专利名称：香草醛-硫酸测定甘草提取多糖后浸膏中甘草酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种甘草酸定量技术领域，更具体地，是一种香草醛-硫酸测定甘草提取多糖后浸膏中甘草酸含量的方法；用香草醛-硫酸法检测甘草提取多糖后浸膏中提取分离甘草酸后甘草酸含量变化趋势的方法。
背景技术：
甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物,主要有效成分为三職化合物、黄酮类和多糖化合物等。甘草酸是甘草的根和根茎中所含的一种五环三萜皂苷，具有抗炎、抗氧、抑菌等作用，但过量服用甘草酸可能引起钠潴留和高血压。甘草提取物的利用大部分是关于甘草酸，由于甘草中含有多类有效成分，只提取甘草酸后所剩残余物如果直接丢弃，会造成资源的浪费。为了节约资源，使中药材资源得到充分的利用，需要对提取完甘草酸后的甘草浸膏开展利用研究。中国专利(CN1359905)公开了一种从甘草中系统分离、提取甘草黄酮、甘草酸、甘草多糖生产方法。目前对提取完甘草酸后甘草渣的利用研究较多，主要是从中提取糖类、黄酮类成分，或者利用其作为原料制备其它物质。中国专利(CN1752081)公开了一种从甘草渣中提取甘草黄酮的方法。中国专(CN101519408)公开了一种从甘草渣中生产光甘草定的方法。中国专利(CN102154908A)公开了一种利用甘草渣制备浆柏的方法。中国专利(CN1322483)公开了一种利用甘草渣制备粗饲料的技术。中国专利(CN1292990)公开了一种利用甘草渣制备食用菌培养料的方法。中国专利(CN102151296A)公开了一种从甘草渣中提取降血糖活性成分的方法。综上所述，大多研究为对提取完甘草酸后甘草渣的利用，但是目前尚未见到从提取完甘草多糖后的甘草浸膏中提取甘草酸的研究报道。甘草渣一般为药材提取完后的药材残渣，由于甘草中有效成分为三萜化合物、黄酮类和多糖类，一些药厂提取完糖类后得到甘草浸膏，甘草浸膏未提取其它物质，所以对甘草浸膏的再利用问题，是药厂等比较关心的问题。从提取完甘草多糖后的甘草浸膏中提取分离甘草酸，由于涉及的甘草浸膏不含糖类的特性以及所用的分离方法为吸附树脂流化床，重点考察的是含量的变化趋势，所以亟需找到一种简便、准确、稳定的测定甘草酸含量的方法。目前，甘草酸含量测定方法主要有重量法、比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法及毛细管电泳法等。高效液相色谱和毛细管电泳法精确度高，但成本高，一般更适用于甘草酸含量较少时具体含量的测定，如一些制剂中甘草酸含量的测定。比 色法在测定皂苷类成分含量方面仍比较常见，鱼红闪、张恩淑利用香草醛-硫酸法测定甘草酸含量时，均用乙醇溶液溶解显色剂进行直接测定，但经过预实验发现乙醇对吸光度的测定有很大干扰，且刘芄岩等研究也发现甲醇、乙醇等溶剂对该法显色有很大干扰。张中伟发现香草醛-高氯酸法作为三萜皂苷常用的显色剂，较香草醛-硫酸法精密度高，受糖类干扰小，但该法需要用到冰醋酸和高氯酸两种溶剂。
发明内容
本发明的目的在于根据待测的甘草浸膏的特性，对原有的香草醛硫酸显色条件进行改进，并对显色前溶液进行预处理，为药厂对甘草提取多糖后的浸膏的利用提供一种适合检测该浸膏进行提取和粗分离甘草酸后甘草酸含量变化趋势的简便、准确、稳定的方法。本发明是通过以下技术方案实现的香草醛-硫酸测定甘草提取多糖后浸膏中甘草酸含量的方法，该方法的步骤如下(I)甘草酸标准溶液和样品待测溶液的配制用无水乙醇加去离子水配制成10 30%的乙醇溶液。称取0. 0250g甘草酸溶于10 30%的乙醇中，配制成I. Omg mr1的甘草酸标准溶液。称取0. 0250g干燥后的甘草浸膏溶于10 30%的乙醇中，同样配制成I. Omg mL-1的样品待测溶液(2)标准溶液和样品待测溶液的预处理(3)吸光度的测定向处理后的溶液，加入0. 25mL 5. 0 7. Omg *mL 1香草醒水溶液和I. 75 2. 25mL70 80% (v/v)硫酸，放入70 80°C的水浴中加热20 30min，以0. 25mL蒸馏水代替试样液为空白对照，在波长530 540nm，以Icm石英比色皿，用紫外可见分光光度计进行吸光
