专利名称：热淋清颗粒和头花蓼的薄层色谱指纹图谱的测定方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，特别涉及中药质量评价领域，具体涉及一种热淋清颗粒及其原料药材头花寥的质量评价方法，特别涉及热淋清颗粒及其原料药材头花寥指纹图谱的测定方法，更特别地具体涉及一种通过薄层色谱指纹图谱对热淋清颗粒及不同产地头花寥进行质量评价的方法。
背景技术：
头花寥为寥科植物头花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》2003年版，具清热利湿、抗菌消炎、利尿通淋等功效(贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材民族药材质量标准[M]. 贵阳:贵州科技出版社，2003 :147)。头花寥是贵州常用苗药，是贵州省中药现代化重点发展的“六大苗药”和重点培育发展的“七大中药产业链”的品种之一。本发明的申请人已在贵州施秉及贵阳乌当区建立了头花寥规范化种植基地，并通过国家GAP认证。现在有关头花寥GAP种植及化学成分等方面的研究已取得一定成果(孙长生，韩见宇，杨锦纲，等.头花寥GAP种植基地的环境质量评价[J].中药研究与信息，2005，7 (2) 27 30)，但头花寥药材现行质量标准较为简单，仅以单一成分槲皮素为指标进行评价，无法达到真实、全面反应药材内在品质的目的。CN101091749A公开了一种头花寥药材、提取物及其质量控制方法，其中的头花寥药材具有如HPLC指纹图谱，含有13个特征峰，其中色谱条件为色谱柱依利特HYPERSIL ODS色谱柱(4.6mmX150mm，5iim);柱温25°C ;流动相乙腈(A)-O. 4%磷酸⑶溶液二元梯度洗脱，重量百分比为0-30% 100-70% ;流速0. 8mL min—1 ;检测波长3IOnm ;进样量20yL。该发明质控制方法对不同产地头花寥进行了考察比较，构建了头花寥HPLC的指纹图谱。CN102296118A公开了一种DNA分子标记鉴别技术鉴别头花寥与尼泊尔寥的方法， 在该发明中，以贵州具有代表性的民族药头花寥为研究对象，探索使用RAro分析方法对头花寥与尼泊尔寥进行遗传多样性分析；并在RAPD的实验基础上，将RAPD方法转化为SCAR 标记，为头花寥与尼泊尔寥的药材鉴定提供了准确可靠、快速稳定的方法。DNA分子标记鉴别技术同样不适合药材的常规质量评价和控制。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20 世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA. Guidanceof Industy Botanical Drug(Draft). 2000August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从发展趋势看，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国 Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言,其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效及安全性。 然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga loside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。然而就头花寥药材的质量评价，例如就产地差异对头花寥药材进行质量评价，或者对药材的真伪进行鉴别，以及就由头花寥制备得到的提取物或者制剂，例如热淋清颗粒， 迄今为止尚无一从整体上控制样品质量的适用的常规检验方法。因此，本领域仍然需要有一从整体上控制头花寥药材提取物或者制剂例如热淋清颗粒质量评价的方法，特别是可以用于头花寥药材真伪鉴别以及药材、提取物或制剂简便、宏观、可行的质量判定方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种适合常规使用的用于热淋清颗粒及其原料药材头花寥质量评价的方法，特别是可以用于热淋清颗粒及其头花寥药材真伪鉴别和/或初步质量判定的方法。本发明人发现采用一种独特的薄层色谱法(TLC)方法可以有效地实现至少一个上述的目的，该方法可以有效地为客观、准确地评价热淋清颗粒及其头花寥药材的品质， 为热淋清颗粒及头花寥药材质量标准提升以及头花寥药材优良种源选育、规范化生产提供参考依据。本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明第一方面提供了一种头花寥药材指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥药材粉末，加水超声处理，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花寥供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；(b)薄层层析采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂， 置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花寥药材的指纹图谱。
在本发明中，所述“薄层色谱法”的一般操作规范可以不作限定。在第一方面方法的一个实施方案中，所述的薄层色谱法可以是记载于包括但不限于下列文件中的方法中华人民共和国药典2010年版一部附录VI B、中华人民共和国药典2010年版二部附录VB、 中华人民共和国药典2005年版一部附录VI B、中华人民共和国药典2005年版二部附录VB
坐寸o根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述头花寥供试品溶液是用如下方法配制的取头花寥药材粉末，至容量瓶中，加水适量，超声处理，放冷，用水定容至刻度， 滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中超声处理是以功率250W、频率33kHz 的条件超声处理15 60min,优选20 40min,例如约30min。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述头花寥供试品溶液是用如下方法配制的取头花寥药材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、频率33kHz 超声处理30min，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL 的对照品溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2 IOii L，优选 2 ~ 6 u L,例如 4 u L，例如 5 u I。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，点样液点样于距薄层板底边IOmm 处。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，展开距离为7 15cm，例如7 12cm,例如7 IOcm,优选8cm。