专利名称：神经调节素1及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医药领域，更具体地，本发明涉及神经调节素I及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途。
背景技术：
癫痫病是大脑神经 元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性、破坏性神经系统疾病，颞叶癫痫是其最常见的一种，由于异常放电神经元所涉及的部位不同，可表现为发作的运动、感觉、植物神经、意识及精神障碍。癫痫病(Epikpsy)是一种危及人类健康的常见疾病，其发病率约占世界各地的约1_2%，目前本领域中对其还缺乏有效的治疗手段(McNamara, J.0., Huang, Y.Z.& Leonard, A.S.Molecular signaling mechanismsunderlying epileptogenesis.Sci STKE 2006,2006:12 ;Morimoto，K.，Fahnestock，M.&Racine，R.J.Kindling and status epilepticus models of epilepsy:rewiring thebrain.Prog Neurobiol2004, 73:1-60)。在癫痫发病过程中，异常电活动可以触发一系列信号级联反应，诱导神经多肽和神经营养因子的表达。过去的几十年中许多研究就这些营养因子的活性表达是否癫痫有干预作用进行了大量的观察和研究。一些促进癫痫的产生的因子如脑源性生长因子(Brainderived neurotrophic factor, BDNF)被鉴定出来,但是那些在这个过程中起着对体内稳态的反向制衡作用的生长因子却鲜为人知。更重要的是，目前已经鉴定出来的那些营养因子如BDNF和神经肽Y都对体内本底状态(而不仅仅是癫痫活动状态)的神经元兴奋性和突触传递产生着重要的作用。针对这些靶点的药物或干预操作势必带着很严重甚至是致命性的副作用，从而限制了其在癫痫病中的实践应用。综上，尽管目前已知一些癫痫在遗传学和流行病学上的病因，本领域人员除了外科切除手术以外仍然没有找到理想的抗癫痫靶点和有效的药物。因此，本领域迫切需要从癫痫发病机制出发，研究找到抗癫痫靶点以及药物。

发明内容
本发明的目的在于提供一种神经调节素I (NRGl)或其上调剂的用途。本发明的另一目的在于提供一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)磷酸化促进剂的用途。本发明的另一目的在于提供一种基于NRG1、ErbB4及其相互作用来筛选药物的方法。在本发明的第一方面，提供一种神经调节素I(NRGl)或其上调剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。在一个优选例中，所述的神经调节素I通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4 (ErbB4)相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，预防、改善或治疗癫痫。在另一优选例中，所述的神经调节素I的上调剂包括:神经调节素I的功能片段；重组表达神经调节素I或其功能片段的质粒。在另一优选例中，所述的功能片段含NRGl的EGF功能区。在另一优选例中，所述的功能片段是如GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位(含NRGl的EGF功能区)的多肽或该多肽的变异体或衍生物。在另一优选例中，所 述的神经调节素I选自:氨基酸序列如GenBank登录号NM_013956.3或其中第176-246位(含NRGl的EGF功能区)的多肽或该多肽的变异体或衍生物。更佳地，所述的变异体或衍生物选自JfGenBank NM_013956.3或其中第176-246位(含NRGl的EGF功能区)所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1_20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有GenBank登录号NM_013956.3的多肽功能的多肽；或与GenBank登录号NM_013956.3或其中第176-246位(含NRGl的EGF功能区)所示氨基酸序列的多肽的序列相同性高于70%，且具有GenBank登录号NM_013956.3多肽功能的多肽。在另一优选例中，所述的上调剂包括(但不限于):激动剂、激活剂、促进剂。在另一优选例中，所述的神经调节素I通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4 (ErbB4)相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，调控(较佳地，为激活)下游的PI3K-Akt-S6K通路和/或促进AKT蛋白的磷酸化水平，从而预防、改善或治疗癫痫。在另一优选例中，所述的组合物用于:延缓癫痫的形成；和/或抑制癫痫持续状态；和/或提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化的水平；和/或减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或抑制苔藓纤维发芽；和/或调控(较佳地，为激活)下游的PI3K-Akt_S6K通路；和/或促进AKT蛋白的磷酸化水平。在本发明的另一方面，提供一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)磷酸化促进剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。在一个优选例中，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化促进剂选自(但不限于):鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化激酶区域激活剂。在另一优选例中，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体选自(但不限于):神经调节素I。在另一优选例中，所述的组合物用于:延缓癫痫的形成；和/或抑制癫痫持续状态；和/或减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或抑制苔藓纤维发芽。
在本发明的另一方面，提供一种神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的用途，用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质的方法，包括以下步骤:(a)将候选物质与表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系接触；(b)检测神经调节素I的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高(如提高20%以上；更佳地提高40%以上；更佳地提高60%以上)神经调节素I的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或检测鸟类血红细胞 白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高(如提高20%以上；更佳地提高40%以上；更佳地提高60%以上)鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在一个优选例中，步骤(a)包括:在测试组中，在表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测神经调节素I的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中Neuregulinl的表达或活性在统计学上高于(如提高20%以上；更佳地提高40%以上；更佳地提高60%以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，步骤(a)包括:在测试组中，在表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平在统计学上闻于(如提闻20%以上；更佳地提闻40%以上；更佳地提闻60%以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，通过分析鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的受体酪氨酸激酶活性确定鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平。