专利名称：用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法
技术领域：
本发明涉及卷烟减害效果和安全领域，具体地指一种用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法。
背景技术：
近几十年食品安全问题的受关注度可谓达到空前的状态，烟草虽然绝大多数情况不被直接食用，但很多国家依然把烟草划为食品类或准食品类，作为“特殊食品”其安全性越来越受关注，检测程序和方法也越来越严格。C0RESTA (国际烟草科学研究合作中心)成立了相关的烟草烟气体外毒性测试工作组，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，同时确定标准测试方法。体外毒性测试并非危害的直接测定，但完全可以确保测试产品不会增加潜在的危害，毒理学数据可以在一定程度为卷烟产品安全性评价提供理论依据和信息。然而，对于新型的烟用辅助材料的安全性和功能性评价，即使是常规的检测往往也需要耗费非常大的人力物力，测试成本高、 时间周期长、效率低等问题暴露了出来。随着烟用辅助材料的快速增多、要求更加严格，行业急需要一些新的高速准确的方法来协助，对烟用辅助材料进行初步筛选，缩小范围，降低成本，提高效率。
所有的化学、物理和生命过程都伴随着热效应。对这些热效应进行精确的测定，并作合理的分析，这就成热化学的精髓。随着科学和技术的不断发展，仪器设备的不断改进， 特别是现代微量热技术的发展，热化学越来越多地渗透到其它领域，从而形成了许多新兴的交叉学科。其中最具特色的生物热化学逐渐被人们认识和重视起来。
生物体内的化学反应的热效应一般都很小，而且是在等温状态下进行的。现代等温微量热技术就是在此基础上发展起来的方法。从生命科学的基本研究内容看，可涉及生物的生长发育、生理生化、物质和能量代谢过程。
量热法(Calorimetry)是生物热化学的重要研究方法，它用于生物体系变化过程的热效应研究有许多独到之处。恒温量热仪的工作原理可简述为放入测量池的样品，因某一过程的进行而产生一定的热效应，从而使其自身的温度发生改变。测量池周围有一个维持在恒温状态的散热装置。如样品和散热片之间存在一定的温差，热量就从样品流向散热片，温差的大小与热量流动的速率呈正比。高灵敏度的热电元件分布在反应容器的周围，可测出样品与环境之间的温差并转化为一定的电压，经过放大后输出。如果样品的反应终止， 那么它就与环境保持在相同的温度，不再有热效应输出，热电元件所产生的电压为零。在量热测定过程中不需添加任何试剂，这样就不会引入对生物体系正常活动和代谢有影响的因素，而且还可以有目的地加入某一物质，以研究该物质对生物体活动的影响。此外，量热法可用于任何复杂的体系,如混沌的、高分散体系,对被研究体系的溶剂性质、光谱性质及电化学性质没有任何限制，只要有热效应即可应用，因此，可用于直接研究离体的组织和悬浮液。样品用量少，而且在量热实验后，对研究体系没有任何破坏，还可以进行后续生化分析。 虽然量热法缺乏特异性，但研究对象本身具有特异性，所以用这种非特异的方法可以得到一些有意义的结果。量热法可以用于生命系统中的各种特异过程，如生物机体内各个水平上的生长代谢过程、酶促反应、生物大分子间以及生物大分子与小分子间的相互作用等。当然，量热法也有其不足之处，即不能追踪某一特定个别中间产物的消长过程和宏观体系中的个体情况，只能显示各种过程热效应的总和，但研究者可以结合其他手段，如各种电子显微技术、光谱和波谱等进行解析，取长补短。生物量热技术和理论日趋完善，现已基本形成了生物热化学和生物化学热力学等交叉学科。并且，生物量热技术已渗透到生命科学的各个领域，在生物化学、临床医学、环境科学、农业生态、食品科学等方面获得广泛应用。
微量热法(Microcalorimetry)具有高度自动化、实时在线、微量化(mg待测样品就可完成实验)、灵敏度高(低至nW的热量)、重现性好，而且不会破坏样品的特点，运用于研究生物体系有诸多的优势。微量热法能直接测定微生物或细胞，甚至细胞器对各种外来物质的敏感度；可定量研究外源物与微生物、细胞或细胞器间的作用，获得影响程度、药效、 抑菌率和毒性等方面的信息；结合其他实验方法，还可以研究外源物对实验对象的影响机制。这对外源物的安全性评估，指导药物或添加剂的合成、筛选及应用均具有较强的理论意义。利用生物量热技术的这些特点和优势，能够较好的担当起对烟用辅助材料进行初筛选的重任。在烟用辅助材料进行一系列繁琐的生物安全性评价之前，利用微量热法，可以快速、准确的将绝大部分对细胞(具有代表性的模式细胞或微生物)正常代谢有着显著影响的辅材筛选出来。这样可以大幅降低后期实验成本、人力和时间，起到事半功倍的效果。发明内容
