专利名称：用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域的悬浮芯片检测试剂盒，尤其是一种用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
卵巢恶性肿瘤是目前国内外常见的妇科恶性肿瘤，死亡率高居妇科恶性肿瘤首位，五年生存率仅为30%左右。造成其死亡率居高不下的重要原因之一是卵巢癌极易发生早期浸润转移，70%患者发现时已为晚期。对于卵巢癌的治疗是根据肿瘤的性质、组织学类型、手术-病理分期和患者的年龄等因素来决定是否进行手术后的辅助治疗。无卵巢癌外转移早期卵巢上皮癌术后大部分患者不需要进一步治疗，90%以上患者可长期无瘤存活； 所有早期卵巢癌高危因素患者中，30% -40%有复发危险，25% -30%在首次手术后5年内死亡，这些患者在全面手术分期结束后，则还需要进行以钼类为基础的4-6个疗程的综合化疗方案，而早期卵巢上皮癌与复发有关的高危因素中就包括卵巢癌外转移。对于已发生盆腔外转移的晚期卵巢上皮癌标准治疗模式为患者一开始就应该进行满意的肿瘤细胞减灭术，尽最大可能使残余肿瘤小于2cm(术后残余肿瘤的大小直接与患者预后相关)；满意的肿瘤细胞减灭术后的患者应该首选钼类药物(顺钼或卡钼)和紫杉醇的联合化疗，至少 6个疗程；另外，如果患者在首次肿瘤细胞减灭术后残余肿瘤数量相当多，可以给予2-3个疗程的新辅助化疗，紧接着行中间性肿瘤细胞减灭术，术后再予3-6个疗程的化疗。因此术前诊断卵巢癌盆腔外转移将有助于提高手术的准确率和确定患者最佳治疗方案。目前，卵巢癌盆腔外转移的鉴别诊断主要依靠影像学手段。超声检查可清晰显示盆腔器官及病变的图像，根据所测卵巢的大小、形态、血流和血管分布可在早期发现卵巢病变。CT检查可清晰显示盆腔器官及病变的图像、肿块的部位及性质，还能发现周围浸润病灶和淋巴结转移。CT平扫对卵巢肿瘤良恶性定性诊断准确率为70% 80%不等，强化CT对卵巢良恶性肿瘤定性诊断符合率达到91.4%。因此，CT可以作为确认有无大病灶的初步检查方法，但是对位于腹膜、肠系膜、大网膜以及直径小于2cm的病灶难以发现。CT诊断表现典型的卵巢癌容易，可是鉴别诊断CT表现与卵巢癌类似的其他病变仍有困难，如慢性炎症或增殖性结核包块等，临床上两者的误诊率达30%，其原因是这类病变的形态与卵巢癌非常相似。另外，CT诊断表现不典型的卵巢癌也不容易。磁共振成像(MRI)是80年代发展起来的一种影像学诊断方法，它具有对人体软组织的良好空间分辨率、对比度好及无创性无辐射且成像平面灵活等特点。MRI增强对鉴别卵巢肿瘤的良恶性，同时增强扫描改善了肿瘤内部结构的显示及肿瘤与周围组织的关系，更能清晰地显示卵巢恶性肿块所特有的征象，并提高对较小盆腔、腹膜等种植转移灶的检出率，对恶性肿瘤的诊断及分期有较高指导意义。然而，MRI对微小病灶的检出仍不够理想，有些病变定性困难，甚至少数炎性包块难以与肿瘤鉴别。现有的临床研究证实，卵巢癌以盆腹腔种植，直接浸润扩散为主，其次为淋巴道转移，血路转移相对少。而肿瘤细胞侵袭和转移的能力与产生或诱导产生降解细胞外基质的蛋白酶的能力密切相关。已发现的促使细胞外基质降解的蛋白水解酶包括基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPS)、组织蛋白酶(Cathepsins, CPS)、乙酸肝素酶 (heparanase, Hpa)等。酶联免疫法(ELISA)检测已证实肿瘤患者血清中胞外基质的蛋白酶含量与转移呈正相关。目前血清蛋白因子的测定方法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、 化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等，这些方法均为单指标检测方法，而单一因子检测并不能完全反映卵巢癌浸润转移的进程及水平。若想避免这种情况而对每份标本进行多指标分析费用又很昂贵，而且需要血清量较大。鉴于这种情况，需要建立能够同时、快速、准确检测多种血清因子的技术平台。近年来开发的悬浮芯片将流式细胞技术和酶标检测技术有机地整合在一起，利用100种不同荧光色标的微球为反应载体，标记捕获不同目标分子的配体，通过红、绿两束不同波长激光对每个微球进行检测，通过计算机分析和标准曲线拟合，可实现多元化、高通量、单因子分别定量的快速检测，具有高效、快速、敏感、特异、低成本等特点。