专利名称：一种生物有效磷的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种生物有效磷的测定方法，具体地说是一种使用氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)测定水体沉积物和土壤中的生物有效磷的方法。
背景技术：
近年来，由于人类活动的加剧，大量磷会随城市污水、工业废水、农业径流、禽畜排泄物、降雨降尘等途径输入湖泊、河流和海洋等天然水环境中。水体中的磷形态众多，但是具有直接生物有效性的磷形态主要是正磷酸盐，也有一部分溶解态有机磷和颗粒态磷，在一定条件下会转化为溶解态正磷酸盐释放出来，因而具有潜在生物有效性，与水体富营养化发生密切相关，这些磷统称为水体生物有效磷。土壤、泥沙和沉积物中有些磷在一定的条件下能够进入上述水体中，并可为植物或藻类生长所利用，因而具有潜在的生物有效性。由于水体藻类水华或赤潮爆发对水环境生态和健康造成较大威胁，因此，对水体沉积物和土壤中生物有效磷的研究具有重要的科学意义。
水体沉积物和土壤中的生物有效磷(BAP)的最直接的定量方法就是藻类分析法，但是藻类培养周期较长。后来发展了很多的化学快速提取法来估算生物有效磷，但是化学试剂提取的一部分磷形态可能不具有生物有效性，而这一局限将很难克服。比较而言，离子交换树脂(膜)和氧化铁浸渍滤纸可提取磷通常被认为是具有潜在生物有效性的磷形态，可能为土壤植物及藻类等水生生物所利用。
阴离子交换树脂是较早用于估算土壤有效态无机磷的方法，典型的操作就是应用氯离子饱和的树脂与土壤等比例混合在10～100mL水或弱电解质中振荡16～24h，但是在这种方法中树脂颗粒与土壤颗粒的分离较为困难。自20世纪90年代以来，将树脂嵌入一种塑料膜中，发展了离子交换树脂膜，提取时间可以大大缩短，而没有降低预测土壤磷的有效性的准确性。阴离子交换树脂/膜测定土壤中生物有效磷的根本缺陷在于对不同阴离子的吸附/解吸具有非专一性；树脂不能维持低浓度磷和充当无限的汇(Skogley，E.O.，Georgitis，S.J.，Yang，E.J.and Schaff，B.E.，1990.Commun.Soil Sci.Plant Anal.211229-1243.)。
Sissingh在1983年最先发展了一种氧化铁浸渍滤纸的土壤磷测试方法(Pi测试)，可以估算土壤中的植物有效磷而不会活化其它磷形态(Sissingh，H.A.1983.Estimation of plant-available phosphates in tropical soils.A new analyticaltechnique.Nota 235.Inst.for Soil Fertility Res.，Haren，the Netherlands.)。氧化铁浸渍滤纸是将滤纸浸泡在三氯化铁溶液中，晾干后用氨水浸泡或熏蒸而制得的。这种方法比化学提取法估算土壤和径流中植物和藻类可利用磷量具有更强的理论依据(Sharpley，A.N.，1993.J.Environ.Qual.，22597-601)。这种理论依据的基本原理在于氧化铁浸渍滤纸(以下简称FeO滤纸)从溶液中吸附磷，充当磷的“汇”，这样非常贴切地模拟了植物和藻类的吸收，故而可以估算BAP，而化学提取法可能会活化一些不能为植物和藻类利用的磷形态。氧化铁浸渍滤纸法特点在于其对磷离子的固有的选择性优于除了OH-外的土壤中所有其它离子。这种方法很快拓展应用到土壤和环境评价的广泛领域。例如，将氧化铁浸渍滤纸法应用于农业径流中生物有效性磷的估算，发现径流泥沙中BAP含量与处于磷饥饿的藻类生长密切相关(Sharpley，A.N.，1993.J.Environ.Qual.，22678-680)。因此，氧化铁滤纸法是一种用于评估径流对刺激淡水富营养化的潜力的方法。
