一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法-山东科威数控机床有限公司

专利名称：一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种测定方法，特别是涉及一种治疗原发性肝癌血瘀郁结证的鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法。
背景技术：
本发明金龙胶囊(国药准字Z10980041)是癌症治疗药物，以药用动物(鲜守宫、鲜蕲蛇、鲜金钱白花蛇)组方的复方制剂，在抗肿瘤方面疗效确切。金龙胶囊已颁布的药品标准(WS3-158(Z-036)_2001Z)对其产品质量的控制，包括性状、鉴别、检查和含量测定4项，从目前SFDA对中药质量控制标准的要求，以及金龙胶囊原料药鲜守宫、鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇的化学及药理研究现状来看，目前含量测定项目采用了可见分光光度法，Folin-酚试剂测定总蛋白，该法的特异性较差，此外对于动物药中普遍存在的氨基酸、游离单糖、多糖及内源性一些小分子生命基本物质均未进行质量控制研根据金龙胶囊质量控制标准现状，本发明以质量控制标准提高为出发点，对金龙胶囊中氨基酸进行测定，确定了金龙胶囊氨基酸检测的色谱条件，该色谱条件采用柱前衍生化法，方法学考察中精密度、稳定性及重现性良好。并且金龙胶囊中含有大量氨基酸，应用氨基酸测定可更好的控制药品质量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种鲜动物药药物组合物的含量测定方法。本发明的另一目的在于提供一种鲜动物药药物组合物原料药的含量测定方法。本发明是通过如下技术方案实现的本发明药物组合物的含量测定方法包括如下步骤1、标准品溶液的制备a、0. lmol/L盐酸溶液取36% -38%的浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L、 400μ L、800y L于0. 5-1. 5体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-1000pmol/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 2-0. 8重量份于30_70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 10_30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶
解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；
e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500 体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取本发明药物组合物0. 05-0. 15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5_15分钟，取上清液，过0. 3-0. 6 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取本发明药物组合物0.05-0. 15重量份，置于 10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5_15 分钟，取上清液，取0. 05-1. 5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸 2-6体积份，真空充氮N215-45秒，迅速密封，置于80-150°C恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，加入1. 2-3. 6体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至5_15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心5-15分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；3、色谱条件色谱柱4. 6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=25-65 25-65 5-15为流动相A，pH为7. 8的4(toimol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0-2. 5min流动相A为0%，流动相B为100% ；
2. 5-16min 流动相 A 为 30 %，流动相 B 为 70 % ；16-24min流动相A为57 %，流动相B为43 % ；24-24. 8min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；24. 8-29. 7min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；29. 7-30. 9min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；30. 9-34. 7min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；4、测定结果本发明药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1. 9% -2. 85%, 总游离氨基酸的含量为12. 52% -18. 78%，总氨基酸的含量为14.41% -21.62% ；本发明药物组合物的含量测定方法优选如下步骤1、标准品溶液的制备a、0. lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀
释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μ LjOyLUOOy L、 200 μ L、400 μ L、800 μ L于1体积份量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 20. 0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并
定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 5. 5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用lOmol/LNaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取本发明药物组合物0. 1重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m 微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取本发明药物组合物0. 1重量份，置于15体积份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取 1体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1 %苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空充氮N230秒，迅速密封，置于110°c恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2. 4体积份 10mol/L NaOH溶液，混勻，转移至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心10 分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；3、色谱条件色谱柱4.6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=45 45 10为流动相A，PH为7. 8的40mmol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下0-2. 5min流动相A浓度为0 %，流动相B浓度为100 % ；2. 5-16min流动相A浓度为30 %，流动相B浓度为70 % ；16-24min流动相A浓度为57 %，流动相B浓度为43 % ；24-24. 8min流动相A浓度为100 %，流动相B浓度为0 % ；24. 8-29. 7min流动相A浓度为100 %，流动相B浓度为0 % ；29. 7-30. 9min流动相A浓度为0 %，流动相B浓度为100 % ；30. 9-34. 7min流动相A浓度为0 %，流动相B浓度为100 % ；4、测定结果本发明药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9%，总游离氨基酸的含量为12. 