在另一优选例中，步骤(a)中，所述的体系表达神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4，两者发生相互作用；步骤(b)中，检测神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进(如促进20%以上；更佳地促进40%以上；更佳地促进60%以上)神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，步骤(a)包括:在测试组中，在表达神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中添加候选物质；在步骤(b)中，检测神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、表达神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系；若测试组中检测神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用在统计学上被促进(如促进20%以上；更佳地促进40%以上；更佳地促进60%以上)对照组，就表明该候选物质是抗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，步骤(b)中，所述的检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平包括:检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4氨基酸序列中第1056位(相应于GenBank登录号NM_005235.2的氨基酸序列的第1056位)的酪氨酸的磷酸化水平，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高(如提高20%以上；更佳地提高40%以上；更佳地提高60%以上)，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，所述 的表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中还包括AKT信号通路(较佳地为PI3K-Akt-S6K信号通路)；步骤(b)中，所述方法还包括:检测AKT信号通路的激活状况或检测AKT蛋白的磷酸化水平，若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高(如提高20%以上；更佳地提高40%以上；更佳地提高60%以上)，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在另一优选例中，所述体系选自:溶液体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。较佳地，所述的体系是细胞体系；更佳地所述的细胞体系是神经元细胞；更佳地所述的神经元细胞选自:PV阳性中间神经元细胞；海马神经元细胞；大脑皮层细胞。在另一优选例中，所述的动物体系为癫痫动物模型。较佳地，所述的动物体系选自(但不限于):电刺激点燃癫痫动物模型，或匹罗卡品癫痫动物模型。在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于):针对所述神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4设计的小分子化合物、重组表达载体。在本发明的另一方面，提供采用所述筛选方法获得的抗癫痫的潜在物质。在本发明的另一方面，提供一种神经调节素I的用途，用于制备检测癫痫的试剂。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别神经调节素I或其编码基因的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。较佳的，所述的特异性识别神经调节素I或其编码基因的试剂选自:特异性扩增神经调节素I编码基因的引物；特异性识别神经调节素I编码基因的探针；或特异性结合神经调节素I的抗体或配体。在本发明的另一方面，提供一种检测癫痫的试剂盒，所述的试剂盒中含有:特异性识别神经调节素I或其编码基因的试剂。在本发明的另一方面，提供一种特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。在一个优选例中，所述的特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂是识别磷酸化的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的抗体。在本发明的另一方面，提供一种检测癫痫的试剂盒，所述的试剂盒中含有:特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、癫痫发作活动诱导上调大鼠脑内Nrgl基因的表达和ErbB4受体的激活。(a)癫痫活动后大鼠海马组织内Nrgl mRNA水平的分析结果。左侧(Stim)，电刺激点燃癫痫模型及对照(未电刺激，Unstim)的结果；右侧(Pilo)，匹罗卡品癫痫模型及对照(匹罗卡品模型，给予溶液对照(Vehicle))。上半部分:RT-PCR实验的结果；下半部分:Real-time PCR实验 的结果。Nrgl mRNA的水平被标准化为Gapdh mRNA表达水平的相对倍数。(b)癫痫发作上调脑内的NRGl蛋白表达水平。提取的海马组织匀浆用针对NRGl的ELISA试剂盒进行检测。每个时间点的NRGl平均水平以未刺激组(大鼠点燃模型)或溶剂对照组(匹罗卡品模型)作为对照进行标准化。(c)大鼠冠状脑片上的Nrgl mRNA原位杂交结果。英文缩略词:Ctx，皮层；Hip，海马；Tha,丘脑；Amyg,杏仁核；Pir,梨状皮层。标尺dOOOiim。(d)Western免疫印迹结果显示癫痫活动后大鼠海马内ErbB4表达及其磷酸化的水平的变化情况。左侧，电刺激点燃模型；右侧，匹罗卡品模型。以GAPDH表达水平为参照。(e)对Western免疫印迹结果的相对定量分析。*P < 0.05,林P < 0.01 和林*P < 0.01 ；one-way ANOVA with post hoc Dunnett，s
test o图2、不同的剪切体形式的大鼠NrglmRNA的水平均在癫痫发作后上调。用RT-PCR(a和b)和荧光定量PCR(c和d)分别证明了电刺激点燃模型(a和c)和匹罗卡品模型(b和d)大鼠海马组织内Nrgl-typel、II和III等型mRNA水平受癫痫发作活动调控的时间依赖性变化。*P < 0.05, **P < 0.01 和 ***P < 0.001, one-way ANOVA with posthoc Dunnett’ s test。图3、小鼠脑内的颞叶癫痫发作也上调NRGl_ErbB4信号系统的活性。(a) RT-PCR结果显示NrglmRNA及其不同剪切体的水平在癫痫发作后上调。左侧:点燃模型；右侧:匹罗卡品模型。(b) Real-time PCR 实验的分析结果。(c)对小鼠癫痫模型海马内ErbB4和p_ErbB4的Western免疫印迹分析结果。左侦h点燃模型。右侧:匹罗卡品模型。上图:代表性的免疫印迹。中图和下图:统计分析的结果。*P < 0.05 和 #P < 0.01 ；one-way ANOVA。图4、NRGU ecto-ErbB4和PD158780对DIV14大鼠体外培养神经元的ErbB4磷酸化状态的不同影响。(a)NRGl以剂量依赖的方式激活ErbB4磷酸化。对海马神经元以NRGl处理IOmin后裂解进行Western免疫印迹实验。(b) ecto-ErbB4可以阻断外源性NRGl对ErbB4磷酸化的激活作用。给予神经元ecto-ErbB4处理IOmin后再给予NRGl (终浓度IOnM)处理IOmin后提取细胞总蛋白。(c)NRGl对ErbB4的激活作用可以被HH58780阻断。以GAPDH作为上样对照蛋白。图5、脑内注射NRGl、ecto_ErbB4和HH58780对正常大鼠和癫痫模型大鼠脑内ErbB4磷酸化水平的不同影响。
