专利名称：一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法
技术领域：
本发明属农田害虫防控技术领域，具体涉及一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法。
背景技术：
蚜虫又称腻虫，是农作物的重要害虫之一，严重影响农作物产量和质量，不仅造成直接的经济损失，还会传播各种病毒病，是常发性害虫之一。蚜虫发育起点低，世代发育历期短，特别是气候变暖对蚜虫种群动态有显著影响，年平均温度升高2°C，会使繁殖周期非常短的蚜虫一年可增加4-5代。随着全球变暖，蚜虫可耐受温度提高，繁殖力和适应性显著增强，危害更加严重。随着科技的进步，豌豆蚜全基因组测序的完成为蚜虫分子生物学的研究奠定了基础。生物基因组计划的实施和推进，已使生命科学研究进入了后基因组时代，这
一转变的标志之一就是蛋白质组学的兴起。蛋白质双向电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一，尽管蛋白质组学研究的技术进展迅速，2-DE仍然是进行复杂蛋白质样品分离不可或缺的技术。蛋白质样品的制备是2-DE的关键，也是进行蛋白质组学分析的前提。由于昆虫组织中所含有的色素、醌类及其它多种代谢产物的严重干扰，使得双向电泳结果的分辨率低和重复性差，取得令人满意的2-DE图谱相对比较困难。昆虫蛋白制备方法较多，但主要集中于食用蛋白的制备，旨在获取昆虫可食性粗蛋白，而针对蚜虫蛋白样品制备的方法较少，特别是适于双向电泳分析的蚜虫蛋白制备方法。蚜虫蛋白质含量相对较低，成份复杂，富含脂类、核酸及多糖等干扰物质，这些物质给蛋白质定量和进一步的分析带来了困难。加之一些骨骼蛋白、肌动蛋白等不易溶解，使得蚜虫的蛋白提取非常困难，因此建立适用于电泳分析的蚜虫蛋白提取方法是十分必要的。迄今为止还没有制备蚜虫蛋白样品用于双向电泳的有效方法和技术，从而导致与蚜虫相关的蛋白质组研究相对其它昆虫而言比较滞后。

发明内容
本发明的目的是提供一种适用于双向电泳、具有较高质量的蚜虫蛋白样品制备方法。本发明一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法，包括下列步骤I.将蚜虫加入液氮一起研磨成粉末，将粉末放到微量离心管中，每IOmg粉末加入
I.5ml冷丙酮,混匀震荡后,离心收集沉淀；上述姆虫与加入液氮的重量比为I :100 ;2.将步骤I的沉淀转移到研钵中室温干燥20min，干燥后的沉淀按4 1的重量比加入石英砂，然后按重量比1:100加入液氮再一次研磨；把粉末转移到新的离心管中，再加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液后离心；饱和酚为Tris饱和酚，其pH为7. 9 ；SDS缓冲液配方为30%蔗糖、2% SDS、pH8. 0的0. IM Tris-HCl和5% P -巯基乙醇；3.离心后溶液分层，上层的酚层溶液取出后放到新的离心管中，吸取的酚相加入5倍体积由甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液，把混合液放到-20°C冰箱中2-4小时，离心后收集沉淀；4.将步骤3的沉淀先用由甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液洗涤2次，然后用80%的冷丙酮洗涤2次，真空离心干燥lmin，得到蚜虫的蛋白粗提物；5.将蚜虫的蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30°C条件下水浴30min促进蛋白的溶解，然后在4°C条件下15000Xg离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品；蚜虫蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为200mg/100uL_400mg/IOOuL0
所述水化/裂解缓冲液为含有5mol/L尿素、2mol/L硫脲、2% CHAPS、20mM DTT、5mMTCEP、0. 002%溴酚蓝和2% IPG缓冲液的溶液。所述的姆虫为麦长管姆(Sitobion avenae)、大豆姆(Aphis glycines)、棉虫牙(Aphis gossypii)和桃虫牙(Myzus persicae)。本发明采用饱和酚抽提法提取蛋白，是使盐、核酸、色素、酚和多糖等可溶性物质进入水相，蛋白质进入酚相，避免了一些干扰物质对双向电泳的影响。本发明的方法水化/裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPG)胶条中的溶解性；二硫苏糖醇还原二硫键，从而使蛋白质达到完全溶解的状态；IPG缓冲液能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀，而TCEP能够促进蛋白的有效溶解。本发明的方法制备蚜虫蛋白样品快速、简单易行，可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于后续研究进行生物质谱分析鉴定蛋白，本发明可广泛应用于蚜虫蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。