52%，总氨基酸的含量为14.41% ；本发明药物组合物中14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸。本发明药物组合物中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 55% -0. 83%, 谷氨酸含量为1. 79 % -2. 79 %、丝氨酸含量为0. M % -0. 81 %、组氨酸含量为 0. 52 % -0. 78%、甘氨酸含量为1. 15% -1. 73 %、苏氨酸含量为0. 62% -0. 93%、丙氨酸含量为2. 01 % -3. 02 %、缬氨酸含量为0. 86 % -1. 29 %、蛋氨酸含量为0. 36 % -0. 54 %、苯丙氨酸含量为0.5% -0. 75%、异亮氨酸含量为0. 53% -0.80%、亮氨酸含量为 0. 96% -1. 44%、赖氨酸含量为1. 30% -1. 95%、脯氨酸含量为0. 82% -1. 23% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 80% -1. 20%、谷氨酸含量为2. 29% -3. 44%、丝氨酸含量为0. 72% -1. 08%、组氨酸含量为0. 73% -1. 10%、甘氨酸含量为1. 53% -2. 30%、苏氨酸含量为0. 73% -1. 10%、丙氨酸含量为2. 08% -3. 12%、缬氨酸含量为0. 94% -1.41%, 蛋氨酸含量为0. 42 % -0. 63%、苯丙氨酸含量为0. 72% -1.08%、异亮氨酸含量为 0. 72%-1. 08%、亮氨酸含量为含量为1. 15%-2. 27%、赖氨酸含量为0. 82%-1. 23%、脯氨酸含量为0. 76% -1. 14%。本发明药物组合物中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 55%、谷氨酸含量为1. 79%、丝氨酸含量为0. M%、组氨酸含量为0. 52%、甘氨酸含量为1. 15%、苏氨酸含量为0.62%、丙氨酸含量为2.01%、缬氨酸含量为0. 86 %、蛋氨酸含量为0. 36 %、苯丙氨酸含量为0. 5%、异亮氨酸含量为0. 53%、亮氨酸含量为0. 96%、赖氨酸含量为1. 30%、脯氨酸含量为0. 82% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 80%、谷氨酸含量为2.四％、丝氨酸含量为0. 72%、组氨酸含量为0. 73%、甘氨酸含量为1. 53%、苏氨酸含量为0. 73%、丙氨酸含量为2. 08%、缬氨酸含量为0. 94%、蛋氨酸含量为0. 42%、苯丙氨酸含量为0. 72%, 异亮氨酸含量为0. 72%、亮氨酸含量为1. 15含量为％、赖氨酸含量为0. 82%、脯氨酸含量为 0. 76% ；本发明药物组合物的原料药组成为鲜守宫700-2300重量份鲜金钱白花蛇400-1100重量份鲜蕲蛇400-1100重量份。本发明药物组合物的原料药组成优选为鲜守宫1500重量份、鲜金钱白花蛇750重量份、鲜蕲蛇750重量份；或鲜守宫800重量份、鲜金钱白花蛇1000重量份、鲜蕲蛇500重量份；或鲜守宫2000重量份、鲜金钱白花蛇500重量份、鲜蕲蛇100重量份。本发明药物组合物的制备方法为将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于-25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。本发明药物组合物的制备方法还可以为将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加3-5倍体积水勻浆后，置于-18 0C至-22 °C冷冻M小时，取出，置于15 0C -30 °C融化，滤过，滤液以 12000-16000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精20-60重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉66-198重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。本发明药物组合物的制备方法还可以优选为将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加4倍体积水勻浆后，置于_20°C冷冻M小时，取出，置于25°C融化，滤过，滤液以14000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精40重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉 132重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。本发明药物组合物原料药的含量测定方法包括如下步骤1、标准品溶液的制备
a、0. lmol/L盐酸溶液取36% -38%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标品准溶液17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L、 400μ L、800y L于0. 5-1. 5体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-1000pmol/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 2-0. 8重量份于30_70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶
解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 3-38重量份，加水溶解并定容于500-1500 体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各 0. 05-0. 15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0. 3-0. 6 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各 0. 05-0. 15重量份，置于10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取0. 05-1. 5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N215_45秒，迅速密封，置于80_150°C恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，分别加入1. 2-3. 6体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至5-15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心5-15分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；3、色谱条件色谱柱4. 6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸。以乙腈甲醇水=25-65 25-65 5-15为流动相A，pH为7. 8的4(toimol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0-2. 5min流动相A为0%，流动相B为100% ；
2. 5-16min 流动相 A 为 30 %，流动相 B 为 70 % ；16-24min流动相A为57 %，流动相B为43 % ；24-24. 8min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；24. 8-29. 7min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；29. 7-30. 9min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；30. 9-34. 7min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；4、测定结果本发明原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1. 77 % -2. 66 %，总游离氨基酸的含量为22. 50 % -33. 75 %，总氨基酸的含量为 24. 26% -36. 39% ；或鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0. 13% -0. 20%, 总游离氨基酸的含量为6. 02% -9. 03%，总氨基酸的含量为6. 15% -9. 23% ；或鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18. 03% -27. 05%，总游离氨基酸的含量为5. 09% -7. 64%，总氨基酸的含量为23. 12% -34. 68% ；本发明药物组合物的含量测定方法优选如下步骤1、标准品溶液的制备a、0. lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀
