专利名称：异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种异拧檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬 酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术：
异柠檬酸isocitricacid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生 物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别 多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。拧檬酸在鸟头 酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1丄1.41; EC 1丄1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶 (isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GBT16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其 饮料中D-异柠檬酸的测定方法一紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、 柑、桔浓縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料的总 D-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase 有两种类型以NAD为辅酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP为辅酶 的酶(EC1. 1.1. 42)，两者催化同一反应。
异柠檬酸+NAD(P)+;2 a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + tr 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用， 生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm 处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下
D-异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳+
酮戊二酸+还原型辅酶二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素bl 丙酮酸氧化酶 丙酮酸
+高铁细胞色素bl +水丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+
乙酰辅酶八+还原型辅酶这种方法应用异拧檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41;EC1丄1.42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.2.2)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色法。异柠檬酸脱氢酶，作为作用酶，酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，同时也是显色酶，将辅酶还原成为还原型辅酶；再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶的作用，丙酮酸氧化酶也作为作用酶，利用二氧化碳产生丙酮酸；丙酮酸脱氢酶又作为循环酶又是显色酶， 一面将丙酮酸变回二氧化碳，使之不断循环利用； 一面又将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂盒较为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000U/L
丙酮酸脱氢酶12000 U/L
乙酸10 mmol/L
亚铁细胞色素bl10 mmol/L
辅酶A10 mmol/L
本发明的异柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、异拧檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸
脱氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
辅酶、异拧檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸、亚铁细
胞色素bl、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A。试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一
本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000U/L
丙酮酸脱氢酶12000 U/L
乙酸10 mmol/L
亚铁细胞色素bl10 mmol/L
辅酶A10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25,反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。实施例二
本实施例的异拧檬酸测定试剂为双试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L辅酶
3 mmol/L
乙i
亚铁细胞色素bl
辅酶A
10 mmol/L
10 mmol/L
10 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
异柠檬酸脱氢酶丙酮酸氧化酶
500 mmol/L
10000U/L
12000U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光
度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与
试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延
迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异拧檬酸的浓度
本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L
10乙酸
亚铁细胞色素bl辅酶A
3 mmol/L10 mmol/L10 mmol/L10 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂
丙酮酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
100 mmol/L500 mmol/L12000 U/L12000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
异柠檬酸脱氢酶
500 mmol/L
10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到
ii本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析
仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0009;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达9.987 mmol /L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±7%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2.5%;试剂的灵敏度可达0.0984 ± 0.0049 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法原理如下D-异柠檬酸+辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶二氧化碳+乙酸+亚铁细胞色素b1 <u>丙酮酸氧化酶</u> 丙酮酸 +高铁细胞色素b1+水丙酮酸+辅酶A+辅酶 <u>丙酮酸脱氢酶</u> 二氧化碳+ 乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
2. —种异柠檬酸测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1——6 mmol/L异柠檬酸脱氢酶iooo-——80000 U/L丙酮酸氧化酶1000-——80000 U/L丙酮酸脱氢酶画o画——80000 U/L乙酸1—50 mmol/L亚铁细胞色素bl1—50 mmol/L辅酶A1——50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱 氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述异杆檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱 氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓 冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组 成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成多剂试剂；试剂l，由缓 冲液、稳定剂、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓 冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸 氧化酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸、亚铁细胞色素bl、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乙酸、亚铁细胞色素b1、辅酶A、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464282SQ20071019143
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司