专利名称：利用透明叶片观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用透明叶片观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法。
背景技术：
形态解剖学研究是植物学研究中的基础研究，特别是叶表皮和叶内部结构的研究 对于植物分类，植物生态学，植物生理学研究以及对叶类药材的鉴定有重要的价值，是其它 方法不可替代的。然而，综观国内外利用光学显微镜对叶表皮和叶内部的多种观察方法，都 存在一定的缺陷，没有一种普遍适用的方法。特别是对于幼嫩叶表皮和纸质叶的观察中表 皮难以分离；对于具有复杂毛被的表皮的观察，即使是扫描电镜也难以看清楚分层次的毛 被和气孔，而对于叶片内部结构的观察，利用切片来观察实验烦琐，无法对其中的一些结构 如晶体，异细胞进行定位观察，而对于叶脉的研究以往的方法，透明叶的制作中用染色的方 法产生光线难以穿透叶片，会导致看不到最细小的叶脉，产生错误的结论，从而影响叶类药 材植物的鉴定、分类，因此如何有效解决成本低、准确地观察叶表皮和叶内部的显微结构是 本领域技术人员所一直希望解决的技术问题。

发明内容
针对上述问题，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用透明叶 观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法，可有效解决成本低、准确地观察叶片表皮和叶内 部的显微结构问题。本发明解决的技术方案是首先，对叶片处理，清洗，再将叶片用乙醇浸泡，除去叶 绿素，然后，用碱溶液浸泡，破外叶肉细胞，放入次氯酸钠中脱色，再用流水漂洗后，放入水 合氯酸中，取出后，再流水漂洗，用梯度酒精脱水，脱水后，置入二甲苯中，使叶片变透明，最 后，用中性树胶或水封片，然后，用光学显微镜观察并摄像，实现对叶片不同层次的内部和 外部结构观察。本发明具有取材少，成本低，工作量小，成功率高，效果好，适用于对各类叶片的观察。
具体实施例方式根据以上技术方案，本发明在具体实施时，是由以下步骤实现1.叶片处理新鲜的叶片(即刚从植物上摘下的叶片)或干燥的叶片，用清水洗 干净表面的灰尘，对于肥厚的叶片内部的观察，新鲜叶片清洗后可以事先徒手将叶片平切 两片，干燥的叶片则可以用水浸泡后切开，然后再进行处理，对于大的叶片可以切成小的 块，如1-3平方厘米，目的在于去除中脉，防止叶片过厚，以便于放入高倍镜下观察微形态。 而对于叶脉的观察可以是直接对整片整片叶子进行处理；2.乙醇(酒精)浸泡，用体积浓度为95%的乙醇浸泡46-50小时，最好48小时为 宜，使叶片呈浅黄绿色，目的是去除叶绿素；
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3.碱溶液浸泡，将除去叶绿素的叶片或切片放置在质量浓度为10%的NaOH溶 液中浸泡，46-50小时，最好48小时为宜，使叶片完全变黑或是变褐；目的在于破外叶肉细 胞；4.用次氯酸钠脱色，将破坏叶肉细胞的叶片或切片放入质量浓度为20%的次氯 酸钠中脱色36-48小时，最好可采用37小时，次氯酸钠起到漂白作用，得漂白的叶片或切 片；5.流水漂洗，将漂白后的叶片或切片放入清水中，流水漂洗3-5分钟，最好为4分 钟，在放于质量浓度为250%的水合氯醛中36-48小时，最好为37小时，而后进行清水流水 漂洗；6.梯度乙醇脱水，流水漂洗后，再依次分别由体积浓度为30^^50^^70%,80%、 95%、100%的乙醇(酒精)进行脱水；7. 二甲苯中透明封片，脱水后的叶片或切片放入二甲苯中透明5-10分钟，叶片变 透明，用中性树胶封片成为为永久封片，凉干后观察；当只做临时观察，可在步骤( 后，用 水直接封片观察；8.显微镜观察并摄像，用水或者中性树胶封片后的叶片或切片，用光学显微镜观 察并摄像，通过调节焦距观察不同层次的内部和外部结构，观察下表皮时，下表皮朝上，观 察上表皮时候，上表皮朝上，同时根据情况调节光线。所述的用水和中性树胶封片，当永久封片时，对透明的叶片或切片，采用中性树胶 封片。使用1毫米厚的载玻片或更大的玻璃片，但是观察微形态时候要用0.1毫米厚的盖 玻片，观察叶脉时候可以用大的1毫米厚的玻璃封片，当不需要永久封片，而只临时观察， 可以在水合氯醛透明后直接用水封片观察。本发明方法经多次反复试用和实验表明，观察结果清晰，叶片内外结构都可以看 到，无需染色，与现有方法相比，具有取材少，成本低，可节约资材和成本50 %以上，工作量 小，工作效率可提高一倍以上，观察准确，准确成功率高达99.9%，效果之好令人非常满意 (未曾料到)，可有效用于各类叶片植物，特别是叶片药用植物的分类、植物生态学、植物生 理学以及对叶类药材的鉴定，有重要的价值，是其他方法无可相比的，本发明的研制成功是 一大创造。