释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L、 400μ 、800μ 于1体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 20. 0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并
定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 5. 5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用10!1101/1妝0!1溶液调节？!1值至7.8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0. 1重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇品和鲜守宫各0. 1重量份，置于15体积份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10 分钟，取上清液，取1体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空充氮队30秒，迅速密封，置于110°C恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2. 4体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；3、色谱条件色谱柱4. 6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=45 45 10为流动相A，PH为7. 8的40mmol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下0-2. 5min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；2. 5-16min流动相A浓度为30%，流动相B浓度为70% ；
16-24min流动相A浓度为57%，流动相B浓度为43% ；24-24. 8min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ；24. 8-29. 7min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ；29. 7-30. 9min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；30.9-34. 7min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；4、测定结果本发明原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.77%，总游离氨基酸的含量为22. 50%，总氨基酸的含量为24. 26% ；或鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0. 13%，总游离氨基酸的含量为6. 02%，总氨基酸的含量为6. 15% ；或鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18. 03%，总游离氨基酸的含量为5. 09%，总氨基酸的含量为23. 12%。本发明原料药鲜守宫中的14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；或鲜金钱白花蛇中的12种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；或鲜蕲蛇中的15种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；本发明原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为 1. 33% -2. 00%、谷氨酸含量为3. 29% -4. 94%、丝氨酸含量为0. 95% -1. 43%、组氨酸含量为0. 72% -1. 08%、甘氨酸含量为1. 64% -2. 46%、苏氨酸含量为0. 98% -1. 47%、丙氨酸含量为2. 48% -3. 72%、缬氨酸含量为1. 36% -2. 04%、蛋氨酸含量为0. 68% -1. 02%, 苯丙氨酸含量为0. 93% -1.40%、异亮氨酸含量为1.00% -1.50%、亮氨酸含量为 1.67% -2. 51%、赖氨酸含量为4. 13% -6. 20%、脯氨酸含量为1.36% -2. 04% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1.92% -2. 88%、谷氨酸含量为4. 39% -6. 59%、丝氨酸含量为1. 19% -1.79%、组氨酸含量为0. 95% -1. 43 %、甘氨酸含量为2. 16% -3. 24%, 苏氨酸含量为1.22% -1.83%、丙氨酸含量为2. 62% -3. 93 %、缬氨酸含量为含量为 1. 60%-2. 40%、蛋氨酸含量为0. 71% -1. 07%、苯丙氨酸含量为1. 20%-1. 80%、异亮氨酸含量为1. 20% -1. 80%、亮氨酸含量为1. 89% -2. 84%、赖氨酸含量为2. 06% -3. 09%、脯氨酸含量为1. 17% -1.76% ；或鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 25% -0. 38%, 谷氨酸含量为0. 57 % -0. 86 %、丝氨酸含量为0. 15 % -0. 23 %、甘氨酸含量为 0. 68%-1.02%,苏氨酸含量为0. 39 % -0. 59 %、丙氨酸含量为1. 48 % -2. 22 %、缬氨酸含量为0. 62% -0. 93%、蛋氨酸含量为0. 24% -0. 36%、苯丙氨酸含量为0. 51% -0. 77%、异亮氨酸含量为0. 40% -0. 60%、亮氨酸含量为0. 60% -0. 90%、脯氨酸含量为0. 15%-0. 23%；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 39% -0. 59%、谷氨酸含量为0. 70% -1. 05%、丝氨酸含量为0. 30% -0. 45%、甘氨酸含量为0. 74% -1. 11%、苏氨酸含量为0. 39% -0. 59%, 丙氨酸含量为1. 20 % -1. 80 %、缬氨酸含量为0. 53 % -0. 80 %、蛋氨酸含量为
180. 28 % -0. 42 %、苯丙氨酸含量为0. 39 % -0. 59 %、异亮氨酸含量为0. 40 % -0. 60 %、亮氨酸含量为0. 59% -0. 89%、脯氨酸含量为0. 23% -0. 35% ；或鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0. 17% -0.沈％、丝氨酸含量为
0.12%-0. 18%、组氨酸含量为0. 18%-0. 27%、甘氨酸含量为0.51%-0. 77%、苏氨酸含量为0. 38% -0. 57%、丙氨酸含量为1. 13% -1. 70%、缬氨酸含量为0. 40% -0. 60、异亮氨酸含量为0. 22% -0. 33%、亮氨酸含量为0. 34% -0. 51%、赖氨酸含量为1. 64% -2. 72% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2. 28% -3. 42%、谷氨酸含量为3. 17% -4. 76%、丝氨酸含量为1. 18% -1. 77%、组氨酸含量为1. 09% -1. 64%、甘氨酸含量为1. 52% -2. 28%、苏氨酸含量为1. 39% -2. 39%、丙氨酸含量为2. 16% -3.对％、酪氨酸含量为0. 91% -1. 37、缬氨酸含量为1.60 % -2.40 %、蛋氨酸含量为0.51 % -0.77 %、苯丙氨酸含量为