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，使用体积比为7 6.5 2.5 3 的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液进行二次展开。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20°C，相对湿度至小于88% (优选小于72%，更优选小于50% )的条件下进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4yL，用半自动点样仪点于距薄层板底边IOmm处；用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20°C、相对湿度至小于88%的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡 15min，上行展开，展距8cm;用体积比为7 6. 5 2. 5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(C)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/或扫描仪扫描。照相处理和/或扫描仪扫描可以容易获得展开的薄层板上的斑点和色谱峰，对于进一步对结果进行评价是有益的。根据本发明第一方面的方法，其中还包括步骤(d)对薄层色谱图进行分析包括5个共有峰/斑点的薄层色谱指纹图谱所对应的药材可初步判定为头花寥药材正品，无5个共有峰/斑点则可判定为伪品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，并且第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，相同取样量、相同点样量的条件下，如果某批次药材的5个共有峰/斑点强度与同时展开的其它批次药材相比更强，则表明该批次药材质量比其它批次药材更好。由于本发明第一方面的方法中制备供试液时是使用水为溶剂作为提取液，而现有的头花寥制剂以及制备该制剂的头花寥提取物多是使用水或者含水乙醇作为溶剂提取得到，因此本发明第一方面的方法在供试品溶液的制备过程中作微小的变化即可适用于现有的头花寥制剂以及制备该制剂的头花寥提取。例如，中国药典2010年版收载的热淋清颗粒，其制备方法中记载了头花寥的提取方法，使用该方法，由药材提取至获得浸膏(即头花寥提取物)，加上适量淀粉和/或蔗糖可以进一步制成无糖型或者含糖型的热淋清颗粒。此外，市售的热淋清片、胶囊剂等头花寥制剂，它们均是用或者类似地用中国药典2010年版收载的热淋清颗粒所记载的头花寥提取方法获得浸膏，再加入常规药用辅料制备成片剂和胶囊剂，这些常规药用辅料通常在本发明TLC方法下不会显示色谱斑点，因此，在本发明的一个实施方案中，术语“头花寥制剂”，其在为实现本发明目的的意义方面，其含义与头花寥提取物、热淋清颗粒、热淋清片、热淋清胶囊等术语等同(即这些样品均适合使用本发明方法来测定薄层色谱指纹图谱)。因此，本发明第二方面提供了一种头花寥制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花寥提取物的指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；以及如本发明第一方面任一实施方案所述的步骤(b)、步骤(C)、和任选的步骤 ⑷。根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；(b)薄层层析采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7 :6. 5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的指纹图谱。根据本发明第二方面的方法，其中所述步骤(a)中还任选地包括在萃取之前用水溶解所述头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的步骤。在此溶解步骤之后再如步骤
(a)所述用乙酸乙酯进行萃取。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，所述供试品溶液是用如下方法配制的取头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物，至容量瓶中，加水溶解，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL 的对照品溶液。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2 IOii L，优选 2 ~ 6 u L,例如 4 u L，例如 5 u I。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，点样液点样于距薄层板底边IOmm 处。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，展开距离为7 15cm，例如7 12cm,例如7 IOcm,优选8cm。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，使用体积比为7 6.5 2.5 3 的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液进行二次展开。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20°C，相对湿度至小于88% (优选小于72%，更优选小于50% )的条件下进行的。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4yL，用半自动点样仪点于距薄层板底边IOmm处；用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20°C、相对湿度至小于88%的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡 15min，上行展开，展距8cm;用体积比为7 6. 5 2. 5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(C)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/或扫描仪扫描。照相处理和/或扫描仪扫描可以容易获得展开的薄层板上的斑点和色谱峰，对于进一步对结果进行评价是有益的。根据本发明第二方面的方法，其中还包括步骤(d)对薄层色谱图进行分析包括 5个共有峰/斑点的薄层色谱指纹图谱所对应的药材可初步判定为该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物正常，无5个共有峰/斑点则可判定为该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物异常。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物正常，否则可判定异常。基于此方法的结果可采用其它方法作进一步验证产品内在质量。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物正常，否则可判定异常。