图I为麦长管蚜蛋白样品双向电泳图谱图2为大豆蚜蛋白样品双向电泳图谱其中丽为蛋白质分子量标准，单位是kDa。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V/V)。实施例I、制备麦长管蚜蛋白双向电泳样品并进行双向电泳分析I.收集3日龄的麦长管蚜成虫，加入液氮后快速研磨成粉末；蚜虫与加入液氮的重量比为I :100 ；2.将步骤I得到的粉末放到微量离心管中，每IOmg粉末加入I. 5ml冷丙酮，混匀震荡30s,在4°C条件下10, OOOXg离心3min,获得沉淀；3.将步骤2得到的沉淀用冷丙酮洗涤一次，然后转移到研钵中室温干燥20min，干燥后的沉淀按4:1的重量比加入石英砂，然后按重量比I :100加入液氮再一次研磨，把粉末转移到新的离心管中；4.在步骤3得到的粉末中加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液，所述的SDS缓冲液为30%蔗糖、2% SDS、0. IM Tris-HCl (pH8. 0)和5% ￠-巯基乙醇，混匀震荡，4°C 15000 Xg离心5min ;离心后溶液分层，吸取上层的酚层溶液放到新的离心管中，吸取的酚相加入5倍体积甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液，把混合液放到-20°C冰箱中沉淀2小时；5.溶液在_20°C沉淀后，IOOOOXg离心5min，弃除上清液；6.将步骤5得到的沉淀先用甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液洗涤2次，4°C 15000Xg离心5min,弃除上清液；7.用80%的冷丙酮洗涤2次，4°C 15000 Xg离心5min，弃除上清液，获得的沉淀真空离心干燥lmin，获得的粉末即为蚜虫蛋白粗提物；8.将步骤7得到的蚜虫蛋白粗提物溶解于水化/裂解缓冲液后，离心取 上清得到蚜虫蛋白双向电泳样品液；所述水化/裂解缓冲液为含有5mol/L尿素、2mol/L硫脲、2%CHAPS (3- [3-CholamidopropyI) dimethylammonio] propanesulfonic acid)、20mM 二硫苏糖醇(DTT)、5mM TCEP (tris (2-carboxyethyl)phosph)、0. 002%溴酌 蓝和 2% IPG 缓冲液的溶液；9.加入蛋白粗提物的水化/裂解缓冲液的溶液放入水浴锅中，水浴温度为30°C，时间为30min，4°C条件下15000Xg离心去上清，即为用于双向电泳的麦长管蚜虫蛋白样品;10.通过上述过程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度,结果表明上述得到的双向电泳麦长管蚜虫蛋白样品中蛋白浓度为3-4ug/uL。按照如下方法进行双向电泳利用Ettan IPGphor IlIsoelectric FocusingSyStem(通用电气医疗集团，USA)在20°C进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件为500V电泳Ih,随后1000V电泳lh，4000V电泳lh，最后8000V达到总伏时数为40000Vh。然后将聚焦后的固定PH梯度胶条(IPG胶条)在IOmL平衡缓冲液I (50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8. 8 ;6mol/Lurea ;30*%甘油，0. 02g/mL SDS, 0. 01g/mL 二硫苏糖醇)中平衡 15min,然后在 IOml 平衡缓冲液 2(50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，pH8. 8 ；6mol/L urea ;30%甘油，0. 02g/mL SDS，0. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡15min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上，第二向电泳利用EttanDALTsix system(通用电气医疗集团，USA)在12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴酚蓝指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶采用硝酸银染色法，结果如图I所示，结果表明蚜虫蛋白样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。实施例2、分离制备大豆蚜蛋白样品并进行双向电泳分析I.收集3日龄的大豆蚜成虫，加入液氮后快速研磨成粉末；蚜虫与加入液氮的重量比为I :100 ；2.将步骤I得到的粉末放到微量离心管中，每IOmg粉末加入I. 5ml冷丙酮，混匀震荡30s,在4°C条件下10, OOOXg离心3min,获得沉淀；3.将步骤2得到的沉淀用冷丙酮洗涤一次，将沉淀转移到研钵中室温干燥20min，干燥后的沉淀按4 :1的重量比加入石英砂，然后按重量比I :100加入液氮再一次研磨，然后把粉末转移到新的离心管中；4.将步骤3得到的粉末中加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液，所述的SDS缓冲液为30%蔗糖、2% SDS、0. IM Tris-HCl (pH8. 0)和5% ￠-巯基乙醇，混匀震荡，4 0C 15000\8离心51^11 ;离心后溶液分层，上层的酚层溶液取出后放到新的离心管中，吸取的酚相加入5倍体积甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液，把混合液放到-20°C冰箱中沉淀2小时；5.溶液在_20°C沉淀后，IOOOOXg离心5min，弃掉上清液；6.将步骤5得到的沉淀先用甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液洗涤2次，4°C 15000Xg离心5min,弃除上清液；7.然后用80%的冷丙酮洗涤2次，4°C 15000 Xg离心5min，弃除上清液，获得的沉淀真空离心干燥lmin，获得的粉末即为蚜虫蛋白粗提物；8.将步骤7得到的蚜虫蛋白粗提物溶解于水化/裂解缓冲液后，离心取上清得到蚜虫蛋白双向电泳样品液；所述水化/裂解缓冲液为含有5mol/L尿素、2mol/L硫脲、2%CHAPS (3- [3-CholamidopropyI) dimethylammonio] propanesulfonic acid)、20mM 二硫苏糖醇(DTT)、5mM TCEP (tris (2-carboxyethyl)phosph)、0. 