(a)脑内注射NRGl重组蛋白(10 y M，5 y L，1.c.v)在正常动物和癫痫发作之后都可以显著脑内ErbB4磷酸化的水平。(b)脑内注射ecto_ErbB4(l ug/uL, 1.c.v.)可以有效阻断内源性的NRGl从而阻止其激活ErbB4的磷酸化。(c)脑内 注射抑制剂^)158780 (2mM, 1.c.v.)可以显著抑制ErbB4的磷酸化。给予PD158780后，癫痫发作也不能明显上调ErbB4磷酸化水平。以上实验中，脑内注射30分钟后，动物处死取脑，裂解海马组织提取总蛋白。GAPDH为上样参照。图6、改变NRGl_ErbB4信号系统的活性对电刺激点燃模型癫痫发生的影响。(a)实验流程示意图。(b)脑内注射外源性NRGl重组蛋白(10 PM, 5 uL, 1.e.v.；n = 7)对大鼠点燃进程的影响。中左:行为学发作级别的进展冲右:诱发的脑电图放电发作持续时间(ESD);最右:达到第一次I级、3级和完全点燃状态所需要的刺激次数。以注射溶剂(n = 9)和变性失活的NRGl蛋白(n = 5)的大鼠作为对照。(c 和 d)分别脑内注射 ecto_ErbB4(c ;1 ii g/ii L, 1.c.V.；n = 6)以阻断内源性NRGl的活性、或PD158780(d ；2mM, 1.c.v.；n = 11)以抑制ErbB受体磷酸化活性对点燃进程的影响。n = 8(c)或n = 7(d),溶剂处理对照组；n = 6,变性失活的ecto_ErbB4处理对照组(C)。各图中的阴影部分指代在点燃过程中注射蛋白或药物试剂的部分。电刺激的强度与阈值电刺激的强度一致，刺激次数指的是能诱发出3秒或以上的脑电图放电发作的有效刺激的次数。完全点燃状态定义为连续3次出现行为学5级发作。(e)诱发第一次5级行为学癫痫发作时的各组大鼠的代表性脑电图。黑色箭头指示电刺激，白色箭头指示电刺激后脑电图上的短暂不应期，截短箭头指示的是脑电图放电发作的终止。*P < 0.05，林P < 0.01 和 _P < 0.001，与溶剂组处理相比；。P < 0.05 和 mP < 0.01 与变性失活的 NRGl 或 ecto_ErbB4 处理组相比；one-way ANOVA with post hocBonferrom’ s test。图7、脑内注射NRGl对大鼠匹罗卡品模型癫痫发作的影响。(a) NRGl (10 PM, 5 UL)注射30分钟后匹罗卡品给药引起第I次5级行为学癫痫发作所需要的时间。(b)两组大鼠在匹罗卡品给药40分钟时的癫痫发作强度比较。每个数据点代表一例动物。*P < 0.05和林P < 0.01 ;双侧t检验。图8、在脑内敲除ErbB4基因导致电刺激点燃诱导的癫痫发生明显增快。(a)心脏重表达的ErbB4基因敲除小鼠的鉴定。鼠尾基因组抽提鉴定显示，野生型小鼠出现一条约150bp的条带,而纯合子敲除小鼠出现约一条约320bp的条带。心脏组织重新表达的转基因条带鉴定时显示约500bp的条带。(b) Western免疫印迹实验显示，ErbB4敲除小鼠大脑的海马内检测不到ErbB4及其磷酸化的表达水平。GAPDH为上样参照蛋白。(c)ErbB4敲除鼠的纯合子-/_)、杂合子(+/-)和野生型(+/+)之间的电刺激阈值没有明显差别。P = 0.390 ；one-way AN0VA。图中每个数据点来自一只小鼠。
(d和e)纯合子(n = 4)、杂合子(n = 27)的ErbB4敲除鼠及其野生型对照小鼠(n = 30)的电刺激点 燃进程比较。d图上半部分，行为学发作级别的进展；d图下半部分，各组小鼠达到第一次I级、3级和完全点燃状态所需要的平均刺激次数；e图，电刺激所诱发的脑电图发作放电时程。统计数据代表均数土标准差。*P < 0.05，林P < 0.01 和 _P < 0.001，与野生型(ErbB4+/+)相比；one-wayANOVA with post hoc Dunnett’ s test。图9、特异性地在CaMKII a阳性的神经元中敲除ErbB4的CaMkII a -1Cre ；ErbB4+和CaMkII a -CreER ;ErbB4+两种小鼠脑内Cre重组酶和ErbB4的表达情况及其ErbB4磷酸化水平分析。(a)免疫组织化学染色显示CaMkII a -1Cre ;ErbB4+小鼠脑内Cre重组酶的表达情况。Cre免疫染色可明显见于海马和皮层。左侧:没有携带Cre转基因的ErbB4-floxed同窝对照显示Cre染色为阴性。中部:右图中框内的放大图。Scale bars:左侧与中间，100 u m ;右侧，600 u m。(b)对CaMkII a -1Cre ;ErbB4+小鼠脑片的免疫荧光染色显示Cre特异性地表达于CaMkII a阳性的神经兀中。Scale bar:25 U m0(c)Western blot 分析结果显不，CaMkII a-1Cre ;ErbB4+小鼠海马的 ErbB4 表达量明显降低，而P_ErbB4的水平变化不大。(d) CaMKII a -1Cre ;ErbB4+小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。(e) CaMkII a -CreER ；ErbB4floxed/floxed 小鼠在它莫西芬(tamoxifen ;sigma)诱导前后的特异性Cre表达情况。它莫西芬给药足够诱导Cre重组酶进入CaMkII a阳性神经元的细胞核内。Scale bar:25 U m0(f) CaMkII a -CreER ；ErbB4floxed/floxed 小鼠在它莫西芬诱导前后 ErbB4 和 p_ErbB4表达水平的western blot分析结果。上左图:兔单克隆ErbB4抗体(#1200-1);上右图:兔多克隆ErbB4抗体(sc-283)。白箭头指示为非特异性条带。(g)CaMKII a -CreER ;ErbB4+小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p-ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。图10、在CaMKII a阳性的神经元中敲除ErbB4对电刺激诱导的癫痫发生没有影响。(a)CaMkII a -1Cre ；ErbB4^小鼠和两组同窝对照小鼠的电刺激阈值比较。P =0.749，one-way AN0VA。(b和c) CaMkII a -1Cre ;ErbB4+小鼠表现出的行为学发作级别(b)和诱发出的脑电图发作放电时程(c)与对照组相比没有显著性差异。n = 14，CaMkII a -1Cre ;ErbB4+ ；n = 17，CaMkII a -1Cre ；n = 12，ErbB4_floxed。(d)各组小鼠达到第一次1、3级和完全点燃状态所需要的刺激次数比较。P>0.05，one-way ANOVA。(e)CaMkII a -CreER ;ErbB4+ 和对照小鼠的电刺激阈值比较。CaMkII a -CreER和ErbB4-f 1xed同窝小鼠合并为对照组。P = 0.542，t检验。(f和g)CaMkII a -CreER ;ErbB4+小鼠与其同窝对照在电刺激点燃过程中的癫痫发生进展情况比较。(h) CaMkII a -CreER ;ErbB4+小鼠与其对照达到特定发作级别所分别需要的电刺激次数比较。P > 0.05, t检验。图11、特异性地在PV阳性神经元中敲除了 ErbB4的PV-Cre小鼠脑内Cre重组酶和ErbB4的表达情况及ErbB4磷酸化水平分析。(a)免疫荧光染色显示Cre重组酶特异性地表达于PV阳性神经元中。Scalebars:100 u m0(b) Western免疫 印迹结果显示PV-Cre ;ErbB4+海马内的ErbB4表达水平轻微降低而其磷酸化水平降低明显。(c)PV-Cre ;ErbB4+小鼠在电刺激点燃引起的癫痫发作前后ErbB4和p_ErbB4表达水平的western免疫印迹分析。结果显示磷酸化ErbB4在癫痫后上调不明显。图12、特异性地在PV阳性的神经元中敲除ErbB4促进电刺激诱导的癫痫发生。(a) PV-Cre ；ErbB4^小鼠和两组对照小鼠的平均电刺激阈值比较。P = 0.577 ；one-way ANOVA0(b-d)与对照组相比，PV-Cre ;ErbB4+小鼠表现出明显加快的癫痫发生，具体表现在行为学发作级别的显著提高(b)、脑电图放电发作的时程大大延长(C)和达到完全点燃状态所需要的刺激次数明显减少(d)。每组n = 10。*P < 0.05，#P < 0.01和***P