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，并且第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物正常，否则可判定异常。根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果某批次头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的在相同取样量、相同点样量的条件下，5个共有峰/斑点强度与同时展开的其它批次头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物相比更强，则表明该批次头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物质量比其它批次头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物更好。本发明任一方面的任一实施方案所具有的特征同样适用于该方面的其它任一实施方案以及其它方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外， 本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，提及％时，如未另外说明，是指重量/重量百分数。在本发明中，提及展开剂混合液时，它们的比率是以体积比表示的。使用本发明的方法，表明头花寥药材薄层色谱由5个共有峰构成了薄层色谱指纹图谱的基本骨架，通过对照品实验，确定3、4号峰为芦丁，4号峰为槲皮苷；由于以上共有峰各批药材均含有，因此上述共有峰应作为头花寥药材鉴定的特征性成分。同一产地不同批次和不同产地头花寥样品的药材质量的差异，可以从这几个峰的斑点颜色深度得到反映。 贵州施秉产12批头花寥药材样品中这几个斑点深度相似及峰面积大小相当，说明这12批样品相似性较大，品质差异小；不同产地样品相似性较大，但斑点深度略浅及峰面积差异较大，表明品质差异较大；头花寥的伪品赤惊散没有上述5个共有峰，表明本发明的色谱条件和方法可以将伪品区别。因此头花寥药材和热淋清颗粒的五个峰可以作为特征峰用于头花寥药材的真伪鉴别以及制剂质量控制。各样品在峰高上存在差异，反映了样品中某些化学成分上有量的差异；但峰形一致，体现了它们在质上没有大的差别。在本发明的一个实施方案中，头花寥药材薄层色谱指纹图谱测定条件确定为以水为提取溶剂，超声处理，乙酸乙酯萃取后为提取溶剂；以正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7 : 6. 5 : 2. 5 : 3)作为展开剂，二次展开，预平衡15min，上行展开；展距8cm;温度 20°C，控制相对湿度至32% 72%。用三氯化铝试液显色。挥尽溶剂后置紫外光灯(320nm) 下检视荧光薄层色谱。本发明的结果显示，贵州施秉产的12批头花寥药材的薄层色谱图和
9轮廓图十分相似，均有5个斑点和对应的5个峰；对于不同产地的药材而言，各峰在峰强度上有差异，体现了不同产地头花寥所含化学成分在量上有差别。此外，头花寥的伪品赤惊散没有上述特征，说明本发明方法可以很好的区分头花寥伪品，可以用于头花寥药材的真伪鉴别。本发明的薄层色谱指纹图谱法不仅能反映头花寥药材的特征性成分，也能反映不同来源药材之间的差异，还可以用于鉴别药材的真伪；同时该方法简单易于操作，便于推广应用。可用于采购及生产中的快速检验。


图I描绘的是头花寥药材不同提取溶剂、不同展开系统薄层色谱图(320nm)，S1至 S7的七个薄层色谱图中，从左至右显示的八个试样展开带分别为1 6.头花寥不同溶剂提取液(I.乙酸乙酯；2.乙醇；3.甲醇；4.丙酮；5.正丁醇；6.水提乙酸乙酯萃取)；7.芦丁 ；8.槲皮苷。展开剂运行方向上行(在开发明中，如未另外说明，展开剂运行方向均为上行)。图2描绘了点样时的相对湿度(RH，32%和88% )对头花寥药材和热淋清颗粒薄层层析行为的影响(320nm)，图中四条展开带中从左至右依次是1.头花寥样品；2。热淋清颗粒样品；3.芦丁 ；4.槲皮苷。图3描绘了展开温度对头花寥药材和热淋清颗粒薄层层析行为的影响(320nm)， 图中四条展开带从左至右所对应的检品分别为1.头花寥样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁 ;4.槲皮苷。图4描绘了预饱和时间对头花寥药材和热淋清颗粒薄层色谱行为的影响 (320nm)，图中四个色谱展开带从左至右依次代表的检品是1.头花寥样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁 ；4.槲皮苷。图5描绘了不同显色剂对头花寥药材和热淋清颗粒薄层色谱行为的影响 (320nm)，图中四个色谱带从左至右依次表示1.头花寥样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁 ;4.槲皮苷。图6描绘了标准品及头花寥药材和热淋清颗粒薄层色谱轮廓扫描图(320nm)，图中的薄层展开图是从左向右展开的。图7描绘了12批贵州施秉出产的头花寥药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图 (320nm)，薄层色谱图中14个色谱带从左至右依次是12.编号为I 12的12批施秉头花寥样品，13.芦丁；14.槲皮苷。 图8描绘了 12批不同产地头花寥药材薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b) (320nm)，薄层色谱图中14个色谱带从左至右依次是1.贵州施秉头花寥样品；2.贵州兴义；3.贵州晴隆；4.贵州盘县；5.贵州毕节；6.贵州水城；7.贵州罗甸；8.湖南古丈；9.云南师宗；10.广西田林；11.重庆南川；12.四川南川；13.芦丁 ；14.槲皮苷。图9描绘了施秉头花寥药材及头花寥伪品薄层色谱图及轮廓扫描图(320nm)，薄层色谱图中四个色谱带从左至右依次表示的检品为1.施秉头花寥样品；2.赤胫散；3.芦丁 ;4.槲皮苷。图10显示了 12批含糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。
图11显示了 12批无糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。图12显示了 12批热淋清片薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。