权利要求
1.一种利用透明叶片观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法，其特征在于，由以下步 骤实现(1).叶片处理新鲜的叶片或干燥的叶片，用清水洗干净表面的灰尘，对于肥厚的新 鲜叶片清洗后，徒手将叶片平切两片，干燥的叶片用水浸泡后切开，对于大的叶片切成1-3 平方厘米的小块，除去中脉，防止叶片过厚，以便能够放入高倍镜下观察微形态，当用于叶 脉的观察时，由于不需要在高倍镜下观察，处理中，直接采用整个叶片；(2).乙醇浸泡，用体积浓度为95%的乙醇浸泡46-50小时，使叶片呈浅黄绿色，目的在 于去除叶绿素；(3).碱溶液浸泡，将除去叶绿素的叶片或切片放置在质量浓度为10%的NaOH溶液中 浸泡，46-50小时，使叶片完全变黑或是变褐，目的在于破外叶肉细胞；(4).用次氯酸钠脱色，将破坏叶肉细胞以后的叶片或切片放入质量浓度为20%的次 氯酸钠中脱色36-48小时，得到漂白的叶片或切片；(5).流水漂洗，将漂白后的叶片或切片放入清水中，流水漂洗3-5分钟，在放于质量浓 度为250%的水合氯醛中36-48小时，而后进行清水流水漂洗；(6).梯度乙醇脱水，流水漂洗后，再依次分别由体积浓度为30^^50^^70^^80%, 95%、100%的乙醇进行脱水；(7).二甲苯中透明后封片，脱水后的叶片或切片放入二甲苯中透明5-10分钟，叶片变 透明，用中性树胶封片成为永久封片，凉干后观察；当只做临时观察，在步骤( 后，用水直 接封片观察；(8).显微镜观察并摄像，用水或者中性树胶封片后的叶片或切片，用光学显微镜观察 并摄像，通过调节焦距观察不同层次的内部和外部结构，观察下表皮时，下表皮朝上，观察 上表皮时候，上表皮朝上，同时根据情况调节光线。
2.根据权利要求1所述的利用透明叶片观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法，其特 征在于，所述的用水或中性树胶封片，当永久封片时，对透明的叶片或切片，用1毫米厚的 载玻片或玻璃片，采用中性树胶封片；观察微形态时，用0. 1毫米厚的盖玻片，采用中性树 胶封片，观察叶脉时，用1毫米厚的玻璃封片，当不需要永久封片时，只需临时观察，叶片或 切片在水合氯醛透明后直接用水封片。
3.根据权利要求1所述的利用透明叶片观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法，其特 征在于，所述的乙醇浸泡、碱溶液浸泡，其时间均为48小时；所述的用次氯酸钠脱色，其时 间为37小时；所述的流水漂洗，其时间为4分钟，所述的水合氯醛溶液浸泡，其时间为37小 时。
全文摘要
本发明涉及一种利用透明叶观察叶表皮和叶内部的显微结构的方法，可有效解决成本低、准确地观察叶片表皮和叶内部的显微结构问题。本发明解决的技术方案是首先，对叶片处理，清洗，再将叶片用乙醇浸泡，除去叶绿素，然后，用碱溶液浸泡，破外叶肉细胞，放入次氯酸钠中脱色，再用流水漂洗后，放入水合氯酸中，取出后，再流水漂洗，用梯度酒精脱水，脱水后，置入二甲苯中，使叶片变透明，最后，用中性树胶或水封片，然后，用光学显微镜观察并摄像，实现对叶片不同层次的内部和外部结构观察。本发明具有取材少，成本低，工作量小，成功率高，效果好，适用于对各类叶片的观察。
文档编号G01N21/84GK102095730SQ20101054897
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者刘孟奇, 周静, 柳继锋, 王小巧, 高富 申请人:河南中医学院