1.11% -1. 67%、异亮氨酸含量为1. 22% -1. 83%、亮氨酸含量为2. 17% -3.沈％、赖氨酸含量为2. 11% -3. 17%、脯氨酸的含量为0. 74% -1. 11%。本发明原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1. 33%、谷氨酸含量为3.四％、丝氨酸含量为0. 95%、组氨酸含量为0. 72%、甘氨酸含量为1.64%、苏氨酸含量为0. 98%、丙氨酸含量为2. 48%、缬氨酸含量为1. 36%、蛋氨酸含量为0. 68%、苯丙氨酸含量为0. 93%、异亮氨酸含量为1. 00%、亮氨酸含量为1. 67%、赖氨酸含量为4. 13%、脯氨酸含量为1. 36% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1. 92%、谷氨酸含量为4. 39%, 丝氨酸含量为1. 19%、组氨酸含量为0. 95%、甘氨酸含量为2. 16%、苏氨酸含量为1. 22%, 丙氨酸含量为2. 62%、缬氨酸含量为含量为1. 60%、蛋氨酸含量为0. 71%、苯丙氨酸含量为1. 20%、异亮氨酸含量为1. 20%、亮氨酸含量为1. 89%、赖氨酸含量为2. 06%、脯氨酸含量为1. 17% ；或鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 25%、谷氨酸含量为0. 57%、丝氨酸含量为0. 15%、甘氨酸含量为0. 68%、苏氨酸含量为0. 39%、丙氨酸含量为1. 48 %、缬氨酸含量为0.62%、蛋氨酸含量为0. M %、苯丙氨酸含量为0. 51 %、异亮氨酸含量为0. 40%、亮氨酸含量为0. 60%、脯氨酸含量为0. 15% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 39%、谷氨酸含量为0. 70%、丝氨酸含量为0. 30%、甘氨酸含量为0. 74%、苏氨酸含量为0. 39%、丙氨酸含量为1. 20%、缬氨酸含量为0. 53%、蛋氨酸含量为0.观％、苯丙氨酸含量为0. 39%、异亮氨酸含量为0. 40%、亮氨酸含量为0. 59%、脯氨酸含量为0. 23%；或鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0. 17%、丝氨酸含量为0. 12%, 组氨酸含量为0. 18%、甘氨酸含量为0.51%、苏氨酸含量为0. 38%、丙氨酸含量为1. 13%, 缬氨酸含量为0. 40%、异亮氨酸含量为0. 22%、亮氨酸含量为0. 34%、赖氨酸含量为 1. 64%;总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2.观％、谷氨酸含量为3. 17%、丝氨酸含量为
1.18%、组氨酸含量为1. 09%、甘氨酸含量为1. 52%、苏氨酸含量为1. 39%、丙氨酸含量为
2.16%、酪氨酸含量为0. 91%、缬氨酸含量为1. 60%、蛋氨酸含量为0. 51%、苯丙氨酸含量为1. 11%、异亮氨酸含量为1. 22%、亮氨酸含量为2. 17%、赖氨酸含量为2. 11%、脯氨酸的含量为0. 74%。本发明药物组合物中原料药鲜守宫的制备方法为取鲜守宫3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。或鲜金钱白花蛇的制备方法为取鲜金钱白花蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。或鲜蕲蛇的制备方法为取鲜蕲蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以 8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。本发明所述的重量份与体积份的关系为g/ml或kg/1。本发明药物组合物的制备方法是先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离，操作相对简单，高分辨率、高灵敏度，并可在12 40min短时间内分离12 沈种氨基酸的一种可靠方法。

图1为17种氨基酸标准品HPLC图；图2为混合原料HPLC图；图3为守宫HPLC4为白花蛇HPLC5为蕲蛇HPLC图。其中1、天门冬氨酸，2、谷氨酸，3、丝氨酸，4、组氨酸，5、甘氨酸，6、苏氨酸，7、精氨酸，8、丙氨酸，9、酪氨酸，10、胱氨酸，11、缬氨酸，12、蛋氨酸，13、苯丙氨酸，14、异亮氨酸， 15、亮氨酸，16、赖氨酸，17、脯氨酸。下述实验例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。实验例本发明药物组合物金龙胶囊以及各原料药中氨基酸的定量分析1.实验材料与仪器设备1. 1实验材料17种氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸)混合标准品溶液、硼酸缓冲液、OPA及FMOC衍生化试剂均购于安捷伦公司；甲醇及乙腈由B&J公司提供，色谱纯；磷酸二氢钠、盐酸及氢氧化钠均为分析纯，购于北京化工厂；本发明药物组合物金龙胶囊(按照实施例1的方法制备)及其本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇(按照实施例3的方法制备)、鲜守宫(按照实施例4的方法制备)由北京建生药业有限公司提供。1.2仪器设备高效液相色谱仪为Agilent 1100 HPLC，配备紫外检测器、自动进样器、柱温箱及四元梯度洗脱泵。2.溶液配制2. 10. lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83mL于IOOmL量瓶中，加水稀释并定
容至刻度。2. 2系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液的制备取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μ L、50y L、100y L、200y L、400y L、800y L于ImL容量瓶中，以 0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000ρπκ)1/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液。2. 31%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚约0. 5g于50mL棕色量瓶中，加入浓盐酸 25mL,加水溶解并定容至刻度。2. 4IOmol/LNaOH溶液取NaOH约20. Og,置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用。2. 540mmol/L Na2HPO4 缓冲液(ρΗ7· 8)取 NaH2PO4 约 5. 5g，加水溶解并定容于 IL 量瓶中，用lOmol/LNaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得。3.供试品溶液的制备3. 1游离氨基酸供试品溶液的制备取本发明药物组合物(按照实施例1方法制备)和本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇粉末(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇样品粉末(按照实施例3的方法制备)、鲜守宫样品粉末(按照实施例4的方法制备)，分别取0. lg，依次置于50mL、25mL、25mL、50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30min，离心lOmin，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，分别得游离氨基酸供试品溶液。3. 2总氨基酸供试品溶液的制备取本发明药物组合物(按照实施例1方法制备) 和本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇粉末(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇粉末 (按照实施例3的方法制备)、鲜守宫粉末(按照实施例4的方法制备)，分别取0. Ig,分别置于15mL塑料离心管中，加水IOmL充分溶解后，超声提取30min，离心lOmin，取上清液，分别吸取上清液lmL，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸4mL，真空充N230s，迅速密封，置于110°C恒温干燥箱内水解22hr，取出，放冷至室温，分别加入2. 4mL10mol/L NaOH 溶液，混勻，转移至IOmL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心lOmin，取上清液，过 0. 45 μ m微孔滤膜，分别得总氨基酸供试品溶液。4.色谱条件色谱柱ZorbaxEclipse-AAA 柱(4. 6 X 150mm，3. 5 μ m)，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸。以(乙腈甲醇水=45 45 10) (A)和 40mmol/L Na2HPO4 (pH 7. 8) (B)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下
时间A(% )B(% )001002. 5010016307024574324. 81000
2权利要求
