专利名称：利用高效液相色谱法检测玉米细胞核dna和线粒体dna甲基化水平的方法
技术领域：
本发明涉及，尤其涉及的是一种利用高效液相色谱法检测玉米细胞核DNA和线粒体DNA甲基化水平的方法。
背景技术：
随着DNA甲基化研究的逐步深入，DNA甲基化水平的检测已发展成为一门内容丰富的方法学。DNA甲基化常用的分析方法为MSAP法，该法被广泛应用于水稻、棉花和拟南芥等基因组的胞嘧啶甲基化评定。但是，MSAP法所使用的同裂酶(如HpaII和MspI)不能切割所有的甲基化位点，识别范围有限。相比较而言，HPLC法能方便、快速、准确地测定整个基因组的甲基化水平，它能在宏观上对整个基因组的DNA甲基化水平进行大规模的分析测 定，这恰恰是具有识别位点特异性的MSAP法所不具备的。HPLC法是生物化学、分子生物学、医药学等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，也可以应用于测定全基因组DNA甲基化水平。继Wagner等首次用HPLC法测定植物5mC的含量以来，该法被广泛应用于植物DNA甲基化水平的检测。Johnston等[2]用该方法对茶薦子基因组中5mC含量进行了分析，丁明丽用该法测定了小麦成熟胚脱分化过程中的DNA甲基化水平，表明HPLC方法可达到对植物DNA甲基化水平精确分析的目的。因此，运用高效液相色谱法能够更加准确、全面地测定DNA甲基化水平。核酸的酶水解通常采用核酸酶P1、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶将DNA水解为脱氧核苷后进行测定。核酸酶Pl只能对DNA的单链产生作用；核酸酶Pl的最适反应温度高于另外两种酶，而最适pH值却低于另外两种酶，这就意味着三种酶不能同时作用，而且需人为地调节pH值，使实验显得格外繁琐。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用高效液相色谱法检测玉米细胞核DNA和线粒体DNA甲基化水平的方法。本发明的技术方案如下利用高效液相色谱法检测玉米细胞核DNA和线粒体DNA甲基化水平的方法，可供处理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法为将250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U碱性磷酸酶加入至5mL pH为7. 9的Tris-HCl水解缓冲液内；流动相的pH :对于线粒体DNA，用磷酸调节pH至3. 42 ;对于细胞核DNA，用磷酸调节pH至3. O ;色谱条件为色谱柱C18填料色谱柱；流速0. 8 mL/min，检测器波长287nm ;柱温35°C ;进样量20uL ;流动相甲醇5mM戊烷磺酸钠三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸调节pH分别至3. 42和3.0。方法简单易行，20min内可将各组分完全分离。(I)利用Benzonase、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶配置成水解体系,根据每ug DNA加上一定量的水解液，37°C水解6个小时即能获得脱氧核苷。此法简单、经济、有效。
(2)对线粒体DNA和细胞核DNA甲基化水平的检测条件有所不同流速、进样体积、柱温箱温度均一致，但是流动相的PH不一样。线粒体DNA分析时需要的pH略高于细胞核DNA，这样才能使各时各组分得到较好的分离。(3)经过优化的色谱条件为，色谱柱C18填料色谱柱(4. 6X250mm,5um);流速O. 8 mL/min，检测器波长287nm ;柱温35°C ;进样量20uL ;流动相甲醇5mM戊烷磺酸钠:三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸调节pH分别至3. 42和3. O。方法简单易行，20min内可将各组分完全分离。


图I为标准品及样品经水解后琼脂糖凝胶电泳检测图谱；图2为DNA标准品水解后HPLC色谱图；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。DNA样品经酸或酶水解成碱基/核苷/核苷酸,本实验利用Benzonase、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶配置成水解混合液，可供处理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法为将250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U碱性磷酸酶加入至5mL pH为7. 9的Tris-HCl水解缓冲液内。在I μ g 20 ng/ μ L的DNA中加入50 μ L水解混合液，37°C温浴6小时后，_20°C冷藏待上机测定。启动电脑、高效液相色谱仪的A泵、B泵、SPD检测器、柱温箱等，先用100%甲醇冲洗柱子lh，再用水甲醇(95 :5，v/v)过渡30min，最后用含缓冲盐的流动相冲洗lh，平衡色谱柱至基线平稳。将标准品溶液dC、5mC分别进样，经工作站软件处理后得出洗脱峰、各自的保留时间和峰面积，接着将待测DNA样品逐个上样，根据标样dC和5mC洗脱峰的保留时间自动检测样品DNA水解产物中dC和5mC的洗脱峰，通过公式(5mC/(511￡+(10\100%)，计算0嫩甲基化水平。样品检测完毕，先用流动相冲洗lh，然后用水甲醇(95 :5，v/v)过渡30min，再用甲醇冲洗Ih以上，待基线平稳后关机。测定波长的优化本实验通过高效液相色谱仪二极管阵列检测器多通道(波长)扫描，找出dC和5mC最大吸收峰，对应波长分别是278nm和287nm，本实验在最大吸收峰波长周围设计梯度实验，对各供试波长所对应的峰面积进行测定，结果如表1，由表I可以看出，dC在这供试波长范围内的峰面积相差不大，但是5mC的波动比较大，其中，在287nm处，5mC得到最大吸收，所以选择287nm作为固定检测波长。表I不同检测波长下dC和5mC的峰面积
波长(nm)dC峰面积5mC峰面积
r π273112068.7137436.6
275丨丨 6836.1149150.1
276118929.9丨 56430.3
277119339.615975(1.权利要求
1.利用高效液相色谱法检测玉米细胞核DNA和线粒体DNA甲基化水平的方法，其特征在于，可供处理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法为将250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U碱性磷酸酶加入至5mL pH为7. 9的Tris-HCl水解缓冲液内；流动相的pH 对于线粒体DNA,用磷酸调节pH至3. 42 ;对于细胞核DNA,用磷酸调节pH至3. O ;色谱条件为色谱柱C18填料色谱柱；流速0. 8 mL/min，检测器波长287nm ;柱温35°C ;进样量.20uL ;流动相甲醇5mM戊烷磺酸钠三乙胺(10 90 :0. 2，V/V),并用磷酸调节pH分别至.3. 42 和 3. O。
全文摘要
本发明公开了一种利用高效液相色谱法检测玉米细胞核DNA和线粒体DNA甲基化水平的方法，可供处理100份1μgDNA的水解混合液配制方法为将250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U碱性磷酸酶加入至5mL pH为7.9的Tris-HCl水解缓冲液内；流动相的pH对于线粒体DNA，用磷酸调节pH至3.42；对于细胞核DNA，用磷酸调节pH至3.0；色谱条件为色谱柱C18填料色谱柱；流速0.8mL/min，检测器波长287nm；柱温35℃；进样量20μL；流动相甲醇5mM戊烷磺酸钠三乙胺(10900.2，V/V)，并用磷酸调节pH分别至3.42和3.0。方法简单易行，20min内可将各组分完全分离。
文档编号G01N30/88GK102944638SQ20121051956
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者曹墨菊, 荣廷昭, 张晨, 张艳花, 汪静, 卢艳丽, 刘和洋, 汪瀚宇, 王继玥, 曾文兵, 汪生庆, 刘坚, 高世斌, 周树峰, 胡尔良 申请人:四川农业大学