具体实施例方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。A、测试仪器与试药仪器LIN0MAT V半自动点样仪(瑞士卡玛公司)、CAMAGR印rostar3薄层色谱成像系统(瑞士卡玛公司)、CS-9301PC双波长飞点薄层色谱扫描仪(日本岛津公司)、AB204-S 型电子天平(梅特勒-托利多公司)、CH-250型超声波清洗机(天津恒奥科技公司，功率 250W，频率33kHz)、CZX-GFlO 1-4-S-II型电热恒温鼓风干燥箱(上海贺德实验设备有限公司)，双槽展开箱，Chromafinger色谱指纹图谱解决方案软件(珠海科曼中药研究有限公司)。试剂、试药甲醇、乙醇、氯仿、石油醚、环己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、正己烷、 丁酮等均为分析纯，可作为展开试剂可提取溶剂使用。芦丁(批号110725-200513， 含量测定用)、槲皮苷(批号111538-200403，含量测定用)、没食子酸对照品(批号 110831-200302，含量测定用)，均购于中国药品生物制品检定所。甲醇、四氢呋喃、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其它试剂均为分析纯。药材12批头花寥药材采自贵州施秉头花寥规范化种植研究与GAP试验示范基地(表I中编号I 12)，其他头花寥药材为各地野生(表I中编号13 23)。经贵阳中医学院鉴定为寥科植物头花寥Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. Don的干燥全草或地上部分；伪品赤胚散为寥科植物赤胚散Polygonum runcinatum Buch. -Ham. var. sinense Hemsl.的干燥全草或地上部分，样品来源详见表I。表I :药材样品的来源及编号
权利要求
1.头花寥药材指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥药材粉末，加水超声处理，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花寥供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；(b)薄层层析采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置 320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花寥药材的指纹图谱。
2.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)中，所述头花寥供试品溶液是用如下方法配制的取头花寥药材粉末，至容量瓶中，加水适量，超声处理，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
3.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理15 60min。
4.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)中，所述头花寥供试品溶液是用如下方法配制的取头花寥药材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、频率33kHz超声处理30min，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
5.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0. 5±0. 05mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL、0. 1±0. 02mg/mL的对照品溶液。
6.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2 IOiiL、点样液点样于距薄层板底边IOmm处、和或展开距离为7 15cm。
7.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)中，使用体积比为7: 6.5 : 2.5 : 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液进行二次展开。
8.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20°C，相对湿度至小于88%的条件下进行的。
9.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4 u L，用半自动点样仪点于距薄层板底边IOmm处；用体积比为 7 : 6.5 : 2.5 : 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20°C、相对湿度至小于88%的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡15min，上行展开，展距8cm;用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。
10.根据权利要求I的方法，其中步骤(c)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/ 或扫描仪扫描。
11.根据权利要求I的方法，其中还包括步骤(d)对薄层色谱图进行分析包括5个共有峰/斑点的薄层色谱指纹图谱所对应的药材可初步判定为头花寥药材正品，无5个共有峰/斑点则可判定为伪品。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。
14.根据权利要求I的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，并且第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花寥药材正品，否则可判定为伪品。
15.头花寥制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花寥提取的指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花寥供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；以及进行如权利要求I至14任一项所述的步骤(b)、步骤(c)、和任选的步骤(d)的处理。
16.根据权利要求15的方法，其包括以下步骤(a)薄层点样液制备称取头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花寥供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；(b)薄层层析采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7 6.5 2.5 3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置 320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花寥制剂或者制备该制剂的头花寥提取物的指纹图谱。进一步地如说明书第二方面任一实施方案所述方法的条件特征。
全文摘要
本发明涉及热淋清颗粒和头花蓼的薄层色谱指纹图谱的测定方法。该方法是照薄层色谱法测定，包括以下步骤(a)薄层点样液制备热淋清颗粒或者头花蓼药材用水超声处理，用乙酸乙酯萃取，得头花蓼供试品溶液；(b)薄层层析采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，即得。本发明方法为热淋清颗粒和头花蓼的质量监测和评价提供了一种有效的新途径。
文档编号G01N30/95GK102608248SQ20121004466
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者唐靖雯, 张丽艳, 李孟林, 梁斌, 潘雯婷, 王尚华, 罗君, 谢宇 申请人:贵州威门药业股份有限公司