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效、快速、准确、无创、敏感、特异、低成本的用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒及其制备方法，以克服现有卵巢癌术前盆腔、腹膜等种植转移灶的检出率存在的诸多不足。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒，主要包括三种偶联羟基荧光微球和三种羊抗人多克隆抗体；三种偶联羟基荧光微球分别包被MMP9、HpaU CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体；三种羊抗人多克隆抗体分别为链亲和霉素-藻红素亲和偶联的MMP9、Hpa、CL羊抗人多克隆抗体。上述用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒的制备方法取三种偶联羟基荧光微球分别包被MMP9、Hpal、CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体； 将链亲和霉素-藻红素与MMP9、Hpa, CL羊抗人多克隆抗体进行亲和偶联。该方法包括以下步骤〈1>荧光微球包被鼠抗人单克隆抗体取三种偶联羟基荧光微球，三种鼠抗人单克隆抗体各对应一种偶联羟基荧光微球；分别将含有I. OX IO5个微球的8 μ I三种偶联轻基突光微球重悬于250 μ I稀释液中， 加入IOul浓度为50mg/ml的EDC后，迅速加入IOul浓度为50mg/ml的S-NHS活化微球，室温避光孵育20min，离心，弃上清；用250ul稀释液重悬微球，分别加入浓度为lug/mL的鼠抗人单克隆抗体250 μ 1，混匀，室温避光孵育30min，离心，弃上清，用稀释液清洗交联好的微球两次，最后定容至终浓度200个微球/ μ 1，室温避光保存，即得分别包被ΜΜΡ9、Hpal、CL 三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体的三种偶联羟基荧光微球溶液；<2>链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体用稀释液分别配制浓度为4 μ g/ml的三种羊抗人多克隆抗体溶液，用超纯水配制浓度为10mmol/L的链亲和霉素-藻红素蛋白溶液，将等体积的链亲和霉素_藻红素蛋白溶液加入到羊抗人多克隆抗体溶液中，在冰上震摇2h后，得到浓度为2ug/mL的链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体溶液，分装于-20°C冻存备用。稀释液为含I %牛血清白蛋pH 7. 4的IOmM磷酸缓冲液。发明人在研究中发现而单一胞外基质蛋白酶检测并不能完全反映卵巢癌浸润转移的进程及水平，而三种胞外基质蛋白酶MMP9、Hpal、CL联合检测则可以有效弥补此缺陷。 然而，对每份标本分别进行三种胞外基质蛋白酶免疫分析费时长，而且需要血清量较大。为此,本发明将流式细胞技术和酶标检测技术进行有机整合,建立了可联合检测三种胞外基质蛋白酶MMP9、Hpal、CL含量的多色荧光微球悬浮芯片检测试剂盒。该试剂盒结合挖掘数诊断模型可用于卵巢癌患者术前盆腔外转移的诊断，有助于确定最佳治疗方案及判断预后状况等，具有高效、快速、敏感、特异、低成本等特点。本发明其与现有技术相比具有如下有益效果〈1>准确率高市场上尚无可有效诊断卵巢癌术前盆腔外转移的血清试剂盒，而本发明的试剂盒敏感度和特异度超过90% ；<2>通量大该试剂盒可同时检测同一样本中三种胞外基质蛋白酶含量；<3>所需样品少只需要I U I的血清样本即可完成检测；<4>简单快速检测操作无需反复洗涤，不到2小时即可完成，实验结果由相应的分析仪自动读取，排除了主观性。


图I是应用本发明悬浮芯片检测试剂盒检测血清MMP9、Hpal、CL含量判断肿瘤转移诊断模型树状图。图2是应用本发明悬浮芯片检测试剂盒检测血清MMP9、HpaU CL的标准曲线，图中1组织蛋白酶L，2乙酰肝素酶，3基质金属蛋白酶。图3是应用本发明悬浮芯片检测试剂盒及诊断模型判断卵巢上皮性癌发生盆腔外转移结果，图中 =总病例数(即盆腔外转移阳性+盆腔外转移阴性)。