1.一种药物组合物的含量测定方法，其特征在该方法为包括如下步骤(1)标准品溶液的制备a、0.lmol/L盐酸溶液取36% -38%的浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液25μ L、50y L、100y L、200y L、400y L、800y L于 0. 5-1. 5体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L 系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、1%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 2-0. 8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH 溶液取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4 缓冲液取NaH2PO4 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH 溶液调节PH值至7. 8，混勻，即得；(2)供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0. 05-0. 15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0. 3-0. 6 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0. 05-0. 15重量份，置于10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取0. 05-1. 5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N215-45秒，迅速密封，置于80-150°C恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，加入1. 2-3. 6体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至5_15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心5-15分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱:4. 6X150mm,3. 5μπι Zorbax Eclipse-ΑΑΑ 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35 °C, 自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=25-65 25-65 5-15 为流动相 A，pH 为 7. 8 的 40mmol/L Nei2HPO4 为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0-2. 5min流动相A为0%，流动相B为100% ；·2.5-16min流动相A为30%，流动相B为70% ； 16-24min流动相A为57%，流动相B为43% ；、24-24. 8min流动相A为100%，流动相B为0% ； 24. 8-29. 7min流动相A为100%，流动相B为0% ；、29.7-30. 9min流动相A为0%，流动相B为100% ；、30.9-34. 7min流动相A为0%，流动相B为100% ； (4)测定结果所述药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1. 9% -2. 85%，总游离氨基酸的含量为12. 52% -18. 78%，总氨基酸的含量为14.41% -、21.62% ；所述药物组合物的原料药组成为鲜守宫700-2300重量份鲜金钱白花蛇400-1100重量份鲜蕲蛇400-1100重量份。
2.如权利要求1所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)标准品溶液的制备a、0.lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液25 μ L,50 μ LUOOy L,200 μ L,400 μ L,800 μ L于1体积份量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、1%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH 溶液取NaOH 20. 0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Nei2HPO4 缓冲液取NaH2PO4 5. 5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH溶液调节PH值至7. 8，混勻，即得；(2)供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0. 1重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取 30分钟，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物0. 1重量份，置于15体积份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含 1 %苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空冲氮队30秒，迅速密封，置于110°C恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2. 4体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱4. 6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35 °C, 自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=45 45 10为流动相A，PH为7. 8的40mmol/L Na2HPO4为流动相 B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下0-2. 5min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；.2.5-16min流动相A浓度为30%，流动相B浓度为70% ；16-24min流动相A浓度为57%，流动相B浓度为43% ；24-24. 8min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ；.24. 8-29. 7min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ；.29.7-30. 9min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；.30.9-34. 7min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；(4)测定结果上述药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9%，总游离氨基酸的含量为12. 52%，总氨基酸的含量为14.41%。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述药物组合物中14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸。
4.如权利要求3所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 55% -0. 83%、谷氨酸含量为1. 79% -2. 79%、丝氨酸含量为0. 54% -0.81%、组氨酸含量为0. 52% -0. 78%、甘氨酸含量为1. 15% -1. 73%、苏氨酸含量为0. 62 % -0. 93 %、丙氨酸含量为2. 01 % -3. 02 %、缬氨酸含量为0. 86 % -1. 29 %、蛋氨酸含量为0.36% -034%、苯丙氨酸含量为0.5% -0.75%、异亮氨酸含量为 0. 53% -0. 80%、亮氨酸含量为0. 96% -1. 44%、赖氨酸含量为1. 30% -1. 95%、脯氨酸含量为0. 82% -1. 23%;总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 80% -1. 20%、谷氨酸含量为 2. 29% -3. 44%、丝氨酸含量为0. 72%-1. 08%、组氨酸含量为0. 73%-1. 10%、甘氨酸含量为1. 53% -2. 30%、苏氨酸含量为0. 73% -1. 10%、丙氨酸含量为2. 08% -3. 12%、缬氨酸含量为0. 94% -1. 41%、蛋氨酸含量为0. 42% -0. 63%、苯丙氨酸含量为0. 72% -1. 08%, 异亮氨酸含量为0.72 % -1.08 %、亮氨酸含量为1. 15 % -2.27 %、赖氨酸含量为 0. 82% -1. 23%、脯氨酸含量为 0. 76% -1. 14%。