<0.001，与 PV-Cre 小鼠相比；。。P < 0.01 和。。。P < 0.001，与 ErbB4_floxed 小鼠相比；one-way ANOVA with post hoc Bonferroni’ s test。(e)电刺激结束两个月后PV-Cre5ErbBfA小鼠的自发性癫痫发生率提高。*p
<0.05,与PV-Cre 小鼠相比；qP < 0.05,与ErbB4-floxed小鼠相比；continuityx2 test。(f)电刺激结束两个月后各组小鼠的典型脑电图。PV-Cre小鼠出现典型癫痫发作现象。(g)点燃的PV-Cre ；ErbB4+小鼠的自发性癫痫的频率显著高于对照组小鼠。*P < 0.05 和 ***P < 0.001，与 PV-Cre 小鼠相比；。。P < 0.01 和。。。P < 0.001，与ErbB4_floxed 小鼠相比；two_way ANOVA with post hoc Bonferroni^ s test。图13、NRGl的抗癫痫效应在PV-Cre ；ErbB4^小鼠身上消失。(a)在电刺激点燃的过程中给予脑内注射NRGl (10 iiM，2 iiL，1.e.v.)并不影响PV-Cre ^rbB^小鼠的行为学发作级别(左)、脑电图放电发作的时程变化(中)、达到首次4级癫痫发作所需的刺激次数(右)。(b)NRGl可以减缓与PV-Cre ;ErbB4_/_具有相同初始发作强度的PV-Cre小鼠的癫痫发生进程。以上图中黑色虚线指示的是开始脑内注射时的行为学发作强度。灰色虚线为开始给药时各组的刺激次数。(c和d)同等剂量的NRGl可以在行为学和脑电图上都显著性地降低CaMKII a-1Cre ；ErbB4^(c)和野生型小鼠(d)的点燃发展进程。阴影区域指示NRGl蛋白的注射。*P < 0.05 和 **P < 0.01，one-way AN0VA。图14、特异性地在PV阳性神经元中敲除ErbB4加剧电剌激诱导引起的脑高兴奋性状态。(a_c)完全点燃的 ErbB4 , (a)、PV-Cre ；ErbB4 , (b)和 CaMkII a -1Cre ；ErbB^(C)小鼠在兴奋性刺激测试下的代表性脑电图。在完全点燃的小鼠休息两周后，脑电图发作诱发自一个阈值强度的单刺激。(d)对各组小鼠的脑电图时程所进行的定量分析比较。各组小鼠的总数量标识于各图上方。林P < 0.01 和 *林P < 0.01, one-way ANOVA。图15、特异NRGl_ErbB4信号通路对电刺激点燃引起的苔藓纤维发芽的影响。(a)空白对照、溶剂对 照、NRGl处理、和158780处理组的大鼠在电刺激结束两个月后脑片Timm染色的结果比较。Timm染色阳性区域主要呈现在海马齿状回的内分子层，上图中虚线所示的区域在对应的下图中放大显示。箭头所示为Timm染色阳性颗粒。标尺:上排,500 ii m ;下排,50 ii m。(b)对各组大鼠Timm染色结果的定量分析。每组N = 4-8严P < 0.01，与空白对照组相比；*P < 0.05 和 **P < 0.01,与溶剂对照组相比；one-wayAN0VA with post hocBonferroni’ s test。(c)对ErbB4+/_鼠及其同窝对照的齿状回颗粒内分子层的Timm染色结果的定量分析。*P < 0.05,2-way ANOVA with post hoc Bonferroni^ s test。(d)对PV-Cre ;ErbB4+和PV-Cre小鼠的齿状回颗粒内分子层的Timm染色结果的定量分析。林P < 0.01, 2_way ANOVA with post hoc Bonferroni，s test。图16、ErbB4在第1056氨基酸位点的酪氨酸磷酸化特异性地限定在抑制性神经元中。(a)CaMKIIa抗体标记上的兴奋性神经元均表达ErbB4阳性，而还有一小部分ErbB4阳性细胞不表达CaMKIIa阳性，一方面说明组织化学实验和抗体的特异性，另一方面可以用排除法推测，其余这小部分ErbB4阳性细胞应该是抑制性神经元。标尺:20iim。(b)ErbB4在1284位点磷酸化可以表达在所有ErbB4阳性细胞中(上排)，而且大部分表达在CaMKIIa阳性神经元中(下排)，排除了这个位点在癫痫发生中的作用，因为CaMKIIa阳性神经元中的ErbB4敲除不影响癫痫(见实施例5)。标尺:20 u m。(c)ErbB4在第1056位点的酪氨酸磷酸化局限性地表现于部分ErbB4阳性细胞中，当给予IOnM NRGl刺激15分钟后该位点的磷酸化水平可以急剧升高。标尺:20iim。(d)ErbB4在1056氨基酸位点的酪氨酸磷酸化表达在抑制神经元中。上排:一部分GAD67阳性GABA能神经元表达ErbB4磷酸化；下排:PV阳性的GABA能神经元表达ErbB4磷酸化。标尺:上排，20 ym;下排，10 Pm。圆饼示意图总结了细胞化学研究中的发现。图17、PI3K-Akt-S6K通路是PV阳性神经元中NRGl_ErbB4信号系统抗癫痫作用的下游靶标。GAPDH作为内源性参照，表明各组样品的总蛋白上样量相等。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现癫痫发作后神经调节素I (Neuregulin
1,NRGI)的表达上调，其受体鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(v-erb-aerythroblastic leukemia viral oncogene homo log 4, ErbB4)的憐酸化水平上调；NRG1蛋白可以通过激活ErbB4的磷酸化来延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、降低癫痫活动引起的脑兴奋性状态和/或抑制癫痫发作引起的苔藓纤维发芽。本发明首次提出NRGl通过激活脑内的抑制性神经元中的ErbB4受体来抑制癫痫的发生发展过程，为有效预防、控制或治疗癫痫病提供了新祀标。NRGl和ErbB4信号及相关用途神经调节素I (Neuregulin_l，NRGI)是生长因子家族的一员，ErbB4(v-erb-aerythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 (avian)，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4)是其主要受体之一 (Mei, L.&Xiong，W.C.Neuregulin I in neuraldevelopment, synaptic plasticity and schizophrenia.Nature Reviews Neuroscience2008,9:437-452), ErbB4既具酪氨酸激酶活性又兼有配体高亲和力。人ErbB4是Homosapiens v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homo log 4 (avian)的简称。NRGl和ErbB4都广泛而丰富地存在于与癫痫发生密切相关的脑区内——如边缘叶结构中，特别是海马、杏仁核和梨状皮质等部位。脑内许多神经元包括一些Y-氨基丁酸能的中间神经元，例如在锥体神经元的兴奋性调控中起着重要作用的小清蛋白(Parvalbumin ；PV)免疫阳性的篮状细胞和枝状细胞细胞，都丰富地表达着ErbB4蛋白。NRGl和ErbB4在体内可以由金属蛋白酶等从前体形式剪切为成熟形式并发挥功能。NRGl和ErbB4都与神经发育、神经传导和突触可塑性有重要的联系。最近的研究发现NRGl可以促进前额叶皮质抑制性中间神经元释放Y-氨基丁酸并进一步抑制锥体神经元的兴奋性；同时，神经元的活动也可以影响NRGl的表达和其受体ErbB4的磷酸化激活。本发明人 在研究中发现，NRGl_ErbB4信号系统可以应答癫痫活动，并参与癫痫发生的内源性抑制机制。NRGl可以有效激活ErbB4的酪氨酸激酶活性(磷酸化)，进而延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、降低癫痫活动引起的脑兴奋性程度、和/或抑制苔藓纤维发芽。同理，ErbB4的激动剂会有效地抑制癫痫发生或发展的进程。本发明人进一步发现了一个NRGl抗癫痫作用的细胞学环路机制，即NRGl分泌于多种类型的细胞，但是其作用于ErbB4产生抗癫痫作用的细胞学靶点是PV阳性的神经元而不是CaMKIIa阳性的兴奋性神经元，这为癫痫病的预防和治疗揭示了一个细胞类型特异性的、有效的新靶标。