专利名称：一种微流控芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物检测、环境监测、临床检测技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法。
背景技术：
现有技术中用于生物检测的方法很多，例如免疫印迹法和酶联免疫法(ELISA法)等免疫分析方法。但这些免疫分析方法需要比较长的分析时间，液体处理过程也比较麻烦，通量比较小(每次只能检测一个项目)，而且需要比较多的生物活性试剂，而微流控分析芯片则可以有效地克服这些缺点。微流控免疫分析方法是近些年新发展起来的一项技术，该方法以分析化学为主，结合生物化学、物理化学、免疫学等相关学科的成果，在微小结构中操控流体，被称为微型实验室。应用到免疫分析中，对临床疾病诊断具有重要实用价值。例如，在分析样本量非常少的样品时，微流控技术表现出极强的优势，通常需要样品量为几毫升的实验在采用微流控技术后，仅需要几微升的样品量，大大节省了样本和试剂的消耗量，具有广泛的应用前景和重要的应用价值。

发明内容
为了解决现有技术中生物检测过程中样本用量大，操作步骤复杂的缺陷，本发明提供一种能够同时对多种不同的样品进行检测的微流控芯片及其制备方法，本发明提供的微流控芯片能够同时检测多个样本中的多种不同的物质，本发明提供的检测方法操作简单，试剂用量少，节省时间，高效准确。为了解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案本发明提供一种微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由至少两条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔。所述通孔也称为进样孔，与大气相通的一端的开口位于微流控管道层的上表面；为了便于将待测样品加入到管道内，所述进样孔分散设置，相邻的进样孔之间有一定的间隔。上述的特定物质指待测样品。上述微流控管道层的每个管道与全部功能条带相垂直并在交叉点相连通。上述微流控芯片的基底层的材料应利于吸附固定所述能与特定物质起反应的材料。例如抗体或抗原，并且不会影响所吸附的抗体和抗原的特异性反应。所述微流控管道层和基底层的材料可选用聚二甲基硅氧烷，玻璃薄片、陶瓷、高分子材料等常用的固相载体。所述高分子材料选自聚苯乙烯、聚碳酸酯等。上述微流控芯片的基底层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜。
上述微流控芯片的基底层和微流控管道层的材料均为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。上述微流控芯片的基底层的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道层的材料为陶瓷。 上述微流控芯片的基底层和微流控管道层的材料可以相同，也可以不同。还可以对基底层材料进行活化处理，使其以共价键交联生物分子，从而提高包被效率和包被物的稳定性。微流控管道层的管道用封闭剂进行表面处理，降低管道的内表面对生物分子的吸附性，进而使得样本中的待检物质可以更少量的被管道吸附，从而提高检测灵敏度。上述基底层厚度为0. 5_2mm，微流控管道层的底部分布长方体管道，长方体管道宽0. 01_2mm,高0. 01-2mm,长10-50mm,管道之间间隔管道两端为进样孔,进样孔直径
l-2mm,垂直距离(或称高度)I-4mm ;上述管道的横截面也可以是半圆形，直径为0. 01-2mm,优选的，半圆形的直径为0. 5-0. 7mm。微流控管道层的长、宽、高与长方体管道的尽寸和进样孔的高度相适应，通常，微流控管道层的长15-60_、宽0. 1-20_、高1-4_。上述微流控管道层通过机械加工，精密机加工，模塑工艺，刻蚀，纳米压印和/或复模法制备。上述能与特定物质起反应的材料选自生物材料、人工合成的高分子材料、受体或药物分子的结合靶物质。所述生物材料包括抗体、抗原、DNA、RNA、肽链、蛋白质或其组合。进一步的，上述功能条带选自包被抗体条带、包被抗原条带、或其组合。上述基底层和微流控管道层紧密贴合在一起。上述基底层和微流控管道层利用离子氧化其相邻的表面，进而通过化学键紧密贴合在一起。还可以通过粘结剂，如环氧树脂将微流控管道层和基底层粘结在一起。上述功能条带选自促甲状腺激素(TSH)包被抗体条带、催乳素(PRL)包被抗体条带、促黄体生成激素(LH)包被抗体条带、生长激素(GH)包被抗体条带、卵泡刺激素(FSH)包被抗体条带、皮质醇(Cor)包被抗体条带或其组合；TSH包被抗体浓度为10-100 ii g/ml ；PRL包被抗体浓度为IO-IOOii g/ml ;LH包被抗体浓度为10-100 y g/ml ;GH包被抗体浓度为10-100 u g/ml ；FSH包被抗体浓度为10-100 u g/ml ；Cor包被抗体浓度为10-100 u g/ml。