5.如权利要求4所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 55%、谷氨酸含量为1. 79%、丝氨酸含量为0. M%、组氨酸含量为0. 52%、甘氨酸含量为1. 15%、苏氨酸含量为0. 62%、丙氨酸含量为2. 01%、缬氨酸含量为0. 86%、蛋氨酸含量为0. 36%、苯丙氨酸含量为0. 5%、异亮氨酸含量为0. 53%、亮氨酸含量为0. 96%、赖氨酸含量为1. 30%、脯氨酸含量为0. 82% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.80%、谷氨酸含量为2.四％、丝氨酸含量为0. 72%、组氨酸含量为0. 73%、甘氨酸含量为1.53%、苏氨酸含量为0. 73%、丙氨酸含量为2. 08%、缬氨酸含量为0. 94%、蛋氨酸含量为0. 42%、苯丙氨酸含量为0. 72%、异亮氨酸含量为0. 72%、亮氨酸含量为1. 15 含量为％、赖氨酸含量为0. 82%、脯氨酸含量为0. 76%。
6.如权利要求1、2、4或5所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述药物组合物的原料药组成为鲜守宫1500重量份、鲜金钱白花蛇750重量份、鲜蕲蛇750重量份；或鲜守宫800重量份、鲜金钱白花蛇1000重量份、鲜蕲蛇500重量份；或鲜守宫2000重量份、鲜金钱白花蛇500重量份、鲜蕲蛇100重量份。
7.如权利要求3所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述药物组合物的原料药组成为鲜守宫1500重量份、鲜金钱白花蛇750重量份、鲜蕲蛇750重量份；或鲜守宫800重量份、鲜金钱白花蛇1000重量份、鲜蕲蛇500重量份；或鲜守宫2000重量份、鲜金钱白花蛇500重量份、鲜蕲蛇100重量份。
8.如权利要求1、2、4、5或7所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述该药物组合物由如下方法制成将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂；或将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加3-5倍体积水勻浆后，置于-18°C至_22°C冷冻M小时，取出，置于15°C _30°C融化，滤过，滤液以12000-16000 转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精20-60重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉66-198重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
9.如权利要求3所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述该药物组合物由如下方法制成将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂；将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加3-5倍体积水勻浆后，置于-18°C至_22°C冷冻M小时，取出，置于15°C _30°C融化，滤过，滤液以12000-16000 转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精20-60重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉66-198重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
10.如权利要求6所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述该药物组合物由如下方法制成将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂；或将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加3-5倍体积水勻浆后，置于-18°C至_22°C冷冻M小时，取出，置于15°C _30°C融化，滤过，滤液以12000-16000 转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精20-60重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉66-198重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
11.如权利要求8所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述该药物组合物由如下方法制成将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加4倍体积水勻浆后，置于-20°C冷冻M小时，取出，置于25°C融化，滤过，滤液以14000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精40重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉132重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
12.如权利要求9或10所述的药物组合物的含量测定方法，其特征在于所述该药物组合物的制备方法为将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加4倍体积水勻浆后，置于_20°C冷冻M小时，取出，置于25°C融化，滤过，滤液以14000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精40重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉132重量份，混勻，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
13.一种药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)标准品溶液的制备a、0.lmol/L盐酸溶液取36% -38%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标品准溶液17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L、400 μ L、800 μ L于 0. 5-1. 5体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L 系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、1%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 2-0. 8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH 溶液取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Nei2HPO4 缓冲液取NaH2PO4 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH 溶液调节PH值至7. 8，混勻，即得；(2)供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0. 05-0. 15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0. 3-0. 6 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取鲜白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0. 05-0. 15重量份，置于10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取 0. 05-1. 5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1 %苯酚的6mol/L盐酸2_6体积份，真空冲氮N215-45秒，迅速密封，置于80-150°C恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，分别加入1. 