在本发明的优选实施例中详细地论证了本发明人的上述发现，在模拟人类颞叶癫痫病的两种经典动物模型一电刺激点燃模型和匹罗卡品癫痫模型中，癫痫发作都可以给予显著诱导上调NRGl的mRNA和蛋白表达水平，并上调NRGl的受体ErbB4的酪氨酸磷酸化水平。给予脑内注射NRGl能显著延缓癫痫病的形成、抑制癫痫持续状态、同时抑制电刺激点燃发作所诱发的苔藓纤维发芽这一病理现象，而消耗脑内的NRG1、给予ErbB4的抑制剂或是敲除ErbB4基因消除ErbB4的活性则加速癫痫发生和发展的进程、恶化癫痫活动引起的脑兴奋性程度、和/或促进苔藓纤维发芽。实验中还发现，PV阳性神经元中的ErbB4信号通路对癫痫病的抑制起着主要作用，然而CaMKII a阳性神经元中的ErbB4受体对癫痫的抑制作用不大，揭示了一个基于特异性细胞学环路基础的抗癫痫分子信号通路上的新靶标。基于本发明人的新发现，本发明提供了 NRGl_ErbB4分子信号通路在癫痫病中的作用机理和用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的药物，或用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。基于本发明人的新发现，本发明还提供了特异性细胞学靶点，用于筛选调节NRGl的表达及其受体ErbB4的活性、改善大脑兴奋性、防治其它与脑兴奋性相关的疾病的潜在物质。由于NRGl和ErbB4对细胞的增殖、分化和存活等方面具有重要的营养支持作用，因此，NRGl-ErbB4信号通路或其调节剂(例如激动剂、促进剂、上调剂、抑制剂、拮抗剂、阻断剂等)可更好地地实现抗癫痫作用而产生尽可能少的副作用。任何 适合的NRGl蛋白或ErbB4蛋白均可用于本发明。所述的NRGl蛋白或ErbB4蛋白包括它们的序列全长形式或其生物活性片段。优选的，所述的NRGl蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_013956.3所示的序列或与GenBank登录号NM_013956.3中第176-246位(含NRGl的EGF功能区)序列基本上相同；只要其保留有NRGl的EGF功能区及该结构域的活性。优选的，所述的ErbB4蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_005235.2所示的序列基本上相同。尽管上述GenBank登录号代表了来自于人(人源)的NRGl蛋白或ErbB4蛋白，但是鉴于NRGl蛋白或ErbB4蛋白在不同动物中的高度保守性，来自于其它动物的NRGl蛋白或ErbB4蛋白也被包含在本发明中。由本发明的研究结果也可见，人源的NRGl蛋白或ErbB4蛋白在鼠(如大鼠、小鼠)体内的表达特征接近，发挥相同的功能，可见其在人、鼠或其它动物中的通用性。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的NRGl蛋白或ErbB4蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的NRGl蛋白保留有NRGl的EGF功能区。NRGl蛋白或ErbB4蛋白或它们的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见 Watson 等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/CummingsPub.C0.P224。任何一种NRGl蛋白或ErbB4蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，NRGl蛋白或ErbB4蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长蛋白的60^^70^^80^^90^^951%'99%、或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的NRGl蛋白或ErbB4蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的NRGl蛋白或ErbB4蛋白。所述经过修饰或改良的蛋白可以是与天然存在的蛋白具有较小的共同点，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响NRGl蛋白或ErbB4蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。NRGl及ErbB4的调节剂如本文所用，所述的“上调剂”、“促进剂”、“激动剂”、“激活剂”可互换使用。任何可上调NRGl或其ErbB4受体的表达或活性状态、促进NRGl和ErbB4蛋白成熟和剪切、诱导ErbB4受体的活性、提升NRGl和ErbB4的稳定性、激活NRGl和ErbB4所介导的信号通路、增强NRGl和ErbB4之间的结合力、延长NRGl和ErbB4之间的有效作用时间、或调节(提高)NRGl和ErbB4的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为制备抗癫痫的药物的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的NRGl的激动剂、促进剂或上调剂包括(但不限于):人工重组NRGl蛋白、可表达NRGl蛋白的重组表达质粒、激活或促进NRGl功能或活性的特异性多肽、可促进NRGl与ErbB4受体发生特异性结合或相互作用的物质。
作为本发明的优选方式，所述的ErbB4受体的激动剂、促进剂或上调剂包括(但不限于):人工重组NRGl蛋白、激活或促进ErbB4活性的特异性多肽、ErbB4的特异性配体或功能类似物、ErbB4胞内端活性区域、可促进NRGl与ErbB4受体发生特异性结合或相互作用的物质。在本 发明的优选实施方式中，所述的ErbB4胞内端活性区域为其酪氨酸激酶活性区域。尽管在该优选实施方式中列举了具体的酪氨酸磷酸化位点，然而，本领域人员应理解，只要是能够用于选择性地提高ErbB4的活性或表达、或增强其与胞内信号分子发生相互作用的ErbB4的变异体均是可用的。此外，本领域人员熟知的是，还可以采用多种常用的方法来增强或提高ErbB4的活性或表达，例如可设计针对ErbB4的过表达DNA载体等。任何可特异性地调节PV阳性神经元上ErbB4的各种活性机制的物质也可用于本发明，作为抗癫痫和抑制癫痫所致的脑兴奋性程度的物质。筛选抗癫痫的潜在物质的方法在得知了所述的NRGl及其受体ErbB4对于癫痫的发生或发展的影响作用后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选抗癫痫的潜在物质。可从所述的潜在物质中找到可用于制备抗癫痫的药物的物质。因此，本发明提供一种筛选抗癫痫的潜在物质的方法，包括以下步骤:(a)将候选物质与表达NRGl和/或ErbB4的体系接触；(b)检测NRGl的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高NRGl的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或检测ErbB4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高ErbB4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。鉴于所述的NRGl和ErbB4发生相互作用与癫痫的相关性，所述的筛选方法可以通过观察两者的相互作用进行。该方法包括:检测NRGl和ErbB4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进NRGl和ErbB4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术。ErbB4的胞内端有许多可发生酪氨酸磷酸化位点，鉴于其在脑内的广泛表达，其磷酸化位点的特异性可能介导着不同的功能。因此，本发明人鉴定了 ErbB4蛋白氨基酸序列上不同酪氨酸磷酸化位点与癫痫疾病的相关性，结果发现该蛋白第1056位点(相应于GenBank登录号NM_005235.2的氨基酸序列的第1056位)的磷酸化与癫痫疾病密切相关。