物质的量的比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL磷酸缓冲溶液后，在40°C的水浴中溶胀80min，剧烈混勻制得多层脂质体囊泡；将所述多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心15min，制得未包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。对照组2:制备未包埋多巴胺的小单层脂质体将物质的量的比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL磷酸缓冲溶液后，在50°C的水浴中溶胀60min，剧烈混勻制得多层脂质体囊泡；将所述多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心lOmin，制得未包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。对照组3:制备未包埋多巴胺的小单层脂质体将物质的量的比为3 1的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与脑磷脂(PE)的混合物Img与IOmL体积比为6 1的氯仿-甲醇混合溶液混勻，超声处理，制得W/0乳剂；减压旋转蒸发除去所述W/0乳剂中的有机溶剂，加入2mL磷酸缓冲溶液后，在60°C的水浴中溶胀40min，剧烈混勻制得多层脂质体囊泡；将所述多层脂质体囊泡超声处理，SOOOrpm离心20min，制得未包埋多巴胺的小单层脂质体。制得的所述小单层脂质体分散于PBS溶液中，于4°C保存。对实施例1至3制备的包埋多巴胺的小单层脂质体和对照组1至3制备的未包埋多巴胺的小单层脂质体进行电化学检测向实施例1至3中制备的包埋多巴胺的小单层脂质体与对照组1至3制备的未包埋多巴胺的小单层脂质体中，加入80 120 μ L 1. 2mmol/L的TritonX-100溶液在室温下培育20min，使实施例1至3中制备的包埋多巴胺的小单层脂质体和对照组1至3制备的未包埋多巴胺的小单层脂质体破乳，取相应破乳溶液80 120yL进行电化学检测。采用线性扫描伏安法(扫描范围-0. 2 0. 8V，扫速为50mV/s)，以玻碳电极为工作电极，钼丝电极作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，进行电化学发光测试，检测多巴胺的线性扫描伏安峰电流信号强度。结果见表1。表1电化学检测结果
权利要求
1.一种电化学免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1 制备包埋多巴胺的小单层脂质体与待检蛋白抗体共耦合物；步骤2 向固载了所述待检蛋白抗体的微孔板中加入含有不同浓度待检蛋白的标准品充分结合，除去非特异性结合位点，向微孔板中加入所述包埋多巴胺的小单层脂质体与待检蛋白抗体共耦合物充分结合，加入表面活性剂在室温下破乳，制得检测溶液；从微孔板中取所述检测溶液，转移到电化学测试池中，采用线性扫描伏安法，进行电化学发光测试，以标准品中待检蛋白的浓度和相应的电化学峰峰电流绘制标准曲线；步骤3 向固载了待检蛋白抗体的微孔板中加入待检样品温育，如步骤2进行电化学发光测试，测得待测样品的电化学峰峰电流强度，从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，以多壁碳纳米管修饰的玻碳电极为工作电极。
3.如权利要求2所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述多壁碳纳米管修饰的玻碳电极的制备方法为，玻碳电极经Al2O3糊抛光后超声洗涤，制得处理后玻碳电极，用浓硝酸-浓硫酸混合溶液处理多壁碳纳米管，分散于DMF溶液中，超声处理，制得多壁碳纳米管溶液，将所述多壁碳纳米管溶液滴加在所述处理后玻碳电极表面，制得所述多壁碳纳米管修饰玻碳电极。
4.如权利要求1所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述表面活性剂为 TritonX-100。
5.如权利要求1所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述线性扫描伏安法扫描范围为-0. 2 0. 8V,扫速为50mV/s。
6.如权利要求1至5任一项所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。
7.如权利要求6所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、CYFRA21-1、AFP、APT、CEA、CA242, CA125、CA199、 CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、Free β -hCG、SCCA, β 2-MG。
8.如权利要求7所述的电化学免疫检测方法，其特征在于，所述待检蛋白为胃泌素前体释放肽。
全文摘要
本发明公开了一种基于包埋多巴胺的小单层脂质体的电化学免疫检测方法。该检测方法通过胃泌素前体释放肽(ProGRP)抗体与待测样品中胃泌素前体释放肽(ProGRP)发生特异性免疫反应，加入包埋多巴胺的小单层脂质体和胃泌素前体释放肽(ProGRP)抗体的共耦合物，经表面活性剂破乳，释放出电活性分子多巴胺，利用多壁碳纳米管(MWNT)修饰玻碳电极作为工作电极，通过检测多巴胺的线性扫描伏安峰电流信号强度来检测待测样品中胃泌素前体释放肽的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为50～1000pg/ml，检测下限为16pg/ml，特异性好，灵敏度高，对小细胞肺癌(SCLC)的诊断具有重要意义。
文档编号G01N33/68GK102226810SQ201110075838
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者仲召阳, 关伟, 单锦露, 卿毅, 戴楠, 李梦侠, 王东, 金丰 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院