专利名称：猪血浆蛋白肽的安全性评价方法
技术领域：
本发明属食品安全领域，是利用食品安全评价技术对猪血浆蛋白肽进行安全性评 价。
背景技术：
活性聚肽不仅具有营养作用和生物活性，而且还具有快速吸收的特点，因此活性 聚肽在食品中的应用前景广阔。目前，国内对于酶解后的生物活性肽的研究集中在分离、纯 化和功能性研究上，未见相关安全性及毒性研究方法的报道。但是，在食品研究与开发中为 确保肽的食用安全，相关安全性及毒理学研究也是必不可少的。为评价其安全性，我们进行 了急性毒性，遗传毒性实验及30天喂养实验研究，为动物血液多肽保健食品的开发和其合 理安全使用提供科学依据。

发明内容
(1)猪血浆蛋白肽的小鼠急性毒性评价方法小鼠隔夜空腹，一次性灌胃0. 5g/mL质量浓度的猪血浆酶解肽，在两周内记录小 鼠的死亡情况，计算LD5tl，评价猪血浆蛋白肽的急性毒性。(2)猪血浆蛋白肽的遗传毒性评价方法猪血浆蛋白肽的骨髓细胞微核试验7-12周龄的清洁级昆明种(KM)小鼠，设立3个试验组，2个对照组，各组雌雄各 半。高剂量组、中剂量组、低剂量组，分别灌胃质量浓度0.5，0. 25,0. 125g/mL的猪血浆蛋白 肽，阴性对照组灌等体积的蒸馏水，阳性对照组灌胃蒸馏水后腹腔注射环磷酰胺。两次灌胃 后处死小鼠，取其胸骨骨髓涂片固定染色后在油镜下观察嗜多染红细胞，计算微核率。小鼠精子畸形试验成年雄性昆明种(KM)小鼠，设立3个试验组，2个对照组。高剂量组、中剂量组、低 剂量组，分别灌胃质量浓度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的猪血浆蛋白肽，阴性对照组灌等体积的 蒸馏水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺。连续处理5天，每天一次，5周后处死小鼠，取下双 侧附睾，制备精子涂片，染色后在高倍显微镜下观察，计算精子畸形率。(3)猪血浆蛋白肽粉的大鼠亚慢些毒性评价方法SD大鼠，设立3试验组，1个对照组，各组雌雄各半。高剂量组、中剂量组、低剂量 组，将饲料与猪血浆蛋白肽按比例每天喂养大鼠，3个试验组大鼠饲料中猪血浆蛋白肽质量 分数分别为100%，50%和25%，对照组采用全价饲料喂养。连续喂养30天，观察动物一般 表现、行为等特征，在试验结束时进行大鼠血常规检查、白细胞检查及血液生化指标检查。
具体实施例方式实施例11材料及分析方法
1.1 样品试验样品为猪血浆蛋白肽粉。1.2供试动物清洁级昆明种小鼠，6-8周龄，体重18 20g。1.3统计学方法计量资料方差分析，计数资料卡方检验。2小鼠急性毒性实验雌雄各10只，预饲养5d以适应环境。取猪血浆蛋白肽粉，按0. 5g/mL的质量浓度 与水混勻成糊状。小鼠在给予受试物前小鼠隔夜空腹禁食16h，按0.4mL/20g—次性灌胃。 实验室环境温度为20 24°C，湿度为55% 60%。连续观察2周，记录小鼠中毒症状，注意观察记录发生各种症状的时间、症状表观 程度、发展的过程和死亡的数目、死亡前特征及死亡时间，计算猪血浆蛋白肽的LD5tl，进行急 性毒性分级。实施例21.材料及分析方法1. 1 样品试验样品为猪血浆蛋白肽粉；阳性对照物为环磷酰胺(现配现用)；阴性对照物为蒸馏水。1. 2试验动物昆明种(KM)小鼠。1.3统计学方法计量资料方差分析；计数资料卡方检验。以P <0.05为有统计学显著差异。2.遗传毒性实验2. 1骨髓细胞微核试验7-12周龄昆明种(KM)小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。编为A， B, C，D，E组，其中A组为阴性对照组，B组为高剂量组，C组为中剂量组，D组为低剂量组，E 组为环磷酰胺阳性对照组。各组的处理方法各组分别按最大灌胃容量0. 4mL/20g灌胃，其 中A和E组灌胃物为蒸馏水，B，C，D组灌胃物分别为质量浓度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的蛋白 肽溶液，E组腹腔注射环磷酰胺(40mg/kg)。各组均采用全价饲料饲养，自由饮水。实验室 环境温度为20 24°C，湿度为55% 60%。二次间隔24h灌胃，第二次灌胃后6h，颈椎脱臼处死小鼠。剖开胸腹部，小心的取 下胸骨剔去肌肉，用止血钳挤出骨髓于有一滴小牛血清的载玻片上，均勻混合。涂片自然干 燥后放入甲醇中固定15min，将固定好的涂片放入Giemsa应用液中，染色10-20min，用蒸馏 水洗净浮色、晾干。每只动物涂片在油镜下计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜 多染红细胞数，计算微核率。2. 