氧化铁浸渍滤纸广泛应用于土壤植物有效磷的估算和土壤/农业径流磷的环境评估，但是缺点就是氧化铁浸渍试纸表面的氧化铁颗粒不够牢靠，容易脱落，在溶液中不宜长时间浸泡，试纸本身容易粘附颗粒物，且不易洗涤，进入洗脱液中而产生测定误差。尽管采用小孔径滤纸制作FeO滤纸，或者利用尼龙网袋等将氧化铁滤纸保护起来，可以减少土壤颗粒的粘附，但是都不是根本的解决办法。后来，也有将水合氧化铁悬浊液装在渗析管中，可以评估长期的土壤磷解吸过程，但是制作和操作过程复杂繁琐，且时间久了悬浊液中的氧化铁容易晶质化，另外，渗析管材成本较高。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术测定生物有效磷的氧化铁方法使用氧化铁浸渍滤纸表面氧化铁颗粒易脱落和滤纸微孔截留的颗粒物不易清除而会引入误差、使用渗析管成本较高、操作复杂的缺陷，从而提供一种使用氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)萃取的、且操作简便、成本低廉的生物有效磷的测定方法。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的本发明提供一种生物有效磷的测定方法，包括如下步骤1)将待测的沉积物/土壤样品与水或0.01mol/L CaCl2溶液以1g样品25～50mL的比例混合，加入20～25cm2氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)，于25℃下恒温振荡16～24h，取出富集了生物有效磷的氧化铁/醋酸纤维素复合膜，用水冲洗表面土粒；2)将步骤1)中得到的已富集生物有效磷的氧化铁/醋酸纤维素复合膜置于溶剂中，溶剂的加入量与复合膜的比例为25～50mL溶剂20cm2复合膜；充分振荡，直至膜的颜色变得无色透明，即为将生物有效磷完全洗脱下来；用磷钼蓝分光光度法测定磷的含量，计算复合膜所富集的磷量，并求得沉积物/土壤样品中的生物有效磷含量。
所述步骤1)的氧化铁/醋酸纤维素复合膜厚为40～60μm。
所述步骤2)的溶剂包括0.1～0.25mol/L硫酸、0.2～0.5mol/L盐酸、0.2～0.5mol/L硝酸或它们的混合溶剂。
所述的氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)在本发明人的另一个申请专利(申请号200410000627.3)中公开，该复合膜为一红棕色、半透明的复合膜，其制备方法如下将三氯化铁和高氯酸镁溶解于二氧六环和丙酮中，再添加聚醋酸纤维素，按重量百分比，所述的聚醋酸纤维素18wt％、二氧六环10wt％、丙酮70wt％、高氯酸镁2wt％，每100g铸膜液添加4～6g三氯化铁，在带有磨口塞的三角瓶中混合，得到铸膜液；然后25～45℃下振荡直至铸膜液溶解完全，即可制得混合均匀的氧化铁/醋酸纤维素复合膜的铸膜液；在洁净室内，将膜液倒在刮板上刮出40～60μm厚的膜液层，蒸发60秒干燥；将所制备的膜液层连带刮板一同浸渍在1％氨水中，温度保持在15～25℃下，浸渍5～10分钟，以促使氧化铁微粒在膜中形成，此时得到氧化铁/醋酸纤维素复合膜。将制得的膜用流动的去离子水或蒸馏水冲洗掉残存的溶剂，并裁剪成所需规格的膜片。
本发明提供的生物有效磷(BAP)的测定方法可用于水体沉积物和土壤中的生物有效磷含量，所述的生物有效磷量为正磷酸盐含量，以及可水解或矿化为正磷酸盐的溶解态有机磷和颗粒态磷含量的总和，其原理在于所使用的复合膜材料是以醋酸纤维素高分子为结构框架材料，表层为纯醋酸纤维素相，内部均匀镶嵌着无定形氧化铁微粒，组成一个个微小的吸附库(可以称之为“汇”)，具有很强的磷吸附能力。溶解于水体中或从沉积物和土壤中解吸出来的磷可以通过膜表面分布的大量微孔进入膜内，通过吸附、配位反应、表面络合等作用被氧化铁表面吸持而富集结合在氧化铁微粒表面，从而达到模拟土壤植物或藻类等水生生物不断吸取磷养分的效果。然后采用稀硫酸或稀盐酸浸泡洗脱复合膜上所富集的磷，使之重新释放到水溶液中，取出膜后便可测定在稀酸中回收到的磷浓度。
与目前广泛应用的使用氧化铁浸渍滤纸测定生物有效磷的方法相比，本发明提供的生物有效磷含量的测定方法的优点在于(1)保留了氧化铁浸渍滤纸法的所有优点；(2)具有韧性较强的膜结构框架，能够将氧化铁颗粒牢牢固定在膜中而不易脱落；(3)复合膜材料表面为微孔致密层，孔径为1～10nm，允许含磷离子或分子进入膜内富集，同时又能防止膜内部的氧化铁微粒泄露，以及防止外界环境中颗粒物或胶体堵在孔中，如泥土颗粒或胶体不会嵌在孔中，清洗方便，粘附在膜表面的泥土颗粒容易冲洗下来；(4)能够抵抗较强的水力冲击，可以较长时间振荡或浸泡，有应用于现场观测和长期观测的潜力；(5)比起目前国际上常用于制作氧化铁浸渍滤纸的Whatman No.50等小孔径无灰硬质滤纸来说，具有成本低廉的优势。