2-3. 6体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至5_15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心5-15分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱:4. 6X150mm,3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35 °C, 自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=25-65 25-65 5-15 为流动相 A，pH 为 7. 8 的 40mmol/L Nei2HPO4 为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0-2. 5min流动相A为0%，流动相B为100% ； 2. 5-16min流动相A为30%，流动相B为70% ； 16-24min流动相A为57%，流动相B为43% ； 24-24. 8min流动相A为100%，流动相B为0% ； 24. 8-29. 7min流动相A为100%，流动相B为0% ；·29.7-30. 9min流动相A为0%，流动相B为100% ；·30.9-34. 7min流动相A为0%，流动相B为100% ；(4)测定结果原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1. 77% -2. 66%，总游离氨基酸的含量为22. 50% -33. 75%，总氨基酸的含量为24. 26% -36. 39% ；鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0. 13% -0. 20%，总游离氨基酸的含量为6. 02% -9. 03%，总氨基酸的含量为6. 15% -9. 23% ；鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18. 03% -27. 05%，总游离氨基酸的含量为5. 09% -7. 64%，总氨基酸的含量为23. 12% -34. 68%。
14.如权利要求13所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)标准品溶液的制备a、0.lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液25“1^、5(^1^、10(^1^、20(^1^、40(^1^、80(^1^于1体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-lOOOpmol/ μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、1%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份，加水溶解并定容至
15.如权利要求13或14所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于所述原刻度；dU0mol/L NaOH 溶液取NaOH 20. 0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Nei2HPO4 缓冲液取NaH2PO4 5. 5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH溶液调节PH值至7. 8，混勻，即得；(2)供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0. 1重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇品和鲜守宫各0. 1重量份，置于15体积份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1 %苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空冲氮N230秒，迅速密封，置于 110°C恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2. 4体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱4. 6X150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为!35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=45 45 10为流动相A，PH为7. 8的40mmol/L Na2HPO4为流动相 B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下0-2. 5min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ； 2. 5-16min流动相A浓度为30%，流动相B浓度为70% ； 16-24min流动相A浓度为57%，流动相B浓度为43% ； 24-24. 8min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ； 24. 8-29. 7min流动相A浓度为100%，流动相B浓度为0% ；(29.7-30. 9min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；(30.9-34. 7min流动相A浓度为0%，流动相B浓度为100% ；(4)测定结果所述原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.77%，总游离氨基酸的含量为22. 50%，总氨基酸的含量为24. 26% ；所述鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0. 13%，总游离氨基酸的含量为6. 02%，总氨基酸的含量为6. 15% ；所述鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18. 03%，总游离氨基酸的含量为5. 09%，总氨基酸的含量为23. 12%。料药鲜守宫中的14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；所述原料药鲜金钱白花蛇中的12种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；所述原料药鲜蕲蛇中的15种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸。
16.如权利要求15所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于所述原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1.33% -2. 00%、谷氨酸含量为 3. 29 % -4. 94%、丝氨酸含量为0. 95% -1. 43 %、组氨酸含量为0. 72% -1. 08%、甘氨酸含量为1.64% -2. 46%、苏氨酸含量为0.98% -1. 47 %、丙氨酸含量为2. 48% -3. 72%, 缬氨酸含量为1.36% -2. 04%、蛋氨酸含量为0.68% -1.02%、苯丙氨酸含量为 0. 93% -1. 40%、异亮氨酸含量为1. 00% -1. 50%、亮氨酸含量为1. 67% -2. 51%、赖氨酸含量为4. 13% -6. 20%、脯氨酸含量为1. 36% -2. 04% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1. 92% -2. 88%、谷氨酸含量为4. 39% -6. 59%、丝氨酸含量为1. 19% -1. 79%、组氨酸含量为0. 95% -1. 43%、甘氨酸含量为2. 16% -3. 、苏氨酸含量为1. 22% -1. 83%, 丙氨酸含量为2. 62% -3. 93%、缬氨酸含量为含量为1.60% -2. 40%、蛋氨酸含量为 0. 71% -1. 07%、苯丙氨酸含量为1. 20% -1. 80%、异亮氨酸含量为1. 20% -1. 80%、亮氨酸含量为1. 89% -2. 84%、赖氨酸含量为2. 06% -3. 09%、脯氨酸含量为1. 17% -1. 76% ；所述原料药鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为 0. 25% -0. 38%、谷氨酸含量为0. 57% -0. 86%、丝氨酸含量为0. 15% -0. 23%、甘氨酸含量为0. 68% -1.02%、苏氨酸含量为0. 39% -0. 59%、丙氨酸含量为1.48% -2. 