进一步的，上述TSH包被抗体浓度为50 ii g/ml ;PRL包被抗体浓度为40 y g/ml ；LH包被抗体浓度为25 V- g/ml ；GH包被抗体浓度为50 V- g/ml ；FSH包被抗体浓度为27 U g/ml ；Cor包被抗体浓度为72 ii g/ml。在本发明的另一个实施方式中，上述功能条带为肿瘤标志物AFP包被抗体条带；AFP包被抗体浓度为10-100 u g/ml。本发明还提供一种标记物混合液，包括标记物、稀释剂，所述标记物为标记的生物材料，该标记物能够与待测样品起反应并与待测样品结合在一起；所述待测样品能够与本发明提供的微流控芯片的功能条带中的材料起反应并结合在一起。所述生物材料选自抗体、抗原、肽、DNA、RNA、蛋白质或其组合。上述标记物为标记抗体,标记抗原，或其组合。进一步的，上述标记物混合液包括(I) TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体，所述标记抗体的浓度均为1_10 U g/ml ；(2) Cor的标记抗原，浓度为1-10 U g/ml ；(3)稳定剂。优选的，采用的稀释剂和稳定剂均为未稀释的新生牛血清。
本发明还提供上述的微流控芯片的制备方法，所述制备方法包括下述步骤(I)将能与特定物质起反应的材料包被或吸附在基底层上，形成功能条带；(2)将微流控管道层贴合在步骤(I)所得基底层的上表面；所述微流控管道层的管道与所述功能条带相垂直并在交叉点相连通；(3)用封闭剂封闭步骤⑵中的管道，之后洗涤管道；(4)干燥，即得所述微流控芯片。进一步的，上述的微流控芯片的制备方法包括下述步骤(I)、将微流控管道层覆盖于基底层上，向微流控管道层的管道内分别通入包被抗体或抗原，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带；(2)、移除步骤⑴中微流控管道层；(3)、取清洁的微流控管道层，对步骤(I)所得的基底层的带有功能条带的表面和微流控管道层的下表面进行离子氧化处理，使微流控管道层和基底层贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通；(4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，封闭60-200分钟后，在管道内通入PBS冲洗3-4次；(5)干燥，即得所述微流控芯片。本发明还提供上述的微流控芯片的使用方法，所述使用方法包括下述步骤(I)将待测样品与上述的相应标记物混合液相混合；(2)将步骤(I)所得的混合液通入微流控管道层的管道内，培育30分钟至2小时；(3)向各管道内通入PBS冲洗3-4次后，移除管道层，在反应区域内加入相应试剂；(4)根据试剂性质，检测反应区域的显色、发光或反射性；(5)根据步骤⑷的结果确定样品中的目标抗体。用于标记的物质可以是酶、同位素、有机荧光染料或荧光量子点。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和3 -半乳糖苷酶等。常用的封闭剂有0.05% -10%的BSA、10% -100%的新生牛血清、I %明胶、5%脱脂奶粉。本发明采用的封闭剂和稳定剂优选100%新生牛血清(指未稀释的新生牛血清)，由新出生10天内的小牛采血制成,蛋白含量为3. 5%-5% (w/v, g/100ml)。本发明可以采用现有制备包被抗体和标记抗原/抗体的方法。上述微流控芯片主要用于高效筛选，环境监测，生物分析，临床检测，食品安全检测，动物检测等用途。在某些药物分子的研发和筛选中，可以将一系列受体或药物分子的结合靶物质固定在上述微流控芯片上，然后同时将筛选的多种物质同时通过该微流控芯片，从而确定哪些分子能与哪种受体或靶物质相结合，从而实现高效筛选；同样原理也可以用于监测环境中存在哪些污染物质或确定引起污染的物质的特征；微流控芯片也可以用于生物分子的相互作用分析，从而揭示生物分子之间的相互关系；在临床检测及监测方面也有重要的应用，可用于肿瘤标志物、激素、病毒、抗生素、毒品等的联合检测。在食品安全检测方面，可以用于检测食品内是否含有禁用的物质，如三聚氰氨、瘦肉精；可以 测定食品中的农药残留、抗生素残留、毒素(如黄曲霉素)等。
与现有技术相比，本发明提供的微流控芯片能够同时对多种不同的样品进行检测，具有体积小、比表面积大、反应时间短、分析速度快、试剂和样品用量少、多样品多指标同时检测等优点，本发明提供的检测技术操作简单，高效准确。利用本发明提供的微流控芯片进行生物检测，准确率高，抗干扰性强，检测灵敏度和特异性灵敏度均较高，而且制备工艺简单，检测操作方便且易掌握，生产成本低，检测费用少，不仅适合专业检测机构使用，也适合例行体检、采/供血、疫情检测、医疗临床检测等方面的使用。