度测定。步骤(I)中所述，其特征在于所用样品为甘草提取多糖后浸膏，其不含有蛋白质、淀粉等糖类物质。步骤(2)中所述，其特征在于甘草酸标准品溶液和甘草浸膏样品溶液在进行显色前必须进行预处理，具体步骤为取待测液0. 25mL，置于78 82°C水浴中，加热I I. 5h，将溶液中所含乙醇挥发。步骤(3)中所述，吸光度测定步骤中，其特征在于所用显色剂为香草醛-硫酸，测定波长为530 540nm。由于香草醛-硫酸法受糖类干扰较大，糖类的存在会较大地降低该方法精密度。所以本发明的香草醛-硫酸测定甘草酸的方法，对不含糖类的甘草浸膏的针对性强，并不适用于对所有含甘草酸物质中甘草酸含量的测定。本发明从反应原理出发，通过对影响比色的香草醛浓度(如图I)、硫酸浓度(如图2)、硫酸用量(如图3)、反应温度(如图4)及反应时间(如图5)因素的考察，得到最佳显色条件显色剂为0. 25mL 5. 0 7. Omg mL 1香草醒水溶液和I. 75 2. 25mL 70 80%(v/v)硫酸，显色温度为70 80°C，显色时间为20 30min。如图I所示，当香草醛浓度低于5. Omg mL—1显色反应不完全，当高于7. Omg mL—1反应的重现性差；如图2所示，当硫酸浓度低于55%，由于这些浓度的硫酸不具有氧化性所以未发生显色反应，低于70%硫酸反应效果差，高于80%会引起香草醛自身缩合反应，导致与甘草酸反应的香草醛减少从而使产物减少；如图3所示，硫酸用量低于I. 75mL,由于体积总量过小，无法用比色皿进行吸光度的测定，硫酸用量大于2. 25mL，溶液PH降低，甘草酸的溶解度降低，吸光度减少。如图4所示，当温度低于70°C反应效果差，温度高于80°C，反应效果不再增加。如图5所示，反应时间低于20min,反应不完全,高于30min,反应已经完成。在最佳显色条件下，本方法在排除乙醇对显色的干扰后，通过紫外可见分光光度计测定，该方法显色后Ih内稳定性好(RSD小于2%，n = 60)，甘草酸标准曲线线性回归方程C = 0. 1517A-0. 0078，R2 = 0. 9996，在 0. 0200 0. IOOOmg mL-1 范围内，线性相关性较好。样品待测液测定精密度好(RSD小于5% )。样品中甘草酸加样回收率90. 10 101. 54%之间，相对标准偏差(RSD)小于5%。本发明优点首先在于根据甘草浸膏中不含糖类的特性，选择10 30%乙醇(v/v)溶液作为溶剂，在溶液显色前对其进行了排除乙醇干扰的预处理步骤，精密度可以得到很大的提高，以香草醛-硫酸作为显色剂，由于该法在本发明中不受糖类干扰，灵敏度可以得到进一步的提高，且只使用一种显色溶剂，操作更加简便。溶液经过预处理后，以香草醛硫酸为显色剂在考察得到的最佳的 显色条件下显色，稳定性好、精密度及加样回收率高，可以较好的用于对甘草提取完多糖后浸膏中提取和分离甘草酸后甘草酸含量的变化趋势的检测。


图I :香草醛浓度对显色的影响图；图2 :硫酸浓度对显色的影响图；图3 :硫酸体积对显色的影响图；图4 :加热温度对显色的影响图；图5 :加热时间对显色的影响图。
具体实施例方式实施例I(I)甘草酸标准溶液的配制用量筒取62. 5mL无水乙醇于250mL容量瓶中，加去离子水定容配制成25% (v/v)乙醇溶液。称取0. 0250g甘草酸溶于上述25%乙醇25mL中，微热溶解，配制成I. Omg -mr1的甘草酸标准溶液。称取0. 0250g甘草浸膏溶于上述25%乙醇25mL中，微热溶解，配制成I. Omg mL—1的甘草浸膏样品溶液。(2)甘草酸标准溶液的预处理分别取待测液0. 25mL，置于80°C水浴中，加热lh，将乙醇挥发。(3)方法学考察I)显色稳定性的考察以甘草酸标准品溶液，以0. 25mL 6. Omg mL—1香草醛水溶液和2. 0mL75% (v/v)硫酸为显色剂，在75°C进行显色反应25min，在535nm处设置紫外分光光度计在Ih内每隔一分钟测定一次显色后溶液的吸光度，结果显不RSD小于2% (n =60) ；2)标准曲线的制备分别配制0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. Omg mr1的甘草酸标准品溶液，各取0. 