因此可通过观察候选物质对于该位点上酪氨酸磷酸化的调节作用来进行筛选，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。本发明人还研究了 NRGl-ErbB4对于下游的信号通路的影响情况，结果发现NRGl可以诱导ErbB4(Tyrl056)磷酸化的显著升高，并激活AKT使其磷酸化水平显著升高。因此可通过观察候选物质对于NRGl-ErbB4的下游AKT信号通路的影响作用来进行药物的筛选。若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。在本发明中，所述的体系选自(但不限于):溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。作为本发明的优选实施例，所述的细胞体系选自(但不限于):海马细胞、皮层细胞、PV阳性中间神经元细胞；所述的动物体系为癫痫动物模型，选自(但不限于):点燃癫痫动物模型、或匹罗卡品癫痫动物模型。所述的体系中可含有NRGl或ErbB4，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对NRGl或ErbB4表达或活性的影响；或者，所述的体系中可同时含有NRGl、ErbB4及其下游信号通路分子，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于NRGl-ErbB4信号通路活性的影响。作为本发明 的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗癫痫真正有用的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抗癫痫的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防或治疗癫痫有用的物质。组合物本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00001-10wt% )的所述的神经调节素I(NRGl)的全长或功能区肽段的蛋白，以及药学上或食品学上可接受的载体。本发明的多肽或其类似物可直接用于癫痫或癫痫相关疾病的预防或治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。本发明提供了一种治疗癫痫的方法，包括给予受试者有效量的NRGl (如
0.00001-0.1克/60千克体重/天；优选的，为0.0001-0.005克/60千克体重/天)。应理解，当用于预防或治疗哺乳动物癫痫疾病时，所用的NRGl的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。在得知了所述NRGl的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的NRGl或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NRGl通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将NRGl的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的NRG1，具体情况需视所述的NRGl的制备质量和形式而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。本发明还提供了一种治疗癫痫的方法，包括给予受试者有效量的NRGl_ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂等。应理解，当用于预防或治疗哺乳动物癫痫疾病时，所用的NRGl_ErbB4信号通路的激动剂、促进剂、激活剂或上调剂的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。在得知了所述NRGl_ErbB4信号通路的激动剂、促进剂或上调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的NRGl-ErbB4信号通路的激动剂、促进剂、上调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NRGl-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将NRGl-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的NRGl-ErbB4信号通路的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂，具体情况需视所述的激动剂、激活剂、促进剂或上调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
检测试剂或试剂盒基于 本发明人的上述新发现，可以将NRGl或ErbB4作为诊断癫痫的标志物:(i)进行癫痫的鉴别诊断和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的癫痫治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群癫痫患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由NRGl或ErbB4基因表达异常而导致癫痫的人群，从而可进行更有针对性地治疗。因此，本发明提供了 NRGl或ErbB4基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)癫痫的试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测NRGl或ErbB4的存在与否以及表达情况、磷酸化水平，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测NRGl或ErbB4的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增NRGl或ErbB4的引物；或特异性识别NRGl或ErbB4的探针来确定NRGl或ErbB4的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合NRGl蛋白或ErbB4蛋白的抗体或配体来确定NRGl蛋白或ErbB4蛋白的表达情况。针对NRGl或ErbB4的引物或特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与NRGl或ErbB4基因上特定位点发生特异性结合，而不与NRGl或ErbB4基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。利用特异性结合NRGl蛋白或ErbB4蛋白(如磷酸化的蛋白)的抗体来检测分析物中NRGl蛋白或ErbB4蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。本发明还提供了用于在分析物中检测NRGl或ErbB4的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括:特异性扩增NRGl或ErbB4基因的引物；特异性识别NRGl或ErbB4基因的探针；或特异性结合NRGl蛋白或ErbB4蛋白(如磷酸化的蛋白)的抗体或配体。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。本发明的主要优点在于:首次发现神经调节素I (NRGl)及其ErbB4受体参与到癫痫发生或发展过程中并起到强烈的抑制性作用，为癫痫的预防或治疗提供了更具针对性的药物靶点。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。1.材料和方法海马神经细胞原代培养