图I为本发明提供的微流控芯片的立体结构示意图，其中，微流控管道层由透明材料制成；图2为本发明提供的微流控芯片的检测方法示意图；图3为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层俯视图；图4为本发明提供的微流控芯片检测样品结果的发光成像图；图5为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的立体图；图6为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的结构示意图；图7为本发明提供的微流控芯片的基底层的结构示意图；图8为本发明提供的微流控芯片的微流控管道层的结构示意图；图9为图8所示微流控管道层的A-A剖面结构示意图；图10为本发明提供的微流控芯片检测AFP结果的发光成像图；图11为本发明提供的微流控芯片检测Cor结果的校准曲线图；图12为本发明提供的微流控芯片检测AFP结果的标准曲线图。
具体实施例方式如图I所示，本发明提供的微流控芯片包括基底层I和微流控管道层2，两层紧密贴合，基底层I的厚度为0. 5-2mm，微流控管道层2的底部分布七个平行的长方体管道4，管道两端为进样孔5，进样孔5与大气连通。如图2所示，本发明提供的微流控芯片(检测装置)的检测示意图，在微流控管道层依次通入TSH、PRL、LH、GH、FSH、Cor的包被抗体，使之固定在基底层I相应区域，弃去管道，在与包被抗体成直角的方向上，平行覆盖上两块微流控管道层2，在管道4内通入不同 的抗原抗体，进行检测。如图3所示，本发明提供的检测装置的微流控管道层2，底部分布五个平行的长方体管道4,长方体管道4宽0. 5mm,高0. 7mm,长40mm,管道4之间间隔2mm,管道两端为进样孔5，进样孔5直径为2_，相邻进样孔5的垂直距离(间隔)3mm,进样孔5与大气连通。本发明所用的材料和设备均为现有材料和设备，例如促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黄体生成激素(LH)、生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮质醇(Cor)的包被抗体,抗原，HRP标记抗体，HRP标记抗原均为北京润德康泰生物科技有限公司生产，具体内容如表I所示，表I原料名称，货号和生产厂家
权利要求
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片自下而上依次包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定于所述基底层的上表面，所述功能层由至少两条平行的功能条带组成，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层覆盖在所述功能条带上，所述微流控管道层的下表面设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔。
2.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控管道层的每个管道与全部功能条带相垂直并在交叉点相连通。
3.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控管道层的材料为陶瓷。
5.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述能与特定物质起反应的材料 选自生物材料、人工合成的高分子材料、受体或药物分子的结合靶物质。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述生物材料选自抗体、抗原、DNA、RNA、肽链、蛋白质或其组合。
7.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能条带为包被抗体条带、包被抗原条带、或其组合。
8.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层的上表面和功能层的上表面，与所述微流控管道层的下表面经离子氧化处理；所述基底层和功能层的上表面与所述微流控管道层的下表面贴合在一起。