图1为实施例1制得的氧化铁/醋酸纤维素复合膜A和B对磷的富集动力学曲线；其中“-■-”代表复合膜A，“-●-”代表复合膜B；图2为复合膜B对磷的等温吸附曲线；图3为FeO/CAM膜B的磷加标回收率检验；图4为沉积物/土壤中生物有效磷的膜富集动力学曲线；其中“-◆-”代表沉积物，“-△-”代表土壤；图5为不同水土比例对沉积物和土壤中BAP含量测定的影响；其中“-■-”代表沉积物，“-▲-”代表土壤；图6为不同水土比例水或稀盐溶液与沉积物体系对BAP含量测定的影响；其中“-▲-”代表沉积物/0.01M CaCl2，“-■-”代表沉积物/去离子水，“-△-”代表土壤/0.01M CaCl2，“-□-”代表土壤/去离子水；图7为不同膜面积对沉积物中BAP含量测定的影响。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1、制备氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)A和B向具有磨口塞的三角瓶中，加入5g二氧六环和35g丙酮，将2g(制膜A)或3g(制膜B)三氯化铁(FeCl3·6H2O)和1g高氯酸镁依次溶解于混合液中，再加入9g聚醋酸纤维素，25℃恒温振荡直至膜液溶解完全，即可制得混合均匀的氧化铁/醋酸纤维素复合膜的铸膜液；在洁净室内，将膜液倒在刮板上刮出一定厚度(以40～60μm为宜)的膜液层，自然蒸发60秒干燥；将所制备的膜液层连带刮板一同浸渍在1％氨水中，温度保持在15～25℃之间，浸渍5～10分钟，以促使氧化铁微粒在膜中形成，取出后，将制得的膜用流动的去离子水冲洗掉残存的溶剂。得到FeO/CAM膜A和B，其基本特征如表1所示。
表1、氧化铁/醋酸纤维素复合膜A和B的基本特征

对该氧化铁/醋酸纤维素复合膜A和B进行富集动力学实验将50mL 5.0mg/L磷溶液分别加入至一系列具塞锥形瓶中，各加入一张单面面积为20cm2的FeO/CAM膜，于25℃以200r/min恒温振荡，在富集1，2，4，6，8，10，12，14，16，20，24h后，分别将膜取出，用去离子水清洗干净，将膜转至盛有25mL 0.1mol/L H2SO4的另一系列具塞锥形瓶中，25℃以200r/min恒温振荡洗脱1h，取出膜。用磷钼蓝分光光度法测定膜富集后溶液中残余磷的浓度和膜洗脱后溶液中磷的浓度，计算膜富集磷的含量，得到FeO/CAM膜A和B对水体磷的富集动力学曲线(如图1)。可以看出，在最初的8h内，铁含量较高的膜B对水体磷的富集速率高于膜A，且膜B的吸附密度高于膜A，但两者在16～24h时吸附都能够接近平衡。
实施例2、富集磷的FeO/CAM膜的洗脱溶剂类型、浓度及体积的选择将富集20μg磷的20cm2复合膜片分别采用0.10mol/L H2SO425mL、40mL、50mL；0.20mol/L H2SO4、 25mL、0.25mol/L H2SO425mL进行洗脱实验(三个平行)，结果如表2所示。结果表明，在0.1～0.25mol/L硫酸25～50mL洗脱作用下，均能得到较好的回收率(97％～103％)。采用稀硫酸将膜中富集的磷洗脱下来，主要是利用H+对氧化铁微粒的破坏作用，因此稀盐酸和稀硝酸均可应用，但要保持膜结构不被破坏以及一些非生物有效磷不会水解，酸浓度不宜过高。因此，0.1～0.25mol/L硫酸、0.2～0.5mol/L盐酸、0.2～0.5mol/L硝酸或它们的混合溶剂25～50mL与20cm2复合膜充分作用即可实现本发明的方法。
表2、洗脱液酸度及体积对洗脱效果的影响

