专利名称：超声波对固定化过氧化物酶活性影响的一种实时检测方法
技术领域：
本发明涉及一种测量酶活性变化的方法。具体涉及采用电化学传感器对酶活性的扰动和变化进行的持续性的监测，用于检测超声辐射对固定化过氧化物酶催化活性的影响。
背景技术：
超声波常用于破碎细胞并提取细胞内的酶蛋白，蛋白质的增溶与乳化，食品加工等领域。研究发现超声辐射有时会导致酶的失活。也有研究证实，在一定功率和频率范围内超声辐射非但不会使酶失活，反而可提高酶促反应的产率和酶的活性。测试超声波对酶催化活性影响已有报道。不过，目前呈现出两种截然不同的实验结果。一种结果表明超声波在任何情况下均降低酶的活性[Tian ZM et al. (2004)Ultra.Sonochem. 11 :399-404 ;宋翼行等(2008)化学与生物工程25 :27-30 ;王文宗等(2010)食品科学31 :331-334]。而另一种结果却显示虽然在大功率和高频超声波刺激下使酶的活性下降，但低功率和低频率的超声波反而会使酶的活性提高[Ishomori Y et al. (1981)Eur.J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 13 :197-201 ；Ishomori Y et al. (1981)Mol. Catal. 12 253-259 ；Rosenfeld E &Schmidt E. (1984)Archives Acoustics 9 105 ;魏兀忠等(1994)甘肃农业大学学报15 :79-81 ;黄卓烈等(2003)中国生物工程杂志23 :89-93 ;钱春梅等(2004)华南农业大学学报25 73-77 ;朱少娟等(2005)食品与生物技术学报24 :50-54 ;许可等(2007)华南农业大学学报28 60-64 ;马歌丽等(2007)现代食品科技23 :17-19 ;李慧等(2010)吉林农业大学学报32 =460-64 ;朱凯等(2011)南京工业大学学报33 :53-57]。但是，上述研究是将酶预先用超声进行处理，然后再进行活性检测而得到的结果。酶活性的上升或下降只是反映出超声作用后蛋白质构象变化所残留的结果，而不能给出酶在超声作用下的实时变化。目前只有少量的研究是在超声下对酶活性进行测量的[XiaoYM et al. (2005)Carbohydrate Res. 340 :2097-2103 ；Shah S&Gupta MN(2008)Chem. Cent.J. 2 l-8]。但无论哪种方法均是采用紫外-可见光分光光度计法，荧光发射光谱法、气相或液相色谱法、凯氏定氮法进行测量。通过检测产物的增加来估算反应速率，酶活性的变化是由产物随时间变化的斜率来表示。这种方法实际上还不够灵敏。上述酶催化体系多属于均相催化反应。溶液中的酶在超声空化作用下比较容易变性。如果采用固定化酶，催化反应速率则可受到底物传质速率的制约，表现为反应速率随体系的搅拌速率的加速而上升。由此，超声波对酶活性的影响是多种因素混合的结果，它混杂着酶蛋白变性失活、底物传质和酶蛋白构象变化的共同作用机制。以辣根过氧化物酶、底物H2O2和氢醌电子媒介体的生物传感器可作为酶活性测定较为理想的装置。此类传感器技术已用于医疗、食品和环保领域的检测。本发明构建了一套用于检测超声辐射对酶影响的传感器。此方法非常灵敏，不仅能够检测超声波处理过酶 的性质，而且可以对正在超声作用下的酶进行表征。发明内容
