专利名称：定量检测人绒毛膜促性腺激素胶体金冻干品及制备方法
技术领域：
本发明涉及临床免疫诊断胶体金及其制备方法，具体涉及一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品及其制备方法。
背景技术：
1971年，Faulk和Taylor(Immunochem，81081，1971)首先使用免疫胶体金作为标记物用于免疫电镜技术，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法得到了广泛的应用。用还原法可方便地从氯金酸制备各种不同粒径的胶体金颗粒，Frens介绍的方法最为常用(Nature(Phys.Sci.)24120，1973)，以柠檬酸三钠为还原剂得到的10～70nm胶体金是临床诊断试剂中最经常用的大小范围，粒径大小可由柠檬酸三钠的加入量准确决定。胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附能力，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素、病毒或细菌抗原等非共价结合，形成免疫胶体金缀合物，用于免疫检测。
免疫胶体金技术在中国卫生部高等医药院校规划教材“免疫学和免疫学检验”(陶义训主编，第二版，北京，人民卫生出版社，1997)中已列为一个章节，该章节具体介绍了免疫胶体金在医学检验中最常使用的二个方法1)免疫胶体金斑点渗滤试验2)免疫胶体金层析试验。
该章节强调了稳定剂对免疫胶体金的重要性，介绍了国内外常应用的各种稳定剂牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖(Dextran)、聚乙二醇20000(PEG)、明胶(gelatin)。目前普遍使用聚乙二醇20000(PEG)作为稳定剂。
目前，美国Sigama公司供应2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物(Poly(ethylene glycol)，compoundwith 2，2’-[(1-methylethylidene)bis(4，1-phenyleneoxumethylene)]bisoxirane产品编号P2263，mp59℃，白色片状结晶，溶于水，分子量15000～20000)。
1990年上海医学检验杂志5(1)62～64发表的“免疫胶体金的制备和应用”较详细地介绍了胶体金的制备方法、免疫胶体金的制备、胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存以及免疫胶体金的应用。按吕绳凯等介绍的方法(中华微生物学和免疫学杂志，13(2)125，1993；上海医学检验杂志，5(1)62，1990)制备免疫胶体金和反应盒。包被胶体金的是纯化抗β-HCG单抗，包被膜的是纯化抗α-HCG单抗，单抗纯化使用正辛酸沉淀(J.Immunol.Methods 96(2)271，1987)。反应盒是本公司的胶体金定量检测板(专利号ZL 033435278)。
免疫胶体金定性检测因其快速、简便，在医院检验科已广泛应用，用于妊娠早期诊断的人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金法诊断试剂制造及检定规程已由中国生物制品规程公布(中国生物制品标准化委员会编，2000版，北京，化学工业出版社)，但尚未能达到定量的水平。免疫胶体金技术常用于定性检测微生物感染，例如A族链球菌(J.Immunoassay，13441，1992)、梅毒(J.Clinical Microbiology，34(8)2011，1996)、弓形虫(Clin Chem，42(sb)S207，1996 June)、霍乱弧菌O1和O139(Clin.Diagn.Lab.Immunol，10476，2003)、检测血清抗体(Clin Chem，491752，2003)、检测血清C-反应蛋白CRP(Clin Chem，492103，2003)等。近年国际上已有商品化免疫胶体金定量检测试剂供应，较有代表性的是挪威Axis-Shield公司生产的NycoCard C反应蛋白定量、尿微量白蛋白定量、D-二聚体定量试剂盒，他们使用超微颗粒胶体金和硼酸盐缓冲液使液相免疫胶体金有较好的稳定性(NycoCardl114365.Ed.581 July 2001)，但尚未见有HCG胶体金冻干品。
免疫胶体金技术快速又简便，所以广受欢迎，但要测定结果非常准确，则免疫胶体金必须有优秀的稳定性，这在免疫胶体金定量检测中尤为重要，是发展金标法快速定量检测试剂的前提。
众所周知生物制品冻干形式可以延长其有效期，在产品运输过程中不必低温运输。但免疫胶体金的胶体性能使它在冻干中会发生破乳现象，严重的破乳会造成肉眼可见的颗粒凝聚。轻度的破乳引起的微量颗粒凝聚，在检测过程中因直径增大而通不过微孔纤维膜，滞留在膜上的红色凝聚颗粒就误报为假阳性的结果。

发明内容
本发明要解决的技术问题是克服液相免疫胶体金稳定性差的缺陷以及胶体金冻干品制备中的破乳现象，提供一种具有良好稳定性，能定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品。
本发明提供的一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品包括1.抗HCG抗体包被胶体金，包被浓度0.01～0.05mg/ml，
2.裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物，浓度分别为裂解物0.2mg～10.0mg/ml；不裂解物0.2mg～10.0mg/ml3.1～12％蔗糖。