无菌条件下，从胚胎期18天的孕鼠中取出胎鼠，体视镜下分离海马组织、剪碎、进行胰酶消化，经吹打及离心后将海马细胞悬浮于含有B27 (GiBco)、0.5mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES、100U/ml庆大霉素(pH 7.4)的神经细胞无血清培养基Neurobasal中，然后铺于经过0.0025% (w/v)多聚赖氨酸(I3DL)处理的六孔盘中，置37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。于第5天，加入IOii M氟尿苷(FUDR)抑制胶质细胞的增殖。在体外培养的神经元生长至第14天时，分别给予不同处理(如与NRGl、ecto-ErbB4、PD158780等分别孵育)，然后进行后续实验。电 刺激点燃癫痫模型(kindling model)和检测癫痫发作动物在0.6%戍巴比妥钠麻醉下(250-350mg/kg, 1.p.)将其头部固定于脑立体定位仪上，常规手术消毒、定位、钻孔、止血，然后在右杏仁核埋入双极刺激电极(大鼠:前囟后AP 2.80mm,旁开4.9em,深度硬脑膜下8.6mm ;小鼠:前囟后1.2mm,旁开2.8mm,硬脑膜下4.9mm)。四颗螺丝钉埋入颅骨但不穿透骨膜用于支撑和记录脑电图(EEG)。左侧后方螺钉连接不锈钢丝作为参考电极(大鼠:前囟后6.0mm,旁开3.0mm ;小鼠:前囟后4.0mm,旁开
2.0mm)。大鼠在脑室给药的药理学实验中，同时在动物侧脑室植入给药套管(Plastic one ；大鼠:前囟后0.9mm,旁开1.4mm,硬脑膜下4.0mm ;小鼠:前囟后0.3mm,旁开1.0mm,硬脑膜下2.2mm)。电极、套管和螺丝以牙科水泥浇灌固定在颅骨上。动物术后恢复至少7天。电极的位置正确与否在电刺激实验结束后通过脑片Nissl和甲绿派络宁-Y染色来确认。动物在接受电极埋植手术恢复一周后，先测试各自的脑电图癫痫放电的刺激阈值(Electrographic seizure threshold, EST)。测定 EST 时的刺激频率 60Hz,串长 Is,波宽lms，从60 开始，每隔2min刺激强度增加20 y A，直到刺激引起脑电图上出现放电发作且其持续时间长于3s，此时所需的最低刺激电流即为EST。此后，给予实验动物每天一次阈值强度大小的电刺激，观察动物的行为学和脑电图学上的癫痫发作情况。癫痫行为学的指标参照Racine标准分级法:1级，面部、胡须或嘴角抽搐；2级，点头、咀嚼伴面部抽搐或节律性眨眼；3级，单侧前肢抬起，阵挛；4级，直立伴有双侧前肢的阵挛；5级，直立失衡摔倒、全身性痉挛抽搐或僵直。动物如果连续3次行为学发作达到Racine5级标准即被定义为完全点燃(Fully kindled)。完全点燃的动物根据实验目的的不同，或停止刺激，或休息一段时间后用于后续实验。电刺激过程中对动物的药理学处理和基因型均按双盲法进行操作。在条件性敲除(Conditional knockout, cKO)小鼠的点燃模型实验中，以携带有正常ErbB4等位基因的同窝ErbB4_f 1xed和Cre小鼠作为对照。NRGl (10 u M ；GenBank 登录号 NM_013956.3 中第 176-246 位)、ecto-ErbB4 (I u g/U L；ffoo, R.S.,et al.Neuregulin-1 enhances depolarization-1nduced GABA release.Neuron 2007,54:599-610)、PD158780 (2mM ;购自德国 Calbiochem 公司)的脑室内注射在刺激前30分钟进行，通过埋置的不锈钢套管，将连接微量注射器的埋植套管配套内芯插入套管，完全插入后将药物缓慢注入侧脑室(大鼠总量5 ii L，速度0.5 ii L/min ;小鼠2 y L，速度0.2ia/min)，注药完毕后留针10分钟。对照组大鼠则接受侧脑室内注射等量的溶剂或相应的性能失活的重组多肽(NRG1或ecto-ErbB4)。在监控自发性癫痫的实验中，通过闭路电视监控和脑电图监测系统，动物在电刺激点燃实验结束后开始每周被监测40个小时(8h/天，5天/周)以记录自发性癫痫的出现。癫痫发作级别参照Racine标准分级法(见前述)。鉴于闭路电视监控的分辨率限制，只有行为发作达到4级以上的动物才被考虑在本研究中。匹罗卡品癫痫模型实验动物称重后腹腔注射匹罗卡品(340mg/kg体重,购自美国Sigma公司)诱发癫痫前30分钟预先给予注射东莨菪碱(Scopolamine methylbromide, 2mg/kg,购自美国Sigma公司)以拮抗匹罗卡品引起的外周系统胆碱能作用。对照组给予同等剂量的生理盐水取代匹罗卡品。注射匹罗卡品后密切观察动物的行为变化，记录其癫痫发作级别(同上)。自动物的癫痫发作达3级起计时，发作I个小时后腹腔注射安定(4mg/kg，购自美国Sigma公司)中止癫痫发作，以标准化癫痫的发作程度。腹腔注射给药时用Iml注射器在局部皮肤酒精消毒后进行。为了检测NRGl-ErbB4信号通路活性的改变，大鼠在发生癫痫后
3、6、24小时分别被取脑进行观察。在脑 内埋管给药的实验中，侧脑室埋管的参数和给药方法同电刺激点燃模型。脑室注射后NRG130分钟进行匹罗卡品注射诱发癫痫。对照组给予溶剂注射。本发明的SD大鼠、C57BL/6小鼠、条件性基因敲除小鼠及其对照小鼠均在中科院神经科学研究所实验动物房的SPF级屏障系统内繁育。实验前将成年动物(2-4月龄)从屏障系统转入标准动物房饲养。动物手术后恢复及电刺激点燃过程中也均在标准鼠房饲养。每笼饲养5只，自由饮食，12小时制光照/黑暗循环。室温维持在25± 1°C。所有涉及动物的实验均在中国科学院上海生命科学院动物管理和使用委员会的许可下进行。各种转基因或基因敲除小鼠的来源分别如下:心脏组织特异性重表达的ErbB4敲除杂合子小鼠(ErbB4+/0来自于瑞士巴塞尔大学的Martin Gassmann教授实验室,其制备方法如文献所述(Stoll, S.W., et al.Differential utilization and localization of ErbB receptortyrosine kinases in skin compared to normal and malignant keratinocytes.Neoplasia 2001，3，339-350)，纯合子小鼠(ErbB^由用杂合子小鼠交配后筛选得到。关于各系条件性敲除鼠，运用专业人士所熟知的Cre/LoxP介导的基因敲出策略来得到(Gu, H.，Marth, J.D.，Orban, P.C.，Mossmann, H.&Rajewsky, K.Deletion ofa DNA-Polymerase-Beta Gene Segment in T-Cells Using Cell-Type-Specific GeneTargeting.Sciencel994，265，103-106)。其中，LoxP-f lanked ErbB4 小鼠(ErbB4-f loxed)来自美国印第安纳大学的Cary Lai教授实验室(Sutula，T.，Cascino，G.，Cavazos，J.，Parada，1.&Ramirez, L.Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptichuman temporal lobe.Ann Neurol 1989，26，321-330) ;PV_Cre 小鼠来自于瑞士巴塞尔大学的 Silva Arber 教授实验室(Hippenmeyer, S.，et al.A developmental switch inthe response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.Plos Biology3,878-890(2005).);携带有 CaMkIIa 启动子驱动表达的 ERiCreER (CaMKII a-CreER)(Casanova, E.，et al.ER-based double iCre fusion protein allows partialrecombination in forebrain.Genesis 2002，34，208-214)或增强型 Cre 重组酶(CaMKIIa-1Cre) (Casanova,E.，et al.A CamKII alpha iCre BAC allows brain-specificgene inactivation.Genesis2001，31，37-42)的小鼠均由德国肿瘤研究中心的 GiintherSchiitz教授提供。各种条件性基因敲除鼠用相应的Cre小鼠与Floxed小鼠杂交后筛选而得，在本实施例中用到的有 PV-Cre ;ErbB4_/—、CaMKII a -1Cre ；ErbB4'/_ 和 CaMKII a -CreER ；
在成年期由它莫西芬诱导实现)等小鼠。