本发明的目的之一是为研究超声波对酶活性的影响建立一种有价值的实验方法。本发明的目的之二是建立一种持续性监测酶催化活性受外界物理刺激而发生变化的方法。本发明的目的之三是为研究酶动力学和机理的探索提供一种技术手段。为了达到上述目的，本发明将常用的辣根过氧化物酶/H2O2/氢醌传感器用于酶催化活性检测体系中。在催化反应中，HRP被H2O2氧化为HRP氧化态I。这种氧化态HRP首先被一个氢醌分子还原成HRP氧化态II，随后再被一个氢醌分子进一步还原成HRP。而2个氢醌分子被氧化成苯醌，它们在负电极上得到电子又重新还原为氢醌，同时产生还原电流。当反应处于稳态时，充足的H2O2可使还原电流处于一个稳定的数值上。持续检测电流值就可对酶的活性进行实时监测，包括超声波对酶体系的影响。当酶和底物分子受到扰动时，催化活性的微小变化均可在还原电流中显示出来。具体工艺如下电化学传感器采用简单的三电极系统玻碳电极为工作电极，钼丝为对电极，甘汞电极(SCE)为参比电极。将辣根过氧化物酶和牛血清白蛋白混合后覆盖在玻碳电极上，加入戊二醛使BSA交联成膜。将酶修饰的工作电极与对电极和参比电极浸入含氢醌的KH2PO4-Na2HPO4磷酸盐缓冲液(PBS)中，电极导线连接到电化学工作站，由此构建出酶传感器。对电流-时间的曲线进行观察。向体系加入H2O2，待电流平稳后施加搅拌。在较低的搅拌转速下电流随转数的增大而升高。当搅拌提高到一定转速时电流不再上升时，维持这一转速，向体系施加不同的超声辐射，并实时监测还原电流的变化。在传感器中施加频率45kHz和功率在40 100W范围的超声辐射。如附图I所示，还原电流在超声辐射下有显著的提高。而且，电流随着超声功率的增大而逐渐上升。这说明固定化的辣根过氧化物酶在超声作用下并没有变性失活。超声波的空化作用常常使均相酶变性，而固定化酶具有一定的抗变性能力。此外，在强烈的搅拌下，超声辐射仍能够进一步提高反应速率，此时超声波的传质促进作用可以被忽略。这意味着超声波能够对酶蛋白本身产生影响。这一点也可以从超声作用前后蛋白质差示紫外图谱的文献中得到支持(黄卓烈等(2003)中国生物工程杂志23 89-93 ;钱春梅等(2004)华南农业大学学报25 :73-77 ；许可等(2007)华南农业大学学报28 60-64 ;宋翼行等(2008)化学与生物工程25 :27-30)。在传感器中施加功率100W和频率在20 IOOkHz范围的超声辐射。在附图2中，在频率为45kHz的超声作用下的还原电流趋于最大值。这暗示在该频率周围的一定范围内超声对酶蛋白活性具有较大的激励作用。但由于超声波发生器探头的限制，目前尚不能实现更为细致频率扫描。由此得知，在排除了超声波的搅拌作用和使酶变性失活的作用之后，以电化学传感器能够检测到超声辐射可通过影响酶构象来提高催化活性，而且在一个特定的频率下使这种影响达到最大的效果。本发明的优点在于I.以往超声辐射对酶催化活性影响的测定多是将酶进行超声处理后再进行检测，而本发明所采用的方法是检测超声辐射下酶活性的变化。
2.以往超声辐射对酶催化活性影响的测定是间歇性的，是对一段时间催化反应的终态效果进行检测。本发明能够进行持续性监测，即是实时在线测定酶活性的即时变化，并具有很闻的灵敏性。3.本发明采用固定化酶进行测试。固定化酶具有很高的稳定性，具有抵抗超声波空化作用使其变性的能力。4.本发明所述的方法能够探测超声辐射对酶分子构象的影响，可用于酶动力学和酶机理的研究。


图I是不同超声功率下还原电流-时间图。将含有I. OmmoI/L的氢醌和O. Immol/ L的H2O2的PBS溶液的HRP传感器置于超声辐射体系中，在45kHz的频率下依次用40、50、60、70、80、90和IOOW的功率进行超声振荡，得到呈逐渐上升趋势平台的曲线。所施加电压相对于SCE为-O. 25V。图2是不同超声频率下还原电流-时间图。将含有I. OmmoI/L的氢醌和O. Immol/L的H2O2的PBS溶液的HRP传感器置于超声辐射体系中，在IOOW的功率下依次以20、45、80、IOOkHz的频率进行振荡，所施加电压相对于SCE为-O. 25V。
