专利名称：检测杀虫晶体蛋白Bt Cry1Ab/Ac的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测杀虫晶体蛋白Bt CrylAb/Ac的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)杀虫晶体蛋白基因抗虫基因在棉花和玉米等作物上得到了很成功的应用。根据编码基因序列的同源性和编码蛋白的杀虫谱，Bt杀虫晶体蛋白划分为cry族和cryt族，每一类下又分为数量不等的亚类。目前在植物中表达的 Bt 基因有 Bt cry IAa, cry IAb, crylAc, cry2Aa, cry3Bb, cry9c0 Bt Cry I Ab/ Ac蛋白具有非常高的相似度，目前市场上商业化的作物中的转BtCrylAc蛋白基因已包含 Bt CrylAb蛋白基因。Bt免疫检测试剂盒已广泛应用于转基因抗虫棉花、玉米种子质量检测、真伪鉴定， 食品中转基因成分分析及生物安全性的研究。Bt CrylAb/Ac试剂盒的好坏完全取决于所制备抗体的好坏。国内外文献报道中的CrylA抗体，均通过苏云金芽孢杆菌发酵、提取、纯化得到的蛋白作为抗原免疫动物制备的。由于Bt CrylAb/Ac蛋白在植物和动物中的翻译后修饰不同，往往导致利用菌株表达的蛋白对植物中的Bt CrylAb/Ac识别率和亲和力较低。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测杀虫晶体蛋白Bt CrylAb/Ac的方法及其专用酶联免疫试剂盒，该方法及其专用试剂盒所使用的抗Bt CrylAb/Ac的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Bt2F9分泌产生的，该杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5162。上述杂交瘤细胞株Bt2F9CGMCC No. 5162分泌产生的抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体，也是本发明保护的范围。上述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体可用于检测或辅助检测Bt CrylAb/Ac蛋白，尤其适合于检测或辅助检测转基因植物中的Bt CrylAb/Ac蛋白。本发明所提供的杂交瘤细胞株Bt2F9或抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的单克隆抗体可用于制备检测或辅助检测Bt CrylAb/Ac蛋白的试剂或试剂盒，特别是用于制备检测或辅助检测转基因植物中Bt Cry lAb/Ac蛋白的试剂或试剂盒。本发明所提供的酶联免疫试剂盒可用于检测或辅助检测Bt Cry lAb/Ac蛋白，所述试剂盒中含有独立包装的所述单克隆抗体。在本发明所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗体和/或独立包装的Bt CrylAb/Ac蛋白标准品和/或独立包装的用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗体是以Bt Cry lAb/Ac蛋白为免疫原免疫脊
3椎动物得到的；所述Bt CrylAb/Ac蛋白标准品可为Bt CrylAb/Ac蛋白或由所述BtCrylAb/ Ac蛋白配制成的一系列不同浓度的Bt Cry lAb/Ac蛋白溶液；所述一系列不同浓度的Bt Cry lAb/Ac 蛋白溶液的浓度具体可为50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. lng/ mL、l. 56ng/mL和0. 78ng/mL,所述Bt Cry lAb/Ac蛋白溶液的溶剂具体可为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04和NaCl，pH值为7. 5 ;溶质Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M。在本发明所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的包被缓冲液和/或独立包装的洗涤液和/或独立包装的底物缓冲液和/或独立包装的终止缓冲液和/或独立包装的封闭液；所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3 ;溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 04M ;所述包被缓冲液的pH值为9. 6 ;所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2PO4, NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M，所述吐温-20在所述洗涤液中的体积百分含量为O. 1% ;所述洗涤液的pH值为7. 5 ;所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4 ;溶质柠檬酸三钠和 Na2HPO4在所述底物缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 03M ;所述底物缓冲液的pH值为
5.5 ；所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2PO4, NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在所述封闭液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;所述脱脂牛奶在所述封闭液中的质量百分含量为3% ;所述封闭液的pH值为7. 5 ；所述标记酶具体可为辣根过氧化物酶。本发明所提供的方法为一种鉴别或辅助鉴别转Bt CrylAb/Ac基因植物的方法，包括如下步骤用本发明所提供的上述试剂盒对待测植物进行检测，以与所述待测植物同种的非转基因植物为对照，若所述待测植物的吸光值大于所述对照的3倍，则所述待测植物为或候选为转Bt CrylAb/Ac基因植物，若所述待测植物的吸光值小于或等于所述对照的3 倍，则所述待测植物为或候选为非转Bt Cry lAb/Ac基因植物；所述待测植物在进行所述检测前，还经过包括如下步骤的处理将所述待测植物的叶片研磨，用所述PBS缓冲液于4°C提取12小时，8000r/min 4°C离心取上清，获得所述待测植物的提取液。