一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法包括如下步骤1.制备抗HCG抗体包被胶体金常规制备空白的粒径20nm左右的胶体金，呈透明的红色或桔红色，PH5.4～5.6，在520nm、1厘米光径时光吸收值OD在0.9～1.2。然后以抗HCG抗体包被胶体金，抗体包被浓度0.01～0.05mg/ml，离心作结合/游离(B/F)分离；2.制备胶体金溶液(1)混合裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物。
浓度分别为裂解物0.2mg～10.0mg/ml；不裂解物0.2mg～10.0mg/ml。
上述裂解或不裂解物在上述浓度范围内可以用任意比例混合，优选比例是1∶1；以上双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物的裂解采用如下方法；称聚乙二醇衍生化合物(美国Sigama公司，产品编号P2263，mp59℃，白色片状结晶，溶于水，分子量15000～20000)50克，置三角烧瓶中在石棉网上以微火加热使其熔化，保持微沸4～5分钟，室温冷却到40～50℃时加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％裂解物；称上述聚乙二醇衍生化合物50克，加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％不裂解物。
(2)离心分离后的抗HCG胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂解物各2mg/ml、1～12％蔗糖、10-20mM磷酸盐缓冲液PH7.4悬浮；3.制备胶体金冻干品将胶体金溶液在-40℃预冻，转入冻干机作冷冻干燥，最高升温≤25℃。
B/F分离时如不加稳定剂，离心后全部胶体金消失，只剩下少许片状金属不溶物，加入不同的稳定剂保护，离心后的不同结果比较见表1。
表1 加入不同稳定剂后的抗β-HCG胶体金缀合物离心B/F分离结果

OD值越高说明片状金属不溶物越少，稳定剂的效果越显著。2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物或其裂解物或二者混合物为稳定剂时的OD值相对传统稳定剂聚乙二醇20000(PEG)较高，保护效果显著。
上述稳定剂也可用于其它免疫胶体金，例如葡萄球菌A蛋白(SPA)-胶体金缀合物，用于临床血清样品中有关病原体的IgG抗体检测。
制备免疫胶体金冻干品时除了含有本发明中的稳定剂(裂解或不裂解聚乙二醇衍生化合物)外，必须含有1～12％蔗糖，否则冻干品必会有轻度的破乳，引发一定数量的假阳性，蔗糖的加入量在此范围即可，与其它稳定剂无比例关系。不同糖类添加剂对冻干胶体金复溶质量的影响结果见表2。
表2 不同糖类添加剂对定量检测HCG的冻干胶体金复溶效果的影响 *可见加入蔗糖的冻干品冻干活性不跌，背景白，无假阳性。对SPA-胶体金缀合物也得出与表2相同结果。
磷酸盐缓冲液用于调节ph值。
表3 金标渗滤法定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)时各种剂型免疫胶体金37℃下稳定性测试

注以国家标准1000mIU HCG/ml为测试样品，使用4～8℃保存的同批号膜和除胶体金外的其他相同试剂测试结果的CV在20％以内为质量不变、稳定性合格。
所以使用本发明的稳定剂可提高产品的稳定性，使定量结果更可靠。
使用胶体金冻干品的HCG金标快速定量试剂盒(HCG-DOT)HCG金标快速定量试剂盒和临床常规应用的HCG定性斑点渗滤试验原理相同(陶义训主编，第二版，北京，人民卫生出版社，1997)。只是定量试剂盒应用上述稳定剂的冻干品，有良好的稳定性(见表3)，使定量结果有良好的重现性，测试范围25～15000mIU HCG/ml，CV≤20％。试验所用的塑料小盒反应孔大小应与颜色密度反射测定仪探头相匹配(胶体金法定量检测板中国外观设计专利(专利号ZL 033435278)，呈色斑点的色泽强度与血清或尿样品中的HCG浓度成正比，而颜色强度可用颜色密度反射测定仪读数定量显示。
本试剂盒经上海市中山医院评估HCG-DOT在低(486mIU/ml)、中(1002mIU/ml)、高(7505mIU/ml)三个浓度水平时的检测CV分别为11.6％、13.6％、9.6％，表明其重现性较好。HCG-DOT在200～15000mIU/ml的范围内检测线性较好，实际测定值(y)与预期值(x)的相关系数(γ)＝1.00，线性回归方程y＝0.96x-134.8。HCG-DOT检测完整的HCG，与三种著名的国外仪器-试剂(HCG)检测系统的总β-HCG或完整HCG+β亚基测定结果有良好相关，相关系数r在0.94～0.97之间。这三个国外仪器-试剂(HCG)检测系统是著名的Abbott公司的Axsym、Roche公司的Elecsys、Ortho公司的Eci。而国外这三个仪器-试剂检测系统本身间的相关系数r也只在0.95～0.98之间，二者水平非常接近(见图1)。它们在HCG的检测方面有着数值相近的结果，适合于早早孕与妊娠疾病以及肿瘤的临床诊断、疗效判断、预后估计等方面的临床应用。


图1是HCG-DOT与三种进口试剂盒测定结果的相关(mIU/ml)。
具体实施例方式
实施例1按常规制备空白的粒径20nm左右的胶体金，呈透明的红色或桔红色，PH5.4，在520nm、1厘米光径时光吸收值OD在0.9～1.2。以抗β-HCG单抗包被胶体金，单抗包被浓度0.05mg/ml，离心作结合/游离(B/F)分离。称聚乙二醇衍生化合物50克，置三角烧瓶中在石棉网上以微火加热使其熔化，保持微沸5分钟，待液体略呈微黄、粘稠度明显减低时停止加热，室温冷却到40℃时加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％裂解物。称上述聚乙二醇衍生化合物50克，加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％不裂解物。