9.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能条带选自促甲状腺激素(TSH)包被抗体条带、催乳素(PRL)包被抗体条带、促黄体生成激素(LH)包被抗体条带、生长激素(GH)包被抗体条带、卵泡刺激素(FSH)包被抗体条带、皮质醇(Cor)包被抗体条带或其组合；TSH包被抗体浓度为IO-IOOii g/ml ;PRL包被抗体浓度为10-100 y g/ml ；LH包被抗体浓度为IO-IOOii g/ml ;GH包被抗体浓度为IO-IOOii g/ml ;FSH包被抗体浓度为10-100 Ii g/ml ；Cor 包被抗体浓度为 10-100 y g/ml。
10.根据权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能条带为肿瘤标志物AFP包被抗体条带；AFP包被抗体浓度为10-100 u g/ml。
11.一种标记物混合液，包括标记物和稀释剂，其特征在于，所述标记物为标记的生物材料，该标记物能够与待测样品起反应并与待测样品结合在一起；所述待测样品能够与权利要求I至10之一所述的功能条带中的材料起反应并结合在一起。
12.根据权利要求11所述的标记物混合液，其特征在于，所述生物材料选自抗体、抗原、肽、DNA、RNA、蛋白质或其组合。
13.根据权利要求12所述的标记物混合液，其特征在于，所述标记物为标记抗体，标记抗原，或其组合。
14.根据权利要求13所述的标记物混合液，其特征在于，标记物混合液包括 (1)TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体，所述标记抗体的浓度均为1_10 u g/ml ； (2)Cor的标记抗原,浓度为1-10 u g/ml ； (3)稳定剂。
15.根据权利要求I至8之一所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤 (1)将能与特定物质起反应的材料包被或吸附在基底层上，形成功能条带； (2)将微流控管道层贴合在步骤(I)所得基底层的上表面；所述微流控管道层的管道与所述功能条带相垂直并在交叉点相连通； (3)用封闭剂封闭步骤(2)中的管道，之后洗涤管道； (4)干燥，即得所述微流控芯片。
16.根据权利要求9或10所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤 (1)、将微流控管道层覆盖于基底层上，向微流控管道层的管道内分别通入包被抗体，使之固定在基底层相应区域，形成功能条带； (2)、移除步骤(I)中微流控管道层； (3)、取清洁的微流控管道层，对步骤(I)所得的基底层的带有功能条带的表面和微流控管道层的下表面进行离子氧化处理，使微流控管道层和基底层贴合在一起；所述微流控管道层的管道与所述包被抗体条带相垂直并在交叉点相连通； (4)、向步骤(3)中微流控管道层的管道内通入未稀释的新生牛血清，封闭60-200分钟后，在管道内通入PBS冲洗3-4次； (5)干燥，即得所述微流控芯片。
17.根据权利要求9所述的微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括下述步骤 (1)将待测样品与标记物混合液相混合； (2)将步骤(I)所得的混合液通入微流控管道层的管道内，培育30分钟至2小时； (3)向各管道内通入PBS冲洗3-4次后，移除管道层，在反应区域内加入相应试剂； (4)根据试剂性质，检测反应区域的显色、发光或反射性； (5)根据步骤(4)的结果确定样品中的目标抗原； 上述步骤(I)中所述的标记物混合液包括 (1)TSH、PRL、LH、GH、FSH的标记抗体，所述标记抗体的浓度均为1_10 u g/ml ； (2)Cor的标记抗原,浓度为1-10 u g/ml ； (3)新生牛血清。
18.根据权利要求I至10之一所述的微流控芯片的应用，其特征在于，所述微流控芯片用于高效筛选，环境监测，生物分析，临床检测，食品安全检测，动物检测。
全文摘要
本发明涉及生物检测、环境监测、临床检测技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法。为了解决现有技术中生物检测过程中样本用量大，操作步骤复杂的缺陷，本发明提供一种微流控芯片及其制备方法。所述微流控芯片包括基底层、功能层和微流控管道层；所述功能层固定在所述基底层上，其包括至少两条平行的功能条带，所述功能条带为能与特定物质起反应的材料形成的条状带；所述微流控管道层设置有至少两条管道，所述管道与所述的至少一条功能条带相连通，每个管道的两端设置有与大气相通的通孔。本发明提供的微流控芯片能够同时检测多个样本中的多种不同的物质，本发明提供的检测方法操作简单，试剂用量少，节省时间，高效准确。
文档编号G01N33/544GK102614948SQ201210097369
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者刘俊, 李东霞, 沈海莹, 潘竹青, 罗次汐 申请人:北京金智捷生物科技有限公司