本发明所提供的试剂盒可用于定量检测Bt Cry lAb/Ac蛋白，尤其适合于定量检测转基因植物中的Bt CrylAb/Ac蛋白。本发明所提供的抗Bt CrylAb/Ac的单克隆抗体是同时以Bt CrylAc蛋白溶液和转Bt CrylAc基因棉花植株叶片的提取液为包被抗原，通过间接非竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的、对在植物中表达的Bt Cry lAb/Ac蛋白具有高亲和力的抗体，亲和常数为Losxio9M-1 ;利用该单克隆抗体制备得到的双抗夹心酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测棉花、玉米等转基因植物中的Bt Cry lAb/Ac蛋白，线性检测范围在O. 78 50ng/ mL,具有快速、灵敏的优点。


图I为酶联免疫试剂盒检测Bt Cry lAb/Ac蛋白浓度的标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。棉花品种SGK321 :棉花品种石远321导入外源BT+CPTI双价抗虫基因，河北神农高科技股份有限公司。棉花品种石远321 :河北神农高科技股份有限公司。弗氏完全佐剂=Sigma公司，产品目录编号为F5881。弗氏不完全佐剂=Sigma公司，产品目录编号为F5506。Bt CrylAc蛋白上海佑隆生物科技有限公司，产品目录编号为C010301。Bt CrylAc蛋白溶液将Bt CrylAc蛋白溶于包被缓冲液后得到的溶液。Bt CrylAc蛋白标准品溶液将Bt CrylAc蛋白溶于PBS缓冲液后得到的溶液。包被缓冲液溶剂为水，溶质为Na2COdPNaHCO3, pH值为9. 6 ;溶质Na2COjP NaHCO3 在包被缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 04M。洗涤液溶剂为水，溶质为Na2HPO4' KH2PO4' NaCl和吐温-20，pH值为7. 5 ;溶质 Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在洗涤液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;吐温-20在洗涤液中的体积百分含量为O. 1%。底物缓冲液溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4, pH值为5. 5 ;溶质柠檬酸三钠和Na2HPO4在底物缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 03M。终止缓冲液浓度为2M的硫酸水溶液。封闭液溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2PO4, NaCl和脱脂牛奶，pH值为7. 5 ;溶质 Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在封闭液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M，脱脂牛奶在封
闭液中的质量百分含量为3%。PBS缓冲液溶剂为水，溶质为Na2HPO4、KH2PO4和NaCl，pH值为7. 5 ;溶质Na2HP04、 KH2PO4和NaCl在PBS缓冲液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M。实施例I、杂交瘤细胞株的获得及抗Bt CrylAb/Ac蛋白单克隆抗体的制备Balb/C小白鼠购自军事医学科学院实验动物中心。SP2/0骨髓瘤细胞购自中国兽医药品监察所。一、动物免疫I、以8-10周龄的Bal b/C小白鼠作为实验动物。2、基础免疫将lmg/mL的Bt CrylAc蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小白鼠，注射剂量为每只小鼠注射O. Img BtCrylAc蛋白。3、加强免疫基础免疫2周后，取ImL lmg/mL的Bt CrylAc蛋白溶液，加入ImL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射O. ImgBt CrylAc蛋白。二、细胞融合和克隆化
加强免疫每隔10天一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，效价的定义为OD值为I时的血清稀释倍数。待效价大于I : 8000 后，选择血清效价最佳的小鼠(效价为I : 80000)，取脾细胞，按9 1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接非竞争ELISA的方法分别以Bt CrylAc蛋白溶液和转Bt CrylAc基因棉花植株叶片的提取液为包被抗原同时筛选分泌抗体效价高的单克隆细胞株，选择既能识别Bt CrylAc蛋白溶液中的Bt CrylAc蛋白，又能识别转Bt CrylAc基因棉花植株叶片提取液中的Bt CrylAc 蛋白的单克隆抗体，最后筛选得到稳定分泌抗转基因植物中BtCrylAb/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，命名为Bt2F9，该杂交瘤细胞株已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5162。上述间接非竞争ELISA方法的步骤具体如下I)包被在96孔酶标板中加入100 μ L 50ng/mL的Bt CrylAc蛋白溶液，以转Bt CrylAc基因的棉花SGK321的叶片提取液为对照，37°C包被3小时，用PBS缓冲液洗涤4次。叶片提取液的制备方法将叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4°C提取12小时， 8000r/min 4°C离心取上清，得到提取液，提取液中的Bt CrylAc抗原浓度为50ng/ml。2)封闭封闭液150 μ L/孔，在37°C湿盒中封闭lh，弃封闭液，洗涤3次。3)加抗体将不同稀释倍数的增量培养法得到的单抗加至酶标板中，置湿盒中 37°C条件下30min,洗板4次。