1∶1混合裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物，浓度分别为裂解物0.2mg；不裂解物0.2mg。离心分离后的抗β-HCG胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂解物各2mg/ml、1％蔗糖、10mM磷酸盐缓冲液PH7.4悬浮。将胶体金溶液在-40℃预冻，转入冻干机作冷冻干燥，制备成胶体金冻干品。
实施例2制备空白的粒径20nm左右，呈透明红色的胶体金。以抗α-HCG单抗包被胶体金，单抗包被浓度0.01mg/ml，离心(B/F)分离，1∶1混合裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物，浓度分别为裂解物10mg；不裂解物10mg，离心分离后的抗α-HCG胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂解物各10mg/ml、12％蔗糖、20mM磷酸盐缓冲液PH7.4悬浮。将胶体金溶液在-40℃预冻，转入冻干机作冷冻干燥，制备成胶体金冻干品。
权利要求
1.一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品，其特征是包括(1)抗HCG抗体包被胶体金；(2)裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物；(3)1～12％蔗糖。
2.如权利要求1所述的定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品，其特征是抗HCG抗体包被浓度0.01～0.05mg/ml。
3.如权利要求1所述的定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品，其特征是裂解物浓度0.2mg～10.0mg/ml；不裂解物0.2mg～10.0mg/ml。
4.一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法其特征是包括如下步骤(1)制备抗HCG抗体包被胶体金常规制备空白的粒径20nm左右的胶体金，以抗HCG抗体包被胶体金，离心作B/F分离；(2)制备胶体金溶液任意比例混合浓度为0.2mg～10.0mg/ml裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物。离心B/F分离后的抗HCG胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂解物各2mg/ml、1～12％蔗糖、10-20mM磷酸盐缓冲液PH7.4悬浮；(3)制备胶体金冻干品将胶体金溶液在-40℃预冻，冷冻干燥。
5.如权利要求4所述的一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法，其特征是裂解与不裂解双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物的混合比例是1∶1。
6.如权利要求4所述的一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法，其特征是制备胶体金冻干品，最高升温≤25℃。
7.如权利要求4所述的一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法，其特征是双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物的裂解采用如下方法；(1)聚乙二醇衍生化合物50克，加热熔化，微沸4～5分钟，室温冷却到40～50℃时加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％裂解物；(2)上述聚乙二醇衍生化合物50克，加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％不裂解物。
8.如权利要求4所述的一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金冻干品的制备方法，其特征是空白胶体金呈透明的红色或桔红色，PH5.4～5.6，OD值0.9～1.2。
全文摘要
本发明涉及一种定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品及制备方法。胶体金冻干品包括抗HCG抗体包被胶体金；裂解与不裂解的双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物；和蔗糖。其制备方法为先制备抗HCG抗体包被胶体金，混合裂解与不裂解的双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物。作B/F分离后胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂解物各2mg/ml、1～12％蔗糖、10－20mM磷酸盐缓冲液pH 7.4悬浮，将胶体金溶液冷冻干燥。本发明提供一种无破乳现象，具有良好稳定性，能定量检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的胶体金冻干品。
文档编号G01N33/543GK1570640SQ20041001805
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者徐建新 申请人:上海奥普生物医药有限公司