本发明的目的是针对现在的辅助材料体外毒理学检测方法存在成本高、周期长、 效率较低的缺陷，提供了一种用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法。 用于新型卷烟加入物筛选和安全性评价。在实施现有的标准毒理学检测评价方法之前，将烟用辅助材料按影响程度进行分类，将有显著毒性或破坏性的材料以及达不到效果的材料直接排除掉，避免人力和物力上的浪费。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种卷烟辅助材料的安全性评价及筛选的生物热化学方法，包括以下步骤
⑴大肠杆菌LB培养基用于培养及测试，LB培养基配方为5g酵母粉，10 g蛋白胨，5gNaCl溶于IL 二次蒸馏水中，调节pH至7. 4，在120°C、I. 034X 105Pa高压灭菌处理20 min，待用；
⑵金黄色葡萄球菌LB培养基用于培养及测试；
⑶白色假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；
⑷热带假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；
(5)酿酒酵母菌YPDA培养基用于培养及测试，YPDA培养基配方为20g蛋白胨、IOg 酵母抽提物、2g葡萄糖用适量二次蒸馏水溶解，再加入15ml的O. 2%腺嘌呤溶液，定容到 1L，120°C高压灭菌15min，室温贮存，待用；
(6)枯草芽孢杆菌LB培养基用于培养及测试；
(7)苏云金芽胞杆菌LB培养基用于培养及测试；
(8)植物乳杆菌乳酸菌培养基用于其培养和测试；培养基配方为将7. 5g酵母粉、7.5g蛋白胨、IOg葡萄糖、2gKH2P04、0. 5ml吐温80溶于900ml 二次蒸馏水，再加入IOOml番茄汁，混匀后低温贮存，待用；
⑶嗜盐古生菌嗜盐古生菌培养基用于培养及测试，嗜盐古生菌培养基配方为 250gNaCl，2gK2S04，30gMgCl2 · 6H20，2g酵母提取物，2. 5g水解乳蛋白，溶于IL 二次蒸馏水中，待用；
(10)四膜虫四膜虫培养基用于培养及测试，四膜虫培养基配方为15g蛋白胨、5g酵母粉、Ig葡萄糖溶解于IL蒸馏水中，pH值调至7. (Γ7. 5，高压灭菌后待用；
(11)成纤维细胞成纤维细胞培养基用于培养及测试，成纤维细胞培养基配方为 MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和(TO. 4g -Γ1的非必需氨基酸；ΜΕΜ培养基基本成分为 O. 20g · Γ1 无水 CaCl2、0. 0977g .171 无水 MgS04、0. 40g · L-1 KCl、6· 8g · Γ1 NaCl、0· 122g .171 NaH2PO4,0^0. OOlg · Γ1 酒石酸胆碱、(Π). OOlg · Γ1 叶酸、(TO. 002g · Γ1 肌醇、(TO. OOlg · Γ1 烟酰胺、0 0· OOlg · L-1D-泛酸钙、(TO. OOlg · L-1盐酸吡哆辛、0 0· OOOlg · L-1核黄素、 0 0· OOlg · L-1 盐酸硫胺、Ig · L-1 葡萄糖、(To. OOlg · L-1 丁二酸、(H). OOlg · L-1 丁二酸钠、 O. Ollg · L-1芬红、(TO. OOOl g · L-1卡那霉素以及O.1 O. 3 g · L—1必需氨基酸；
(12)上皮细胞上皮细胞培养基用于培养及测试，上皮细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和(Γι%的非必需氨基酸；
(13)线粒体线粒体提取液配方为0. 22mol · L—1甘露醇，0. 07mol · T1M蔗糖， 0. 02mol · L—1羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0. 002mol .L—1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 Tris-HCl,0. OOlmol · Γ1乙二胺四乙酸二钠盐EDTA. 2Na，pH为7. 0 7. 4 ;线粒体测试液配方为0. 22mol · L—1甘露醇,0. 07mol · L—1鹿糖,0. Olmol · L—1三轻甲基氨基甲烧盐酸盐 Tris-HCl,0. OOlmol · L 乙二胺四乙酸二钠盐 EDTA. 2Na, pH 为 7. 0 7· 4 ；