实施例3、FeO/CAM膜B的最大吸附磷量的测定将50mL含磷1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0mg/L的溶液分别加入至一系列具塞锥形瓶中，各加入一张FeO/CAM膜B，25℃以200r/min恒温振荡，在富集20h后，分别将膜取出，用去离子水清洗干净，将膜转移至盛有25mL 0.1mol/L H2SO4的另一系列具塞锥形瓶中，25℃以200r/min恒温振荡，洗脱1h。用磷钼蓝分光光度法测定膜富集后溶液中残余磷的浓度和膜洗脱后溶液中磷的浓度，并计算膜富集磷的含量，并利用Longmuir等温吸附方程Q＝Qmax/(1/(k*C)+1)拟合，其中R2＝0.98，Qmax＝12.4，k＝0.838，如图2所示，每张面积为20cm2膜的最多可吸附约240μg磷，即最大吸附量(Qmax)为12.4μg P/cm2。
而在同样条件下，国际上常用的两种氧化铁滤纸直径5.5cm的氧化铁滤纸圈的最大吸附量(Qmax)为10.4μg P/cm2；2cm×10cm氧化铁滤纸条的最大吸附量(Qmax)为14μg P/cm2。可见本发明的FeO/CAM膜B的吸附磷量与其相当，所以FeO/CAM膜同样有应用于沉积物和土壤中BAP测定的前景。
实施例4、使用本发明的FeO/CAM膜B进行加标回收检验往一系列锥形瓶中加入50mL已知浓度的KH2PO4标准溶液，并各放入一张20cm2FeO/CAM膜B，25℃以200r/min恒温振荡富集24h后，分别将膜取出，余下步骤同实施例3。如图3所示，回收的BAP含量与加入的BAP含量呈显著线性相关，y＝0.9765x+0.5288，其斜率R2为0.999，接近1，比Sharpley(1993)报道的氧化铁浸渍滤纸的斜率(0.91)要高一些，表明FeO/CAM膜方法比氧化铁浸渍滤纸法有更好的BAP回收效果。
实施例5、使用本发明的FeO/CAM膜B对沉积物和土壤中BAP进行富集动力学实验称取1.00g沉积物或土壤样品(已冻干、研磨和过筛，以下同)于100mL锥形瓶中，将1块4cm×5cm的FeO/CAM膜片放入锥形瓶中，加50mL去离子水，加塞后在振荡器上于25℃以200r/min恒温振荡。振荡0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24h后，将膜取出，用水洗净粘附在膜上的颗粒，再转入另一锥形瓶中，加40mL 0.1mol/L H2SO4振荡1h，以洗脱出吸附的磷，用磷钼蓝分光光度法测定磷的含量，计算膜富集的磷量，并求得沉积物/土壤样品中的生物有效磷含量，得到沉积物/土壤样品中解吸的生物有效磷的膜富集动力学曲线，如图4所示，与文献中其它氧化铁浸渍滤纸方法的富集动力学曲线类似，在16～24h时吸附已经接近平衡。
实施例6、使用本发明的FeO/CAM膜B对不同水土比例对沉积物和土壤中BAP含量的测定称取双份0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00g沉积物或土壤样品于100mL锥形瓶中，将1块4cm×5cm的FeO/CAM膜片B放入锥形瓶中，加50mL去离子水或40mL 0.01mol/L CaCl2溶液，加塞后在振荡器上于25C以200r/min恒温振荡24h。振荡结束后，将膜取出，用水洗净粘附在膜上的颗粒，再转入另一锥形瓶中，加40mL0.1mol/L H2SO4振荡1h，以洗脱出吸附的磷，用抗坏血酸法测定磷的含量，求得沉积物/土壤样品中的BAP含量。如图5所示，随着土/水比值增大，BAP含量呈乘幂函数减小，至20g/L左右逐渐趋于平缓，20～40g/L(1g:50～25mL)之间测得的BAP值变化较小，而且水与稀盐溶液两体系得到的BAP差值也较小(图6)。因此，将1g待测的沉积物/土壤样品与25～50mL水或0.01mol/L CaCl2溶液混合即可实现本发明的方法。
实施例7、使用不同面积的本发明的FeO/CAM膜B对沉积物中BAP含量测定将两批2cm×5cm，3cm×5cm，4cm×5cm，5cm×5cm，6cm×5cm的FeO/CAM膜片(面积分别为10，15，20，25，30cm2)分别放入至10个100mL锥形瓶中，各加50mL去离子水，分别称取1.00g沉积物于锥形瓶中，加塞后在振荡器上25℃振荡(200r/min)20h。振荡结束后，将膜取出，用水洗净粘附在膜上的颗粒，再转入另一锥形瓶中，加40mL 0.1mol/L H2SO4振荡1h，以洗脱出吸附的磷，过滤后用抗坏血酸法测定磷的含量，计算膜富集的磷量，并求得沉积物中的BAP含量。如图7所示，随着膜面积的增大，BAP含量呈增加趋势，至20cm2～25cm2几乎没差别，且相对标准偏差也较小；30cm2复合膜所得BAP略低些，可能受锥形瓶容积限制，无法完全展开膜面进而影响富集效率的缘故。因而选择20cm2～25cm2的复合膜即可实现本发明的方法。