2小鼠精子畸形分析成年雄性昆明种(KM)小鼠25只，分为5组，编号为A，B, C，D，E组，每组5只。其 中A组为阴性对照组，B组为高剂量组，C组为中剂量组，D组为低剂量组，E组为环磷酰胺阳性对照组。各组的处理方法分别按最大灌胃容量0. 4mL/20g灌胃，其中A和E组灌胃物 为蒸馏水，B, C，D组灌胃物分别为质量浓度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的蛋白肽溶液，E组再按 40mg/kg腹腔注射环磷酰胺，各组均以全价饲料饲养，自由饮水。连续处理5d，每天一次。在首次给药5周后，以颈椎脱臼法处死小鼠，摘取双侧附睾置于约2ml磷酸盐缓冲 生理盐水中。用眼科剪将副睾纵向剪1-2刀，静置3-4min后轻轻摇动。用四层擦镜纸过滤， 吸取精子悬液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5min以上，干燥，用2%伊红水溶液染色lh， 用蒸馏水洗去浮色，烘干。每只动物涂片在高倍镜下观察1000个精子，记录精子畸形数。实施例31材料及分析方法1. 1 样品猪血浆蛋白肽粉。1. 2试验动物离乳SD大鼠，体重77 95g。1. 3统计学方法计量资料方差分析；计数资料卡方检验。以P <0.05为有统计学显著差异。2 30天喂养试验取80只大鼠，雌雄各40只，随机分成4组，3个试验组和一个对照组，每组雌雄各 10只，试验前称重，动物体重的差异不超过平均体重的120%。中剂量组、低剂量组受试物 的配制方法为取血浆蛋白肽粉和全价饲料猪，分别按1 1和1 4的比例混合均勻，再 用制粒机压制成含蛋白肽粉质量分数分别为50%和25%的颗粒料；高剂量组采用100%猪 血浆蛋白肽粉饲喂，对照组采用全价饲料饲喂。饲养30天。2. 1 一般情况观察每天观察并记录动物的一般表现、行为、体重、中毒表现和死亡情况。2. 2血液学指标喂养试验结束时从大鼠眼窝静脉丛处采血，EDTA钠盐抗凝，测定血液学常规指 标。包括红细胞(RBC)计数，白细胞(WBC)计数、血红蛋白(Hb)、中性粒细胞(GR)和血小板 (PLT)计数等。2. 3血液生化学指标喂养试验结束时从大鼠眼窝静脉丛处采血，恒温箱中凝固2h，离心分离血清，检测 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、血清白蛋白 (Alb)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TCH)和甘油三醋(TG)。
权利要求
本发明涉及到一种酶法制取血浆蛋白肽的安全性评价方法，其特征在于所述方法包括下述步骤a)猪血浆蛋白肽对小鼠的急性毒性研究，灌胃0.2～0.8g/mL质量浓度的猪血浆蛋白肽；b)猪血浆蛋白肽对小鼠的遗传毒性研究，试验组分别灌胃0.2～0.8g/mL质量浓度的猪血浆蛋白肽溶液，从高到底依次递减；c)猪血浆蛋白肽对大鼠亚慢性毒性研究，试验组大鼠饲料为全价饲料与猪血浆蛋白肽按一定比例混合，从高到底猪血浆蛋白肽含量依次递减；d)根据以上试验综合评价猪血浆蛋白肽的安全性。
2.根据权利要求1所述的猪血浆蛋白肽对小鼠的急性毒性研究，其特征在于对小鼠灌 胃0. 5g/mL质量浓度的猪血浆蛋白肽，观察小鼠中毒死亡的数量，计算LD50，评价猪血浆蛋 白肽的急性毒性。
3.根据权利要求1所述的猪血浆蛋白肽对小鼠遗传毒性研究，其特征在于3个试验组 分别灌胃质量浓度0. 5,0. 25，0. 125g/mL的猪血浆蛋白肽溶液。
4.根据权利要求1所述的猪血浆蛋白肽对小鼠亚慢性毒性研究，其特征在于3个试验 组大鼠饲料中猪血浆蛋白肽质量分数分别为100%，50%和25%。
5.根据权利要求2所述猪血浆蛋白肽对鼠的急性毒性研究，其特征在于试验采用的是 6-8周龄昆明小鼠。
6.根据权利要求3所述猪血浆蛋白肽对小鼠遗传毒性研究，其特征在于在骨髓细胞微 核试验中采用的小鼠为7-12周龄清洁级昆明小鼠，在精子畸形试验中采用的是成年雄性 昆明小鼠。
7.根据权利4所述猪血浆蛋白肽对小鼠亚慢性毒性研究，其特征在于采用的试验动物 是离乳SD大鼠，体重77 95g。
全文摘要
本发明提供了一种血浆蛋白肽安全性评价的方法。本方法首先选用国内资源浪费严重的猪血液作为原料提取血浆蛋白，通过酶解制备猪血浆生物活性肽。为评价其安全性，进行了小鼠急性毒性及遗传毒性实验研究，为动物血液多肽保健食品的开发和其合理安全使用提供科学依据。
文档编号G01N33/02GK101915822SQ20101022212
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者吴涵, 宫新统, 李洪山, 潘风光, 赵娅娅 申请人:吉林大学