25mL,进行预处理，以0. 25mL 6. Omg .mL4香草醒水溶液和2. OmL 75% (v/v)硫酸为显色剂，在75°C进行显色反应25min，在535nm处进行吸光度测定，以吸光度A为横坐标，甘草酸浓度c为纵坐标，绘制标准曲线。甘草酸标准曲线线性回归方程C = 0. 1517A-0. 0078，R2 = 0. 9996，在0. 0200 0. IOOOmg mL—1范围内，线性相关性较好。3)精密度的测定吸取预处理后样品待测液8份，以0. 25mL 6. Omg mL—1香草醛水溶液和2. OmL 75% (v/v)硫酸为显色剂，在75°C进行显色反应25min，在535nm处进行吸光度测定，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显示甘草浸膏中甘草酸含量为0. 3138mg mL-1, RSD小于5% ；4)加样回收率的考察吸取5mL样品待测液5份，分别加入0. 5,0. 75、I. 00、I. 25、I. 5mL的I. Omg mr1甘草酸纯品，摇匀，各取0. 25mL，进行预处理，以0. 25mL 6. Omg -m^1香草醛水溶液和2. OmL75% (v/v)硫酸为显色剂,在75°C进行显色反应25min,在535nm处进行吸光度测定,通过标准曲线得到甘草酸含量，对能检测到的甘草酸纯品进行回收率考察，得到平均回收率，结果显不样品中甘草酸加样回收率90. 10 101. 54%之间,相对标准偏差(RSD)小于5*%。(4)甘草酸粗品中甘草酸含量的测定取提取完糖类后的甘草浸膏5g，加入IOOml水，25°C磁力搅拌溶解，缓慢滴加50%硫酸，至溶液的PH = 2，静置，抽滤得到沉淀，用PH = 2的酸水进行冲洗，沉淀在50°C烘干，取烘干的沉淀(0.9753g)，进行两相系统分离(乙醇K2HPO4 水=548g 137g 365g)，25°C磁力搅拌溶解，静置24h，取上层清液，滴加50%乙醇至不再有沉淀析出，抽滤，无水乙醇冲洗，将沉淀烘干，得到甘草酸粗品(0. 7297g)，取干燥后的甘草酸粗品0. 2319g，溶于IOOmL 25%乙醇溶液，分别取0. 25mL置于80°C水浴中加热lh，待其冷却至室温，加入
0.25mL 6. Omg* mL-1香草醛水溶液，置于冰水中加入2. OmL 75% (v/v)硫酸，取出，待其恢复室温，在75°C水浴中进行显色反应25min，在535nm处进行吸光度测定，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显示甘草酸粗品平行样中甘草酸纯度分别为6. 93%,6. 82%,7. 00%，平均值为6.91%。实施例2(I)甘草酸标准溶液的配制用量筒取62. 5mL无水乙醇于250mL容量瓶中，加去离子水定容配制成10% (v/v)乙醇溶液。称取0. 0250g甘草酸溶于上述10%乙醇25mL中，微热溶解，配制成I. Omg -mr1的甘草酸标准溶液。称取0. 0250g甘草浸膏溶于上述10%乙醇25mL中，微热溶解，配制成
1.Omg mL—1的甘草浸膏样品溶液。(2)甘草酸标准溶液的预处理分别取待测液0. 25mL，置于78°C水浴中，加热I. 5h，将乙醇挥发。(3)方法学考察I)显色稳定性的考察以甘草酸标准品溶液，以0. 25mL 5. Omg mL—1香草醛水溶液和I. 75mL70% (v/v)硫酸为显色剂，在70°C进行显色反应30min，在530nm处，设置紫外分光光度计在Ih内每隔一分钟测定一次显色后溶液的吸光度，结果显不RSD小于1% (n =60) ；2)标准曲线的制备分别配制0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. Omg mr1的甘草酸标准品溶液，各取0. 25mL，进行预处理，以0. 25mL 5. Omg mr1香草醛水溶液和I. 75mL 70% (v/v)硫酸为显色剂，在70°C进行显色反应30min，在530nm处测定吸光度，以吸光度A为横坐标，甘草酸浓度c为纵坐标，绘制标准曲线。甘草酸标准曲线线性回归方程C = 0. 1518A-0. 