实施例8、太湖梅梁湾沉积物和北京污灌区土壤样品中BAP含量的测定称取三份1.00g沉积物或土壤样品(已冻干、研磨和过筛)于100mL锥形瓶中，将1块4cm×5cm的FeO/CAM膜片放入锥形瓶中，加50mL去离子水，加塞后在振荡器上25℃振荡(200r/min)24h。振荡结束后，将膜取出，用蒸馏水洗净粘附在膜上的颗粒，再转入另一锥形瓶中，加40mL 0.1mol/L H2SO4振荡1h，以脱洗出吸附的磷，过滤后用抗坏血酸法测定磷的含量，计算膜富集的磷量，并求得沉积物/土壤样品中的生物有效磷含量为太湖梅梁湾沉积物(#M16)BAP含量为15.25±0.94mg/kg；北京大兴污灌区土壤(#2-2)含量为14.65±0.03mg/kg。
实施例9、将1g待测的沉积物与25mL 0.01mol/L CaCl2溶液混合，加入25cm2氧化铁/醋酸纤维素复合膜A，于25℃下恒温振荡16h，取出此富集了生物有效磷的氧化铁/醋酸纤维素复合膜A，用水冲洗表面土粒；然后加入25mL 0.3mol/L盐酸和25mL 0.3mol/L硝酸的混合溶剂，充分振荡，直至膜的颜色变得无色透明，即为将生物有效磷完全洗脱下来；用磷钼蓝分光光度法测定磷的含量，计算复合膜所富集的磷量，并求得该沉积物中的生物有效磷含量为12.34±0.02mg/kg。
权利要求
1.一种生物有效磷的测定方法，包括如下步骤1)将待测的沉积物/土壤样品与水或0.01mol/L CaCl2溶液以1g样品25～50mL的比例混合，加入20～25cm2氧化铁/醋酸纤维素复合膜，于25℃下恒温振荡16～24h，取出富集了生物有效磷的氧化铁/醋酸纤维素复合膜，用水冲洗表面土粒；2)将步骤1)中得到的已富集生物有效磷的氧化铁/醋酸纤维素复合膜置于溶剂中，溶剂的加入量与复合膜的比例为25～50mL溶剂20cm2复合膜；充分振荡，直至膜的颜色变得无色透明；用磷钼蓝分光光度法测定磷的含量，计算复合膜所富集的磷量，并求得沉积物/土壤样品中的生物有效磷含量。
2.如权利要求1所述的生物有效磷的测定方法，其特征在于，所述步骤1)的氧化铁/醋酸纤维素复合膜厚为40～60μm。
3.如权利要求1或2所述的生物有效磷的测定方法，其特征在于，所述的氧化铁/醋酸纤维素复合膜的制备方法如下将三氯化铁和高氯酸镁溶解于二氧六环和丙酮中，再添加聚醋酸纤维素，按重量百分比，所述的聚醋酸纤维素18wt％、二氧六环10wt％、丙酮70wt％、高氯酸镁2wt％，每100g铸膜液添加4～6g三氯化铁，在带有磨口塞的三角瓶中混合，得到铸膜液；然后25～45℃下振荡直至铸膜液溶解完全，即可制得混合均匀的氧化铁/醋酸纤维素复合膜的铸膜液；在洁净室内，将膜液倒在刮板上刮出40～60μm厚的膜液层，蒸发60秒干燥；将所制备的膜液层连带刮板一同浸渍在1％氨水中，温度保持在15～25℃下，浸渍5～10分钟，得到氧化铁/醋酸纤维素复合膜。
4.如权利要求1所述的生物有效磷的测定方法，其特征在于，所述步骤2)的溶剂包括0.1～0.25mol/L硫酸、0.2～0.5mol/L盐酸、0.2～0.5mol/L硝酸或它们的混合溶剂。
全文摘要
本发明涉及一种生物有效磷的测定方法。该方法使用氧化铁/醋酸纤维素复合膜(FeO/CAM)测定水体沉积物和土壤中的生物有效磷，包括如下步骤将待测的沉积物/土壤样品与水或0.01mol/L CaCl
文档编号G01N21/25GK1677086SQ20041003076
公开日2005年10月5日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者王子健, 黄清辉, 柯润辉, 许宜平, 马梅 申请人:中国科学院生态环境研究中心