2)卷烟烟气凝聚物收集预处理按标准吸烟机操作方法；将烟气捕集后，以水、 质量分数为5、0%乙醇溶液或者质量分数为1(T50%N, N-二甲基甲酰胺溶液为萃取液,进行振荡或超声波萃取10 60min,过滤后待用；
3)将步骤I)中的每l(T500ul的模式研究对象菌液加入5ml对应的液体培养基中；
4)将步骤2)的浓溶液或悬浊液分成0μ 1、5μ 1、10μ 1、20μ 1、50μ 1、100μ I、200 μ I浓度梯度，并将不同浓度梯度的浓溶液或悬浊液加入步骤3)中液体培养基中，振荡均匀后，
5)将步骤4)中振荡均匀的液体培养基放置于量热仪TAM air或TAM3中，设定温度为2(T40°C恒温，
6)待温度达到设定值且稳定后，将培养液导入微量热仪的检测室，开始采集数据；
7)根据采集数据进行作图、拟合和计算，获得相关的生长产热曲线及热动力学参数，其参数包括代谢过程的生长速率常数k、最大产热功率Pm、总放热量Q、传代时间te、最大热功率对应的时间tm、出峰时间t p和抑制率I、半抑制浓度IC5tl ；
8)比较相关的生长产热曲线及热动力学参数相关的生长产热曲线及热动力学参数，分析加入不同材料对模式研究对象正常代谢的影响及其差异，获得有关卷烟辅助材料安全性的初步评估，可对众多的辅助材料进行筛选；分析有无加入新型材料的烟支，其烟气对模式研究对象代谢指标的影响差异性，可评价卷烟辅助材料是否具有显著的降焦减害的效果。
作为优选方案，所述成纤维细胞的培养基配方中的非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意几种；MEM培养基中必需氨基酸为赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸中的任意几种。


图1为在37°C条件下大肠杆菌生长代谢热谱图，
图中，1.空白，2.卷烟，3.参比卷烟。
具体实施方式
为了更好地解释本发明 ，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例I
对于一种新型烟用二氧化钛参杂富勒烯减害材料进行生物效应的初步鉴定，将其编号为CB02。这种新型富勒烯材料对烟气中的有害成分有着非常好的净化作用。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母菌为模式研究生物，利用TAM3微量热检测仪对它们的代谢过程进行实时监控。我们采集了加入这种材料之后的烟支的主流烟气，同时用未加入这种材料的同种烟支的烟气进行对比。将捕集了主流烟气的剑桥滤片分别放入编号的广口锥形瓶中，加入定量的IOml蒸馏水浸泡并振荡30min。过滤后，从各锥形瓶中均准确取出 100 μ I滤液对应编号加入到已经接种过微生物的5ml培养基中。每种微生物的3瓶培养基分别是加入了 CB02卷烟产生的主流烟气收集液、参比卷烟的主流烟气收集液和空白培养基。用流动泵将培养基泵入微量热仪的样品室，恒温37°C，我们得到了微生物的生长代谢曲线(大肠杆菌生长代谢曲线如图所示)。通过对数据的分析和处理，得出了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色假丝酵母菌代谢过程的一系列物理化学参数，列于表I。k是生长速率； PmS最大放热功率；Q是整个代谢过程的总放热量；te是传代时间。由数据看出，加入CB02 的卷烟主流烟气收集液对三种微生物正常代谢基本没有构成显著影响，其影响要远远小于参比卷烟。而参比卷烟的主流烟气收集液使微生物生长速率k减慢，最大放热功率Pm明显降低，总放热量Q下降，传代时间te延长。结果表明，在卷烟中加入CB02材料可以降低卷烟主流烟气的有害程度。
表I三种微生物代谢过程的相关物理化学参数
研‘先对象样品空白大肠杆菌CB02 A金黄色Jr、 Sw"*CB02β萄球菌空白_u箐而I白色假丝CB02酵母菌参比
实施例2