具体实施例方式用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒及其制备方法研究一、实验材料Matrix MetalIoproteinases 9 (MMP9)、Heparanases I (Hpal)、cathepsin L(CL)三种全长编码氨基酸鼠抗人单克隆抗体及Matrix Metalloproteinases 9 (MMP9, C-terminus)、Heparanases I (Hpal,C-terminus)、cathepsin L(CL C-terminus)三种羊抗人多克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology, Inc。所用的多色微球为Luminex公司的偶联羟基荧光微球。链亲和霉素-藻红素(Streptavidin-PE)来自英国Innovabiosciences公司。二、试剂盒的制备制备突光微球悬浮芯片取三种偶联羟基荧光微球分别包被MMP9、Hpal、CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体；将链亲和霉素-藻红素与MMP9、Hpa, CL羊抗人多克隆抗体进行亲和偶联。 具体步骤如下
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〈1>荧光微球包被鼠抗人单克隆抗体取三种偶联羟基荧光微球，三种鼠抗人单克隆抗体各对应一种偶联羟基荧光微球；分别将含有I. OX IO5个微球的8 μ I三种偶联轻基突光微球重悬于250 μ I稀释液(含 1%牛血清白蛋的IOmM磷酸缓冲液，pH 7.4)中，加入IOul EDC(50mg/ml)后，迅速加入IOul S-NHS (50mg/ml)活化微球，室温避光孵育20min，离心，弃上清；用250ul稀释液重悬微球， 分别加入浓度为lug/mL的鼠抗人单克隆抗体250 μ I,混勻，室温避光孵育30min,离心,弃上清，用稀释液清洗交联好的微球两次，最后定容至终浓度200个微球/ μ 1，室温避光保存，即得分别包被ΜΜΡ9、Hpal、CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体的三种偶联羟基荧光微球溶液；<2>链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体用稀释液分别配制浓度为4 μ g/ml的三种羊抗人多克隆抗体溶液，用超纯水配制浓度为10mmol/L的链亲和霉素-藻红素蛋白溶液，将等体积的链亲和霉素_藻红素蛋白溶液加入到羊抗人多克隆抗体溶液中，在冰上震摇2h后，得到浓度为2ug/mL的链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体溶液，分装于-20°C冻存备用。将终浓度的三种包被微球溶液和三种多克隆抗体溶液各自包装，然后组装成检测试剂盒，备用。三、试剂盒的应用应用本试剂盒检测血清中MMP9、Hpal、CL步骤如下分别取MMP9、Hpal、CL单克隆抗体荧光微球溶液25 μ 1，分别加入等体积的链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体溶液以及待测血清ι μ 1，补充稀释液至总反应体积ιοομ 1，漩涡混匀，避光，室温振荡孵育Ih ;100μ I稀释液洗涤两次后，将三种荧光微球混合后，最后用稀释液定容至100 μ 1， 于Luminex公司的100型流式突光仪检测。判断卵巢癌发生盆腔外转移取Santa Cruz公司MMP9、Hpal、CL标准品，分别稀释至8，16，32，64，128，256，512，1024，2056、4128U/ml，以横坐标分别为三种酶的浓度，纵坐标为荧光检测值(FI)制作标准曲线。空白对照为样品稀释液。每个标准曲线最高检测限是使分析物的浓度达到饱和；最低检测限(L0D值)从拟合标准曲线上推定，是分析物的平均荧光强度相当于空白本底与标准差的3倍之和所对应的检测物浓度。以当MMP9 > 52. 5U/ ml，且Hpal > 66U/ml或者CL > 201U/ml时判断卵巢癌发生盆腔外转移。悬浮芯片检测卵巢癌血清MMP9、Hpal、CL含量建立的挖掘数诊断模型如下图I。血清采集患者入院后未经治疗空腹抽取IOml静脉血，4°C冰箱放置2小时自然凝固后，4°C 3000r/离心lOmin，取上层血清分装后_80°C冰箱保存。对卵巢上皮性癌83例(以病理诊断作为“金标准”分为盆腔外转移阳性56例和盆腔外转移阴性27例)患者用悬浮芯片试剂盒检测MMP9、Hpal、CL血清含量，根据标准品建立的标准曲线，检测MMP9的LOD值为6. 2U/ml，Hpal的LOD值为5. 8U/ml，CL的LOD值为