0079，R2 =0. 9998，在0. 0200 0. IOOOmg mL—1范围内，线性相关性较好。3)精密度的测定吸取预处理后样品待测液8份，以0. 25mL 5. Omg mL—1香草醛水溶液和I. 75mL 70% (v/v)硫酸为显色剂，在70°C进行显色反应30min，在530nm处测定吸光度，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显不甘草浸膏中甘草酸含量为0. 3130mg ml/1, RSD小于3% ；4)加样回收率的考察吸取5mL样品待测液5份，分别加入0. 5,0. 75,1. 00,1. 25,1. 5mL的I. Omg mL—1甘草酸纯品，摇匀，各取0. 25mL，进行预处理，以0. 25mL 5. Omg mL—1香草醛水溶液和I. 75mL70% (v/v)硫酸为显色剂，在70°C进行显色反应30min，在530nm处测定吸光度，通过标准曲线得到甘草酸含量，对能检测到的甘草酸纯品进行回收率考察，得到平均回收率，结果显不样品中甘草酸加样回收率95. 10 100. 54%之间,相对标准偏差(RSD)小于4*%。
(4)甘草酸粗品中甘草酸含量的测定取提取完糖类后的甘草浸膏5g，加入IOOml水，25°C磁力搅拌溶解，缓慢滴加50%硫酸，至溶液的PH = 2，静置，抽滤得到沉淀，用PH = 2的酸水进行冲洗，沉淀在50°C烘干，取烘干的沉淀(0.9753g)，进行两相系统分离(乙醇K2HPO4 水=548g 137g 365g)，25°C磁力搅拌溶解，静置24h，取上层清液，滴加50%乙醇至不再有沉淀析出，抽滤，无水乙醇冲洗，将沉淀烘干，得到甘草酸粗品(0. 7297g)，取干燥后的甘草酸粗品0. 2319g，溶于IOOmL 25%乙醇溶液，分别取0. 25mL置于80°C水浴中加热lh，待其冷却至室温，加入
0.25mL 5. Omg -m^1香草醛水溶液，置于冰水中加入I. 75mL 70% (v/v)硫酸，取出，待其恢复室温，在70°C水浴中进行显色反应30min，在530nm处测定吸光度，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显示甘草酸粗品平行样中甘草酸纯度分别为6. 92%,6.91%,6. 95%，平均值为 6. 93%。实施例3(I)甘草酸标准溶液的配制用量筒取62. 5mL无水乙醇于250mL容量瓶中，加去离子水定容配制成30% (v/v)乙醇溶液。称取0. 0250g甘草酸溶于上述30%乙醇25mL中，微热溶解，配制成I. Omg -mr1的甘草酸标准溶液。称取0. 0250g甘草浸膏溶于上述30%乙醇25mL中，微热溶解，配制成
1.Omg mL—1的甘草浸膏样品溶液。(2)甘草酸标准溶液的预处理分别取待测液0. 25mL，置于82°C水浴中，加热I. 2h，将乙醇挥发。(3)方法学考察I)显色稳定性的考察以甘草酸标准品溶液，以0. 25mL 7. Omg mL—1香草醛水溶液和2. 25mL80% (v/v)硫酸为显色剂，在80°C进行显色反应20min，在540nm处，设置紫外分光光度计在Ih内每隔一分钟测定一次显色后溶液的吸光度，结果显不RSD小于3% (n =60) ；2)标准曲线的制备分别配制0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. Omg mr1的甘草酸标准品溶液，各取0. 25mL，进行预处理，以0. 25mL 7. Omg mr1香草醛水溶液和2. 25mL 80% (v/v)硫酸为显色剂，在80°C进行显色反应20min，在540nm处测定吸光度，以吸光度A为横坐标，甘草酸浓度c为纵坐标，绘制标准曲线。甘草酸标准曲线线性回归方程C = 0. 1515A-0. 0077，R2=0. 9993，在0. 0200 0. IOOOmg mL—1范围内，线性相关性较好。3)精密度的测定吸取预处理后样品待测液8份，以0. 25mL 7. Omg mL—1香草醛水溶液和2. 25mL 80% (v/v)硫酸为显色剂，在80°C进行显色反应20min，在540nm处测定吸光度，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显不甘草浸膏中甘草酸含量为0. 