专利名称：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测鸡高迁移率族蛋白b1的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及定量RT-PCR检测试剂盒，主要涉及一种实时荧光定量RT-PCR检测鸡高迁移率族蛋白BI试剂盒。
背景技术：
高迁移率族蛋白(HMG)最早由Johns于20世纪70年代在小牛胸腺中发现，是种几乎存在于所有真核细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其分子质量小(<30kD)，在聚丙烯酰胺凝胶电泳快速迁移而被命名为高迁移率族蛋白(HMG蛋白)。根据分子质量大小及DNA结合特性，HMG族蛋白分为HMGA，HMGB, HMGN家族；HMGB又分为HMGBl和HMGB2。HMGBl在进化过程中高度保守，在所有哺乳动物中有99%同源性。HMGBl分子包括3个功能区含与DNA结合的结构域A盒(Iaa 79aa)和B盒(89aa 163aa)，及I个高度重复并富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸的C-末端(186aa 215aa)。其中，B盒前20个氨基酸是其发挥 细胞因子活性的关键位点。A盒蛋白(A-box)能取代全长HMGBl而与相应受体结合，但不发挥生物学效应，故纯化的A-box可作为HMGBl特异性拮抗剂。HMGBl广泛分布于淋巴、心、肝、肺、脑、脾、肾等组织，在肝和脑组织中HMGBl主要存在于胞浆，而大多数其他组织中存在于细胞核内。在这些细胞核中，HMGBl和HMGB2结合于DNA双螺旋小沟内，引起DNA构象变化。这种结合无序列选择性，可以帮助特异性DNA结合蛋白正确装配到其在染色体内的结合位点。高迁移率族蛋白Bl(high mobility group box是一种典型的危险因子，正常情况下表达于胞核和胞浆内的非组蛋白染色体结合蛋白，参与多种生物学过程包括基因转录、DNA修复、V (D) J重组(胚系基因片段重组)、分化和发展。其功能主要为①使双螺旋极度扭曲以便各种转录因子和染色质相互作用；②调节类固醇激素受体、NF-K B、p53及RAGl重组酶的转录活性；③与组蛋白作用而影响染色质结构，使染色质解螺旋。HMGBl非特异性与DNA结合，可通过核孔而穿梭于胞核与胞浆之间。HMGBl仅在危险信号出现时释放至胞外发挥作用。胞外HMGBl不仅可直接充当炎性细胞因子参与固有免疫效应，也可作为内源性DAMP激活APC，从而启动、增强适应性免疫应答，并参与多种疾病过程发生和发展。HMGBl过表达有抑制细胞凋亡，诱导细胞分化、细胞迁移、细胞增殖等作用。因此，HMGBl可能作为干预多种免疫相关疾病的重要靶标。目前已发现的HMGBl的重要受体包括晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)、TolI样受体2 (toll like rec印tor2，TLR2)、TLR4。新近研究表明它也不但是一种转录因子和促生长因子，而且是一种重要的炎性细胞因子，并与肿瘤的发生、浸润、转移等生物学行为关系密切，有很重要的临床价值。本课题组前期的蛋白质组学结果也显示chHMGBl在J亚群禽白血病(ALV-J)感染的细胞中蛋白表达水平有差异，故推测chHMGBl在ALV-J感染致病过程中发挥一定的作用。目前对于chHMGBl的研究还处于起始阶段，各种检测chHMGBl表达的方法还很欠缺。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测蛋白基因表达已成为可能。Real-time PCR方法有着比ELISA等传统方法无法比拟的高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量。因此运用Real-time PCR技术对chHMGBl进行实时的定量检测，为深入研究chHMGBl具有
重要作用。

发明内容
本发明提供了一种实时荧光定量RT-PCR检测鸡高迁移率族蛋白BI试剂盒。可以精确定量检测标本中鸡高迁移率族蛋白BI (chicken high mobility group box
I,chHMGBl)的 mRNA 表达量。本发明试剂盒包含逆转录反应液(RT反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录 酶(M-MLV逆转录酶)、RNA酶抑制剂(Rnasin) ,PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、Subgreen突光染料、标准品、对照品。其中逆转录(RT)反应液含有焦碳酸二乙酷处理的水(DEPC-H2O)、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)缓冲液、寡举(dT)15_18 (Oligo (dT)15_18)、dNTPs。其中PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用引物。