4)加酶标二抗将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (购自Jackson公司，商品目录号为 79556) (O. lmg/mL)稀释1000倍，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C条件下30min，洗板4次。5)显色取20mg邻苯二胺(OPD)溶于IOmL底物稀释液中，加4μ L 30% H2O2，将底物溶液加入酶标板中，每孔100 μ L。避光显色5min。6)终止每孔加入50 μ L终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值，部分结果见表I。表I中，Al、A2、……和F4分别代表筛选过程中加入的细胞培养板不同孔中的杂交瘤细胞，识别率(％ )=(以转Bt CrylAc基因的棉花SGK321的叶片提取液为包被抗原的OD值/以50ng/mL的Bt CrylAc蛋白溶液为包被抗原的OD值)X 100%。表I.间接非竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞的结果
权利要求
1.杂交瘤细胞株Bt2F9，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No. 5162。
2.抗BtCrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体,其特征在于所述单克隆抗体是由权利要求I 所述的杂交瘤细胞株Bt2F9分泌产生的。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测BtCry lAb/Ac蛋白中的应用。
4.权利要求I所述的杂交瘤细胞株Bt2F9或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测Bt Cry lAb/Ac蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
5.—种检测或辅助检测Bt Cry lAb/Ac蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的权利要求2所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有独立包装的抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗体和/或独立包装的Bt Cry lAb/Ac蛋白标准品和/或独立包装的用于标记权利要求2所述单克隆抗体的标记酶；所述抗Bt Cry lAb/Ac蛋白的多克隆抗体是以Bt Cry lAb/Ac蛋白为免疫原免疫脊椎动物得到的。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有独立包装的包被缓冲液和/或独立包装的洗涤液和/或独立包装的底物缓冲液和/或独立包装的终止缓冲液和/或独立包装的封闭液；所述包被缓冲液的溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3 ;溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 04M ；所述洗涤液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐温-20 ;溶质Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M，所述吐温-20在所述洗涤液中的体积百分含量为O. 1% ;所述底物缓冲液的溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4 ;溶质柠檬酸三钠和Na2HPO4 在所述底物缓冲液中的浓度分别为O. OlM和O. 03M ；所述终止缓冲液为2M的硫酸水溶液；所述封闭液的溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和脱脂牛奶；溶质Na2HPO4、KH2PO4 和NaCl在所述封闭液中的浓度分别为O. 02M、0. 0015M和O. 14M ;所述脱脂牛奶在所述封闭液中的质量百分含量为3% ；所述标记酶为辣根过氧化物酶。
8.一种鉴别或辅助鉴别转Bt Cry lAb/Ac基因植物的方法，包括如下步骤用权利要求5-7中任一所述试剂盒对待测植物进行检测，以与所述待测植物同种的非转基因植物为对照，若所述待测植物的吸光值大于所述对照的3倍，则所述待测植物为或候选为转Bt Cry lAb/Ac基因植物，若所述待测植物的吸光值小于或等于所述对照的3倍，则所述待测植物为或候选为非转Bt Cry lAb/Ac基因植物。
9.权利要求5-7中任一所述试剂盒在定量检测BtCry lAb/Ac蛋白含量中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测杀虫晶体蛋白Bt Cry1Ab/Ac的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该方法及试剂盒所使用的抗Bt Cry1Ab/Ac的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Bt2F9分泌产生的，该杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5162。本发明所提供单克隆抗体是同时以Bt Cry1Ac蛋白溶液和转Bt Cry1Ac基因棉花植株叶片的提取液为包被抗原，通过间接非竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的、对在植物中表达的Bt Cry1Ab/Ac蛋白具有高亲和力的抗体，亲和常数为1.03×109M-1；利用该单克隆抗体制备得到的双抗夹心酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测棉花、玉米等转基因植物中的Bt Cry1Ab/Ac蛋白，线性检测范围在0.78～50ng/mL，具有快速、灵敏的优点。
文档编号G01N33/68GK102590527SQ201210012498
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者何丽珊, 南铁贵, 孙硕, 张亮, 曹振, 李召虎, 王保民, 谭桂玉 申请人:中国农业大学