对于四种新型烟用功能性碳纳米管复合材料的滤嘴进行过滤效果分析。前两种多为壁碳纳米管，直径分别为5 nm、10 nm ;后两种为单壁碳纳米管,直径分别为2nm、lnm。这四种滤嘴在理论上对烟气都有不同程度的吸附作用和选择性效果，分别给他们编号为1#、 2#、3#和4#。利用微量热技术可以对这四种滤嘴的过滤能力进行快速、准确的比较，评价他们的过滤能力。对效果明显较差的滤嘴进行筛选和排除，无需进行中试或者工业化应用等评估，节约了大量的资金和时间。实验利用同样牌号的烟丝，并将该牌号的卷烟作为参比卷烟。以酿酒酵母菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜盐古菌和四膜虫为模式研究生物，利用 TAM air等温微量热检测仪对样品卷烟和参比卷烟主流烟气作用影响下模式研究生物代谢过程进行实时监控。通过对采集到的数据的分析整理，获得微生物代谢过程各相关物理化学指标。吸烟机抽吸各样品卷烟和参比卷烟，并用10ml20%的乙醇溶液捕集其主流烟气，经过30min振荡后，过滤并封存待用。将多种模式研究生物分别转入5ml液体培养基中，再向培养液中加入处理过的主流烟气捕集液，转入安瓿瓶。振荡均匀后，将安瓿瓶放入TAM air 等温热活性检测仪的样品室，恒温30°C (酿酒酵母菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和四膜虫) 或37°C (嗜盐古生菌)进行实时监测。采集到的数据经过处理，可以获得相关物理化学参数(表2)。k是生长速率；Pm为最大放热功率；Q是整个代谢过程的总放热量。空白是未加入任何烟气捕集液的模式研究生物代谢参数。分析数据可知，1#捕集液对模式研究生物的代谢存在较小的抑制作用，各项参数均表现出比参比卷烟的抑制性弱，说明过滤有害成分的效果超过了参比卷烟原装滤嘴；2#捕集液表现出比参比卷烟捕集液更高的抑制作用，说明过滤有害成分的效果不及参比卷烟原装滤嘴，因此该新型滤嘴不可取;3#捕集液的各项参数表现出其抑制能力最低，远低于参比卷烟，过滤效果最佳；4#捕集液的各项参数与参比卷烟捕集液极其相近，具体效果还需进行进一步的分析。综上，可以认为碳纳米管直径在 2^5nm的过滤效果较佳,其中以5nm管径的多壁碳纳米管效果最佳。
表2微生物代谢过程的相关物理化学参数
k (min'1) 0.0391 0.03820.03660.02520,02460,02290,0543(105300,0507Pmim)79.027666.8028.53 27.68H /T46.5345'6441.17Qmal (J) 0.342 0.335 0.290 0.139 0.13 1 0.125 0,161 0.146 0.122/g (min)I 9 ΠΠM mrnta / /13.0813,6权利要求
1. 一种卷烟辅助材料的安全性评价及筛选的生物热化学方法，包括以下步骤⑴大肠杆菌LB培养基用于培养及测试，LB培养基配方为5g酵母粉，10 g蛋白胨， 5gNaCl溶于1L二次蒸馏水中，调节pH至7. 4，在120°C、1. 034X 105Pa高压灭菌处理20min， 待用；⑵金黄色葡萄球菌LB培养基用于培养及测试；⑶白色假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；⑷热带假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；(5)酿酒酵母菌YPDA培养基用于培养及测试，YPDA培养基配方为20g蛋白胨、10g酵 母抽提物、2g葡萄糖用适量二次蒸馏水溶解，再加入15ml的0. 2%腺嘌呤溶液，定容到1 L， 120°C高压灭菌15min，室温贮存，待用；(6)枯草芽孢杆菌LB培养基用于培养及测试；⑴苏云金芽胞杆菌LB培养基用于培养及测试；⑶植物乳杆菌乳酸菌培养基用于其培养和测试，培养基配方为将7. 5g酵母粉、7. 5g 蛋白胨、10g葡萄糖、2gKH2P04、0. 5ml吐温80溶于900ml 二次蒸馏水，再加入100ml番茄汁， 混匀后低温贮存，待用；⑶嗜盐古生菌嗜盐古生菌培养基用于培养及测试，嗜盐古生菌培养基配方为 250gNaCl，2gK2S04，30gMgCl2 6H20，2g酵母提取物，2. 5g水解乳蛋白，溶于1L 二次蒸馏水 中，待用；_四膜虫四膜虫培养基用于培养及测试，四膜虫培养基配方为15g蛋白胨、5g酵母 粉、lg葡萄糖溶解于1L蒸馏水中，pH值调至7. (T7. 5，高压灭菌后待用；(11)成纤维细胞成纤维细胞培养基用于培养及测试，成纤维细胞培养基配方为MEM 基础培养基，加入10%胎牛血清和(TO. 4g L—1的非必需氨基酸；MEM培养基基本成分为 0. 20g L-1 无水 CaCl2、0. 0977g I71 无水 MgS04、0. 40g I71 KC1、6. 