检测用引物分上游引物和下游引物上游引物序列为5'-CCAAATGCACCGAAGAGG-3' (SEQ ID NO. I)下游引物序列为5'-TCTGCTGCGGTGTTGTTC-3' (SEQ ID NO. 2)。标准品序列如SEQ ID NO. 3所示。对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无ChHMGBlmRNA的RNA样品，阳性对照为有chHMGBl mRNA的RNA样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本发明建立了利用Real-time PCR技术检测chHMGBl表达的方法，并经检测组织与细胞样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 Real-time PCR扩增技术，使得chHMGBl表达的检测敏感性大大提高，使得我们可以在极少的标本中获得足够的信息。本方法所设计的引物以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。在本检测项目中，我们采用了先进的实时荧光定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且检测基因的特异性也得到了提高。本发明试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为3. 562 X IO10Copy/μ L0
逆转录总体积20 μ L,分为三步反应
(I) RNA (定量 1μ8)X
10 X Reaction buffer with Mgcl2I μ匕
Dnase IΙμ-L
Rnase free water8pL-X 反应体系为10 μ L, 37°C 30min⑵在⑴反应液中加入I μ L50mM EDTA，65°C IOmin(3) 5XRT PCR Mix4μ LRnase free water5 μ L(2)反应液IlyL反应体系为20 μ L, 37°C 30min, 85°C 5S。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积20 μ L，其中I. IyL检测样品(逆转录产物、标准品、阳性或阴性对照)，SYBR Premix Ex Taq II 10 μ L, ROX ReferenceDye II O. 4 μ L，PCR 反应液 8.5 μ L。反应条件是95°C预变性 30s，然后 95°C °C 5s，60°C 34s，40个循环，每组设3个重复孔。扩增曲线图CT值等方面对结果进行分析并生成标准曲线。本发明的试剂盒通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中鸡高迁移率族蛋白BI (chicken high mobility groupbox l，chHMGBl)的mRNA表达量的试剂盒。该试剂盒可以用于鸡体内各组织脏器中HMGBl的表达分析，也可以用于检测不同状态下细胞中鸡HMGBl表达水平的变化。该发明为研究鸡HMGBl表达水平提供了一种快速、准确、可重复的检测方法。


图I为实时荧光定量RT-PCR标准品检测。图2为实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施例方式本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例I荧光定量RT-PCR法检测chHMGBl的表达一、材料DNase I购自Fermentas公司。反转录试剂盒等购自大连TaKaRa公司。T载体连接酶购自Promega公司。dNTP购自上海生工生物工程有限公司。总RNA提取试剂盒为杭州Axygen产品。SYBRtilPremix Ex Taq II为TaKaRa公司产品。其它为国产分析纯试剂。二、引物及探针设计与合成
以chHMGBl全长cDNA序列(GenBank登录号Y17968)为模板，使用PrimerExpress (V3. 0，美国ABI公司)软件分析和设计引物，并根据同时考虑chHMGBl基因组DNA序列情况，从中选择最佳引物。检测用PCR 上游引物序列为5’-CCAAATGCACCGAAGAGG-3’ (SEQ ID N0.1)，下游引物序列为5’-TCTGCTGCGGTGTTGTTC-3’ (SEQ ID NO. 2)，均由上海生工公司合成。三、检测标准品制备按照Axygen公司总RNA小量制备试剂盒步骤提取DF-I细胞的总RNA,并逆转录为cDNA。以新鲜制备的cDNA为模板进行HMGBl基因的扩增，反应体系为50 μ L cDNA模板I μ L，上下游引物各 I μ L (IOnM), dNTP 4 μ L，IOXbuffer (含 MgCl2) 5 μ L, LA Taq DNA 聚合酶O. 5 μ L，ddw 37. 5 μ L。PCR反应的循环参数95°C 5min ；95°C 30s, 60°C (退火温度根据不同基因有所调整)30s，72°C 30s，30个循环；72°C延伸lOmin。反应结束后进行电泳，凝胶浓度1%上样量5 μ L。胶回收上样50 μ L电泳，按照胶回收试剂盒回收PCR产物_20°C保 存备用。