7.4U/ml，三种酶的动态检测范围在7 2056U/ml (见图2)。根据标准曲线，悬浮芯片检测 24例样本中MMP9、Hpa、CL值的变异系数为3. 39 6. 15%，在可信任区间范围内。将83例患者血清MMP9、Hpal、CL的含量输入诊断模型，用于判断肿瘤是否发生盆腔外转移，结果显示(见图3)，模型的灵敏度为91. 1% (51/56)，特异度92. 6% (25/27)，阳性预测值87. 9% (51/58)，阴性预测值68. 7% (22/32)。
权利要求
1.一种用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒，其特征在于主要包括三种偶联羟基荧光微球和三种羊抗人多克隆抗体；所述三种偶联羟基荧光微球分别包被 MMP9、HpaU CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体；所述三种羊抗人多克隆抗体分别为链亲和霉素-藻红素亲和偶联的MMP9、Hpa, CL羊抗人多克隆抗体。
2.根据权利要求I所述用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒的制备方法，其特征在于取三种偶联羟基荧光微球分别包被MMP9、HpaU CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体；将链亲和霉素-藻红素与MMP9、Hpa、CL羊抗人多克隆抗体进行亲和偶联。
3.根据权利要求2所述用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤<1>荧光微球包被鼠抗人单克隆抗体取三种偶联羟基荧光微球，三种鼠抗人单克隆抗体各对应一种偶联羟基荧光微球；分别将含有I. OX IO5个微球的8μ I三种偶联羟基荧光微球重悬于250 μ I稀释液中，加入 IOul浓度为50mg/ml的EDC后，迅速加入IOul浓度为50mg/ml的S-NHS活化微球，室温避光孵育20min，离心，弃上清；用250ul稀释液重悬微球，分别加入浓度为lug/mL的所述鼠抗人单克隆抗体250 μ 1，混匀，室温避光孵育30min，离心，弃上清，用稀释液清洗交联好的微球两次，最后定容至终浓度200个微球/ μ 1，室温避光保存，即得分别包被MMP9、Hpal、CL 三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体的三种偶联羟基荧光微球溶液；<2>链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体用稀释液分别配制浓度为4 μ g/ml的三种羊抗人多克隆抗体溶液,用超纯水配制浓度为10mmol/L的链亲和霉素-藻红素蛋白溶液，将等体积的链亲和霉素_藻红素蛋白溶液加入到羊抗人多克隆抗体溶液中，在冰上震摇2h后，得到浓度为2ug/mL的链亲和霉素-藻红素亲和偶联羊抗人多克隆抗体溶液，分装于-20°C冻存备用。
4.根据权利要求3所述用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述稀释液为含I %牛血清白蛋PH 7. 4的IOmM磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断术前卵巢癌盆腔外转移的悬浮芯片检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要包括三种偶联羟基荧光微球和三种羊抗人多克隆抗体；三种偶联羟基荧光微球分别包被MMP9、Hpa1、CL三种全长cDNA编码蛋白的鼠抗人单克隆抗体；三种羊抗人多克隆抗体分别为链亲和霉素-藻红素亲和偶联的MMP9、Hpa、CL羊抗人多克隆抗体。本发明采用悬浮芯片技术，实现了联合检测三种胞外基质蛋白酶MMP9、Hpa1、CL含量，可用于卵巢癌患者术前盆腔外转移的诊断，有助于确定最佳治疗方案及判断预后状况等。
文档编号G01N33/577GK102608322SQ20121008093
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月24日 优先权日2012年3月24日
发明者张玮, 李力, 王琪 申请人:广西壮族自治区肿瘤防治研究所