具体实施例方式实施例I :在修饰前，用砂布上覆盖O. 05mm的氧化铝糊浆对玻碳电极的表面进行打磨抛光，随后分别用丙酮、50%硝酸、50% NaOH溶液、双蒸水对玻碳电极进行超声清洗，室温干燥。将2. 5mg 300U/mL两个过氧化物酶和4mg牛血清白蛋白溶于O. 2mL的KH2PO4-Na2HPO4磷酸盐缓冲液(PBS，O. 05mol/L, pH值7. O)中形成混合液。然后将20 μ L的混合液滴加到玻碳电极表面。再将电极置于一个含有25%戊二醛蒸汽的封闭的容器内进行交联4h，室温干燥lh，在4°C下储藏待用。以电化学工作站和三电极系统进行循环伏安实验。其中，以辣根过氧化物酶修饰的玻碳电极作为工作电极；钼丝作为对电极；饱和甘汞电极作为参比电极；PBS(0. 05mol/L，pH值7. O)作为支持电解液。在室温下，循环伏安实验的电势扫描范围(相对于SCE)为-O. 6 O. 2V,扫描速率100mV/s。实施例2 检测超声功率效应的电化学实验在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。电解液中加入lmmol/L氢醌和O. ImL O. lmol/L H2O2溶液。在-O. 25V电压下记录初始电流的基线。调节搅拌器转速到400 600转/min，直至还原电流不再上升。然后，将反应池置于5L超声清洗器中，调节超声频率为45kHz，依次用功率为40、50、60、70、80、90和100W的超声辐射进行处理，每个功率持续100s，得到一种逐渐上升的群峰形的电流-时间曲线。实施例3:检测超声频率效应的电化学实验在盛有20mL支持电解液的反应池中进行。电解液中加入lmmol/L氢醌和0. ImL 0. lmol/L H2O2溶液。在-0. 25V电压下记录初始电流的基线。调节搅拌器转速到400 600转/min，直至还原电流不再上升。然后，将反应池置于5L超声清洗器中，调节超声功率为100W，依次用频率为20、45、80、IOOkHz的超声辐射进行 处理，每个频率持续100s，得到一种先上后降趋势的群峰形电流-时间曲线。
权利要求
1.一种实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法，其特征在于通过电化学传感器的电流-时间曲线持续跟踪超声辐射对固定化酶活性的影响。
2.根据权利要求I所述的一种实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法，其特征在于所利用的传感器是基于辣根过氧化物酶催化H2O2与氢醌的氧化还原反应。
3.根据权利要求I所述的一种实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法，其特征在于辣根过氧化酶是通过戊二醛交联的牛血清白蛋白固定在传感器的玻碳电极上的。
4.根据权利要求I所述的一种实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法，其特征在于在超声辐射频率45kHz和功率范围在40 100W下，通过检测还原电流的变化对酶活性的变化进行测量。
5.根据权利要求I所述的一种实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法，其特征在于在超声辐射频率100W和频率范围在20 IOOkHz下，通过检测还原电流的变化对酶活性的变化进行测量。
全文摘要
本发明公开了一种用电化学传感器实时检测超声波对酶活性影响的工艺方法。所述的工艺方法是在固定化的过氧化物酶催化H2O2与氢醌的氧化还原反应体系中，利用反应过程中还原电流与反应速率存在的定量关系，通过还原电流的变化来实时检测超声辐射对酶活性的作用的效果。此技术不仅能够检测超声波处理过酶的性质，而且可以对正在超声作用下的酶进行表征。不同的超声功率下酶活性的增高说明此方法并没有使酶失活；而不同的超声频率下酶活性所出现的峰值说明该方法可以侦测超声辐射对酶分子本身的效应，可为细胞中酶的提取、食品加工，以及酶催化机制的研究提供一种检测手段。
文档编号G01N27/48GK102645480SQ20121014435
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者王缇缇, 邢达杰, 黄积涛, 黄薇 申请人:南开大学