002%溴酌 蓝和 2% IPG 缓冲液的溶液；、9.加入蛋白粗提物的水化/裂解缓冲液的溶液放入水浴锅中，水浴温度为30°C，时间为30min，4°C条件下15000X g离心去上清，即为用于双向电泳麦长管蚜虫蛋白样品；10.通过上述过程提取的蛋白质,用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的双向电泳麦长管蚜虫蛋白样品中蛋白浓度为3-4ug/ul。按照如下方法进行双向电泳利用Ettan IPGphor IlIsoelectric FocusingSyStem(通用电气医疗集团，USA)在20°C进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件为500V电泳lh，随后1000V电泳lh，4000V电泳lh，最后8000V达到总伏时数为40000。然后将聚焦后的固定PH梯度胶条(IPG胶条)在IOmL平衡缓冲液I (50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8. 8 ;6mol/Lurea ;30*%甘油，0. 02g/mL SDS, 0. 01g/mL 二硫苏糖醇)中平衡 15min,然后在 IOml 平衡缓冲液 2(50mmol/LTris-Cl 缓冲液，pH8. 8 ；6mol/Lurea ;30%甘油，0. 02g/mL SDS，0. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡15min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上，第二向电泳利用Ettan DALTsix system(通用电气医疗集团，USA)在12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶25mA恒流电泳，溴酚蓝指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶采用硝酸银染色法，结果如图2所示，结果表明大豆蚜蛋白样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。
权利要求
1.一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤 1)将蚜虫加入液氮一起研磨成粉末，将粉末放到微量离心管中，每IOmg粉末加入I. 5ml冷丙酮,混匀震荡后,离心收集沉淀；所述姆虫与加入液氮的重量比为I :100 ; 2)将步骤I)的沉淀转移到研钵中室温干燥20min，干燥后的沉淀按4:1的重量比加入石英砂，然后按重量比I :100加入液氮再一次研磨；把粉末转移到新的离心管中，再加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液后离心；所述饱和酚为Tris饱和酚，其pH为7. 9 ;所述SDS缓冲液配方为30%蔗糖、2% SDS、pH8. 0的0. IM Tris-HCl和5% P -巯基乙醇； 3)离心后溶液分层，上层的酚层溶液取出后放到新的离心管中，吸取的酚相加入5倍体积由甲醇溶解的0. IM乙酸铵溶液，把混合液放到-20°C冰箱中2-4小时，离心后收集沉淀； 4)将步骤3)的沉淀先用由甲醇溶解的0.IM乙酸铵溶液洗涤2次，然后用80%的冷丙酮洗涤2次，真空离心干燥lmin，得到蚜虫的蛋白粗提物； 5)将蚜虫的蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30°C条件下水浴30min促进蛋白的溶解，然后在4°C条件下15000Xg离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品；所述蚜虫蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为200mg/100uL_400mg/IOOuL0
2.按权利要求I所述的适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法，其特征在于所述水化 / 裂解缓冲液为含有 5mol/L 尿素、2mol/L硫脲、2% CHAPS,20mM DTT,5mM TCEP.O. 002%溴酚蓝和2% IPG缓冲液的溶液。
3.按权利要求I所述的适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法，其特征在于所述的蚜虫为麦长管蚜、大豆蚜、棉蚜和桃蚜。
全文摘要
一种适用于双向电泳的蚜虫蛋白样品制备方法属农田害虫防控技术领域，包括将蚜虫加入液氮一起研磨成粉末，加1.5ml冷丙酮，混匀震荡，离心收集沉淀；干燥后的沉淀放入液氮和石英砂后再一次进行研磨，然后加入等体积的饱和酚溶液和SDS缓冲液；离心后吸取的酚相加入5倍体积的0.1M甲醇溶解的乙酸铵溶液，把混合液放到-20℃冰箱中沉淀2小时，沉淀先用甲醇溶解的0.1M乙酸铵溶液洗涤，然后用80％的冷丙酮洗涤，获得蚜虫蛋白粗提物；将蚜虫蛋白粗提物溶解于水化/裂解缓冲液后，离心取上清液，得到蚜虫蛋白双向电泳样品。本发明制备蚜虫蛋白样品简单快速，可获高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于生物质谱分析鉴定蛋白，广泛用于蚜虫蛋白质组学研究。
文档编号G01N1/28GK102721592SQ201210241428
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者孙宇, 席景会, 张桦, 杨巽, 潘怡欧, 王军, 王滔, 王玉 申请人:吉林大学