CaMKII a -1Cre ;ErbB4+小鼠的制备:通过CaMKII a -1Cre 小鼠与ErbB4+小鼠杂交获得。CaMKII a -CreER ;ErbB4+ 小鼠的制备:通过CaMKII a -CreER 小鼠与 ErbB4+ 小鼠杂交获得。在PV阳性神经元中特异性地敲除ErbB4的小鼠(PV-Cre ;ErbB4+)的制备:通过PV-Cre小鼠与ErbB4v_小鼠杂交获得。各 种转基因鼠均通过对鼠尾基因组的PCR实验来进行基因型鉴定，实验完毕后以脑切片进行特异性免疫染色再次确认。根据中科院上海生命科学研究院和美国国立卫生研究院的相关伦理学法则，所有的实验已尽力减轻对动物的伤害。它莫西芬诱导它莫西芬可以诱导携有CreER基因的条件性敲除小鼠细胞内的Cre入核并剪切目的基因。每20mg它莫西芬(Tamoxifen,购自美国Sigma公司)用振荡器混勻溶解于Iml的葵花籽油中，然后分装、冷冻贮存于_80°C。用前取出它莫西芬溶液在37°C预热15分钟之后再行腹腔注射。成年小鼠的它莫西芬用量为80mg/kg体重，每天一次，连续注射5天。最后一次注射后5天，小鼠取脑检测ErbB4蛋白的表达水平或开始用于后续实验。为了排除可能的副作用，对照组小鼠也接受等量的它莫西芬注射。经观察，它莫西芬注射的小鼠在行为上和体重上与溶剂注射组小鼠之间没有差别性变化。反转录polymerase chain reaction (PCR)和突光实时半定量 PCR用于在体观察NRGlmRNA的表达情况。实验动物在给予电刺激或匹罗卡品诱发癫痫后，在不同时间点(3、6、24小时)给予过量的麻醉药，快速断头，在冰上解剖出海马组织，在冰上快速分离并于TRIzoI试剂中(每IOmg组织0.1ml)匀衆，以提取RNA。提取出的组织总RNA溶解于无核酸酶的去离子水中。每例样品取2 ii g总RNA按照M-MLV反转录试剂盒的说明书合成cDNA (20 u I体系)，最后用I U I作为模板按照Takara公司提供的标准体系说明书进行PCR反应。PCR实所验用到引物信息请见表I。PCR产物经I %琼脂糖胶电泳后用Image Quant 5.1软件进行分析。表I
权利要求
1.一种神经调节素I或其上调剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的神经调节素I通过与鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用，促进鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化，预防、改善或治疗癫痫。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于: 延缓癫痫的形成；和/或 抑制癫痫持续状态；和/或 提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化的水平；和/或 减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或 抑制苔藓纤维发芽；和/或 调控下游的PI3K-Akt-S6K通路；和/或 促进AKT蛋白的磷酸化水平。
4.一种鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化促进剂的用途，用于制备预防、改善或治疗癫痫的组合物。
5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化促进剂选自:鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体，鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化激酶区域激活剂。
6.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的特异性配体选自:神经调节素I。
7.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于: 延缓癫痫的形成；和/或 抑制癫痫持续状态；和/或 减弱癫痫发作引起的脑兴奋性程度；和/或 抑制苔藓纤维发芽。
8.一种神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的用途，用于筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。
9.一种筛选预防、改善或治疗癫痫的潜在物质的方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)将候选物质与表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系接触； (b)检测神经调节素I的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高神经调节素I的表达或活性，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质；和/或 检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。
10.按权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的体系表达神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4，两者发生相互作用； 步骤(b)中，检测神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上促进神经调节素I和鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的相互作用，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。
11.按权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的磷酸化水平包括:检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4氨基酸序列中第1056位的酪氨酸的磷酸化水平，若该位点的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。
12.按权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的表达神经调节素I和/或鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4的体系中还包括AKT信号通路；步骤(b)中，所述方法还包括: 检测AKT信号通路的激活状况或检测AKT蛋白的磷酸化水平，若AKT信号通路被激活或者AKT蛋白的磷酸化水平在统计学上提高，则表明该候选物质是预防、改善或治疗癫痫的潜在物质。
13.一种神经调节素I的用途，用于制备检测癫痫的试剂。
14.一种特异性识别神经调节素I或其编码基因的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。
15.一种检测癫痫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有:特异性识别神经调节素I或其编码基因的试剂。
16.一种特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4磷酸化水平的试剂的用途，用于制备检测癫痫的试剂或试剂盒。
17.一种检测癫痫的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中含有:特异性检测鸟类血红细胞白血病病毒致癌基 因同源体4磷酸化水平的试剂。
全文摘要
本发明涉及神经调节素1(NRG1)及其受体作为制备或筛选抗癫痫药物靶点的用途。本发明首次提出NRG1通过激活脑内的抑制性神经元中的鸟类血红细胞白血病病毒致癌基因同源体4(ErbB4)来抑制癫痫的发生发展过程，为有效预防、控制或治疗癫痫病提供了新靶标。
文档编号G01N33/569GK103083645SQ20111033136
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者熊志奇, 谭国鹤, 刘媛媛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院