3139mg ml/1, RSD小于3% ；4)加样回收率的考察吸取5mL样品待测液5份，分别加入0. 5,0. 75,1. 00,1. 25,1. 5mL的I. Omg mL—1甘草酸纯品，摇匀，各取0. 25mL,进行预处理，以0. 25mL 7. Omg mL—1香草醛水溶液和2. 25mL80% (v/v)硫酸为显色剂，在80°C进行显色反应20min，在540nm处测定吸光度，通过标准曲线得到甘草酸含量，对能检测到的甘草酸纯品进行回收率考察，得到平均回收率，结果显示样品中甘草酸加样回收率96. 65 100. 03%之间，相对标准偏差(RSD)小于3%。
(4)甘草酸粗品中甘草酸含量的测定
取提取完糖类后的甘草浸膏5g，加入IOOml水，25°C磁力搅拌溶解，缓慢滴加50%硫酸，至溶液的PH = 2，静置，抽滤得到沉淀，用PH = 2的酸水进行冲洗，沉淀在50°C烘干，取烘干的沉淀(0.9753g)，进行两相系统分离(乙醇K2HPO4 水=548g 137g 365g)，25°C磁力搅拌溶解，静置24h，取上层清液，滴加50%乙醇至不再有沉淀析出，抽滤，无水乙醇冲洗，将沉淀烘干，得到甘草酸粗品(0. 7297g)，取干燥后的甘草酸粗品0. 2319g，溶于IOOmL 25%乙醇溶液，分别取0. 25mL置于80°C水浴中加热lh，待其冷却至室温，加入0. 25mL 7. Omg-mr1香草醛水溶液，置于冰水中加入2. 25mL 80% (v/v)硫酸，取出，待其恢复室温，在80°C水浴中进行显色反应20min，在540nm处测定吸光度，按标准曲线计算甘草酸含量，结果显示甘草酸粗品平行样中甘草酸纯度分别为6. 87%,6. 85%,6. 94%，平均值为 6. 89%。
权利要求
1.香草醛-硫酸测定甘草提取多糖后浸膏中甘草酸含量的方法，其特征是步骤如下 (1)甘草酸标准溶液和样品待测溶液的配制 用无水乙醇加去离子水配制成10 30%的乙醇溶液,称取0. 0250g甘草酸溶于10 30%的乙醇中，配制成I. Omg mL-1的甘草酸标准溶液；称取0. 0250g干燥后的甘草浸膏溶于10 30%的乙醇中，同样配制成I. Omg mL—1的样品待测溶液； (2)标准溶液和样品待测溶液的预处理 (3)吸光度的测定 向处理后的溶液，加入0. 25mL 5. 0 7. Omg ml/1香草醒水溶液和I. 75 2. 25mL70 80%硫酸，放入70 80°C的水浴中加热20 30min，以0. 25mL蒸馏水代替试样液为空白对照，在波长530 540nm，以Icm石英比色皿，用紫外可见分光光度计进行吸光度测定。
2.如权利要求I所述的方法，其特征是所用样品为甘草提取多糖后浸膏，其不含有蛋白质、淀粉等糖类物质。
3.如权利要求I所述的方法，其特征是所述的步骤(2)预处理方法是取待测液0.25mL，置于78 82°C水浴中，加热I I. 5h，将溶液中所含乙醇挥发。
4.如权利要求I所述的方法，其特征是所述的步骤(3)中，吸光度测定用显色剂为香草醛-硫酸，测定波长为530 540nm。
全文摘要
本发明涉及一种香草醛-硫酸测定甘草提取多糖后浸膏中甘草酸含量的方法；该方法采用(1)甘草酸标准溶液和样品待测溶液的配制；(2)标准溶液和样品待测溶液的预处理；(3)吸光度的测定；本发明首先在于根据甘草浸膏中不含糖类的特性，选择10～30％乙醇(v/v)溶液作为溶剂，在溶液显色前对其进行了排除乙醇干扰的预处理步骤，以香草醛-硫酸作为显色剂，由于该法在本发明中不受糖类干扰，灵敏度可以得到进一步的提高，且只使用一种显色溶剂，操作更加简便。溶液经过预处理后，以香草醛-硫酸为显色剂在考察得到的最佳的显色条件下显色，稳定性好、精密度及加样回收率高，可以较好的用于对甘草提取完多糖后浸膏中提取和分离甘草酸后甘草酸含量的变化趋势的检测。
文档编号G01N21/31GK102621089SQ201210098258
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者刘明言, 张慧慧 申请人:天津大学