8g I71 NaCl、0. 122g *L_1 NaH2P04、0 0. OOlg I71 酒石酸胆碱、(H). OOlg I71 叶酸、(TO. 002g I71 肌醇、(TO. OOlg I71 烟酰胺、(To. OOlg L^D-泛酸钙、(To. OOlg L-1盐酸吡哆辛、(To. OOOlg L-1核黄素、 (To. OOlg L-1 盐酸硫胺、lg L-1 葡萄糖、(To. OOlg L-1 丁二酸、(To. OOlg L-1 丁二酸钠、 0. 01 lg L-1芬红、(To. OOOlg L-1卡那霉素以及0. ro. 3 g L—1必需氨基酸；(12)上皮细胞上皮细胞培养基用于培养及测试，上皮细胞培养基配方为MEM基础培养 基，加入10%胎牛血清和(Tl%的非必需氨基酸；似线粒体线粒体提取液配方为0. 22mol -r1甘露醇，0. 07mol -L^M蔗糖，0. 02mol七1 羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0. 002mol .L—1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris_HCl， 0. OOlmol T1乙二胺四乙酸二钠盐EDTA. 2Na, pH为7. 0 7. 4 ;线粒体测试液配方为 0. 22mol .L—1甘露醇，0. 07mol L—1蔗糖，0. Olmol L—1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl， 0. OOlmol L h 乙二胺四乙酸二钠盐 EDTA. 2Na, pH 为 7. 0 7. 4 ；2)卷烟烟气凝聚物收集预处理按标准吸烟机操作方法；将烟气捕集后，以水、质量分 数为5、0%乙醇溶液或者质量分数为1(T50%N, N-二甲基甲酰胺溶液为萃取液，进行振荡或 超声波萃取10 60min,过滤后待用；3)将步骤1)中的每l(T500ul的模式研究对象菌液加入5ml对应的液体培养基中；4)将步骤2)的浓溶液或悬浊液分成0111、5111、10111、20111、50111、100111、200111浓度梯度，并将不同浓度梯度的浓溶液或悬浊液加入步骤3)中液体培养基中，振荡均匀后， 5)将步骤4)中振荡均匀的液体培养基放置于量热仪TAMair或TAM3中，设定温度为20 40で恒温，6)待温度达到设定值且稳定后，将培养液导入微量热仪的检测室，开始采集数据； 7)根据采集数据进行作图、拟合和计算，获得相关的生长产热曲线及热动力学參数，其參数包括代谢过程的生长速率常数k、最大产热功率Pm、总放热量Q、传代时间te、最大热功率对应的时间tm、出峰时间tp和抑制率I、半抑制浓度IC5tl ； 8)比较相关的生长产热曲线及热动力学參数相关的生长产热曲线及热动力学參数，分析加入不同材料对模式研究对象正常代谢的影响及其差异，获得有关卷烟辅助材料安全性的初步评估，可对众多的辅助材料进行筛选；分析有无加入新型材料的烟支，其烟气对模式研究对象代谢指标的影响差异性，可评价卷烟辅助材料是否具有显著的降焦减害的效果。
2.根据权利要求I所述的卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法，其特征在于所述成纤维细胞的培养基配方中的非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意几种；MEM培养基中必需氨基酸为赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸中的任意几种。
全文摘要
本发明公开一种用于卷烟辅助材料安全性评价及其筛选的生物热化学方法。本方法采取体外宏观微量热实验，通过等温热活性检测仪对已经过处理的微观研究对象整个代谢过程进行实时监测，利用采集模块收集过程中的热量变化，计算出相关物理化学参数。本发明操作简单、成本极低、实验周期短、效率高、结果准确可靠，还能实时观测整个代谢过程，开创了一种初步鉴定卷烟减害效果以及添加物筛选的新方法，为后面的进一步分析评价提供了重要的参考依据，并且在提高了效率的同时大大降低了成本。
文档编号G01N25/48GK102980913SQ20121045233
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者李冉, 宋旭艳, 魏敏, 罗诚浩, 陈义坤 申请人:湖北中烟工业有限责任公司