22%, 缬氨酸含量为0.62 % -0.93 %、蛋氨酸含量为0. M % -0.36 %、苯丙氨酸含量为 0.51% -0. 77%、异亮氨酸含量为0. 40% -0. 60%、亮氨酸含量为0. 60% -0. 90%、脯氨酸含量为0. 15% -0. 23% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 39% -0. 59%、谷氨酸含量为0. 70% -1. 05%、丝氨酸含量为0. 30% -0. 45%、甘氨酸含量为0. 74% -1. 11%、苏氨酸含量为0. 39% -0. 59%、丙氨酸含量为1. 20% -1. 80%、缬氨酸含量为0. 53% -0. 80%, 蛋氨酸含量为0. % -0.42%、苯丙氨酸含量为0.39% -0.59%、异亮氨酸含量为 0. 40% -0. 60%、亮氨酸含量为0. 59% -0. 89%、脯氨酸含量为0. 23% -0. 35% ；所述原料药鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0. 17% -0.沈％、丝氨酸含量为0. 12% -0. 18%、组氨酸含量为0. 18% -0. 27%、甘氨酸含量为0. 51% -0. 77%、苏氨酸含量为0. 38% -0. 57%、丙氨酸含量为1. 13% -1. 70%、缬氨酸含量为0. 40% -0. 60、异亮氨酸含量为0.22% -0.33 %、亮氨酸含量为0.34% -0.51 %、赖氨酸含量为 1.64% -2. 72% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2. 28 % -3. 42%、谷氨酸含量为 3. 17% -4. 76%、丝氨酸含量为1. 18% -1. 77%、组氨酸含量为1. 09% -1. 64%、甘氨酸含量为1. 52% -2.、苏氨酸含量为1. 39% -2. 39%、丙氨酸含量为2. 16% -3. 、酪氨酸含量为0.91% -1.37、缬氨酸含量为1.60% -2. 40%、蛋氨酸含量为0. 51% -0. 77%, 苯丙氨酸含量为1. 11% -1.67%、异亮氨酸含量为1.22% -1.83%、亮氨酸含量为 2. 17% -3.、赖氨酸含量为2. 11% -3. 17%、脯氨酸的含量为0. 74% -1. 11%。
17.如权利要求16所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于所述原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1. 33%、谷氨酸含量为3.四％、丝氨酸含量为0. 95%、组氨酸含量为0. 72%、甘氨酸含量为1. 64%、苏氨酸含量为0. 98%、丙氨酸含量为2. 48%、缬氨酸含量为1. 36%、蛋氨酸含量为0. 68%、苯丙氨酸含量为0. 93%、异亮氨酸含量为1. 00%、亮氨酸含量为1. 67%、赖氨酸含量为4. 13%、脯氨酸含量为1. 36%;总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1. 92%、谷氨酸含量为4. 39%、丝氨酸含量为1. 19%, 组氨酸含量为0. 95%、甘氨酸含量为2. 16%、苏氨酸含量为1. 22%、丙氨酸含量为2. 62%, 缬氨酸含量为含量为1. 60%、蛋氨酸含量为0. 71%、苯丙氨酸含量为1. 20%、异亮氨酸含量为1. 20%、亮氨酸含量为1. 89%、赖氨酸含量为2. 06%、脯氨酸含量为1. 17% ；所述原料药鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 25%、谷氨酸含量为0. 57%、丝氨酸含量为0. 15%、甘氨酸含量为0. 68%、苏氨酸含量为0. 39%、丙氨酸含量为1.48%、缬氨酸含量为0. 62%、蛋氨酸含量为0.对％、苯丙氨酸含量为0.51%、异亮氨酸含量为0. 40%、亮氨酸含量为0. 60%、脯氨酸含量为0. 15% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0. 39%、谷氨酸含量为0. 70%、丝氨酸含量为0. 30%、甘氨酸含量为0. 74%, 苏氨酸含量为0. 39%、丙氨酸含量为1. 20%、缬氨酸含量为0. 53%、蛋氨酸含量为0. 28%, 苯丙氨酸含量为0. 39%、异亮氨酸含量为0. 40%、亮氨酸含量为0. 59%、脯氨酸含量为 0. 23% ；所述原料药鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0. 17%、丝氨酸含量为0.12%、组氨酸含量为0. 18%、甘氨酸含量为0. 51%、苏氨酸含量为0. 38%、丙氨酸含量为1.13%、缬氨酸含量为0. 40%、异亮氨酸含量为0. 22%、亮氨酸含量为0. 34%、赖氨酸含量为1. 64% ；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2.观％、谷氨酸含量为3. 17%、丝氨酸含量为1. 18%、组氨酸含量为1. 09%、甘氨酸含量为1. 52%、苏氨酸含量为1. 39%、丙氨酸含量为2. 16%、酪氨酸含量为0. 91%、缬氨酸含量为1. 60%、蛋氨酸含量为0. 51%、苯丙氨酸含量为1. 11%、异亮氨酸含量为1. 22%、亮氨酸含量为2. 17%、赖氨酸含量为2. 11%、脯氨酸的含量为0. 74%。
18.如权利要求13、14、16或17所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于所述原料药由如下方法制成取鲜守宫3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M 小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末；取鲜金钱白花蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C 冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末；取鲜蕲蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M 小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。
19.如权利要求15所述的药物组合物原料药的含量测定方法，其特征在于所述原料药由如下方法制成取鲜守宫3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于-25°c冷冻M 小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末；取鲜金钱白花蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C 冷冻M小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β -环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末；取鲜蕲蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水勻浆后，置于_25°C冷冻M 小时，取出，置于37°C水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。
全文摘要
本发明公开一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法，该方法为取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，置于量瓶中，加水溶解，超声提取，离心，取上清液，过微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；称取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，加水充分溶解后，超声提取，离心，取上清液，置于安剖瓶中，加入盐酸，真空充氮，水解，取出，放冷至室温，加入NaOH溶液，混匀，转移至量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心，取上清液，过微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液。以色谱柱检测一级氨基酸和二级氨基酸。以乙腈甲醇水为流动相A，pH为7.8的Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱。本发明方法操作简单，分辨率高、灵敏度高，并可在短时间内分离鲜动物药药物组合物及其原料药中12～26种氨基酸，是一种可靠的氨基酸含量测定方法。
文档编号G01N30/02GK102338782SQ20111016397
公开日2012年2月1日申请日期2011年6月17日优先权日2011年6月17日
发明者李建生申请人:北京建生药业有限公司