将目的基因片段与pGEM-T Easy载体(购于美国Promega公司)按说明书要求以3:1的摩尔比在16°C水浴中连接过夜(连接体系10 μ L :5X ligation buffer2 μ L, pGEM-T载体3 μ L，目的片段3 μ L，T4连接酶I μ L，ddw I μ L)，连接产物5 μ L加入DH 5 α大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于LB-Amp平板(添加X-Gal和IPTG)，37°C过夜培养。挑取白色菌落进行培养，按常规方法提取质粒，用进行EcoR I单酶切鉴定(酶切体系 10 μ L :Buffer I μ L, EcoR I O. 5 μ L，质粒 3 μ L，ddw 5. 5 μ L)，筛选阳性质粒。酶切正确的质粒即可以作为荧光定量PCR的标准品使用。含重组质粒的阳性克隆进行扩增并冻存菌种。标准品质粒用紫外分光光度计测定DNA浓度。实施例2荧光定量RT-PCR法检测I日龄雏鸡组织脏器中chHMGBl的表达一、标本检测I日龄雏鸡组织脏器经液氮研磨后用Axgen总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取Iyg 1 ^，在2(^1总反应体积内Oiig0 (dT)15_18为引物对其进行逆转录后，用检测用上下游引物在ABI公司7500型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，条件为95°C 5分钟变性，95°C 30秒、62°C 30秒、72°C 30秒进行40个循环扩增，最后于72°C延伸10分钟后置4°C。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经软件处理根据标准曲线计算出检测标本的chHMGBl表达量。二、样品检测结果标准品检测结果见图I。检测的标准曲线见图2。I日龄雏鸡组织脏器组织标本检测结果如下
组织名称__copy/μ L__组织名称__copy / μ L
~ 心脏 —1.632 XIO6 肝脏1.923 XIO5
―脾脏_ 5·927Χ1( ~ 肺脏4.211XIO5
_ 肾脏 _ 1.232 XIO7 脑2.202 XIO7一
'肌胃 _ I. 564XIO7 腺胃1.800XIO7一
―胸腺—2. 460Χ10~ 法氏囊I. 081XIO7
■肌肉2. 332 X IO6 十二指肠 2. 490X IO7本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
权利要求
1.一种实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测的鸡高迁移率族蛋白BI的试剂盒，含有逆转录反应液、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶、RNA酶抑制剂、聚合酶链反应液、耐热DNA聚合酶、标准品、对照品，其特征是逆转录反应液含有焦碳酸二乙酷处理的水、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶缓冲液、寡聚(dT) 15-18、dNTPs，聚合酶链式反应液含有聚合酶链反应缓冲液、MgCl2, dNTPs、检测用上游引物、检测用下游引物，其中 检测用上游引物序列如SEQ ID NO. I所示； 检测用下游引物序列如SEQ ID NO. 2所示； 标准品序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.如权利要求I所述的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测鸡高迁移率族蛋白BI的试剂盒，其特征是对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照为无鸡高迁移率族蛋白BI mRNA的RNA样品，阳性对照品为有鸡高迁移率族蛋白BI mRNA的RNA样品。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及定量RT-PCR检测试剂盒，具体是一种实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测的鸡高迁移率族蛋白B1的试剂盒。该试剂盒含有逆转录反应液、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶、RNA酶抑制剂、聚合酶链反应液、耐热DNA聚合酶、标准品、对照品。本发明试剂盒通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中鸡高迁移率族蛋白B1的mRNA表达量。该试剂盒可以用于鸡体内各组织脏器中HMGB1的表达分析，也可以用于检测不同状态下细胞中鸡HMGB1表达水平的变化。该发明为研究鸡HMGB1表达水平提供了一种快速、准确、可重复的检测方法。
文档编号G01N21/64GK102808037SQ20121034135
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者钱琨, 秦爱建, 朱明月, 张娜, 金文杰, 邵红霞 申请人:扬州大学