专利名称：老年性痴呆相关基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测老年性痴呆相关基因位点是否发生突变的试剂盒，通过同时检测与老年性痴呆密切相关的载脂蛋白E (APOE)和脊髄灰质炎病毒受体相关2 (PVRL2)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体患老年性痴呆症的风险。
背景技术：
阿尔茨海默病所谓的老年痴呆症。是ー种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性減退，并有各种神经精神症状和行为障碍。患病率研究显示，美国在2000年的阿尔茨海默病例数为450万例。年龄每增加5岁，阿尔茨海默病人的百分数将上升2倍，也就是说，60岁人群的患病率为1%，而85岁 人群的患病率为30%。载脂蛋白E (Apolipoprotein E,AP0E)是血衆脂蛋白的ー个重要组成部分。APOE基因位于19号染色体。目前以有研究者们以聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对APOE进行分型，以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析結果。由此从分子水平阐明APOE基因多态性与老年性痴呆(Alzheimer’ s disease, AD)的关系，尤其是e 4的多态性，对研究AD的发病机理、预防、诊断及早期防治有重大意义。人类APOE存在基因多态性，其遗传多态性主要受位于同一基因位点上的3个等位基因(e 2、e 3、e 4)所控制，分别编码血浆中3种异构体，即AP0E2、AP0E3、AP0E4,构成6种不同的基因型，3种纯合子(e 2/ e 2，e 3/ e 3, e 4/ e 4)，3钟杂合子(e 2/ e 3，e 2/ e 4,e 3/ e 4)。APOE基因PCR-RFLP原理为用特异性引物扩增，包括2位点DNA序列，扩增产物进ー步用Hhal I酶切，产生不同的限制性片段长度多态性￡2、￡3、￡4，由此产生6种不同的电泳图谱。AP0E3是人群中最常见的形式。有学者报道APOE- e 4增加AD的危险性，APOE- e 2减少AD的危险性。APOE基因与晚发家族性AD，晚发散发型AD与早发散发性AD均有关联。晚发性AD与APOE e 4等位基因的联系已被证实。AD患者携带e 4等位基因者占46. 2%，而对照只占13. 2%。根据研究者的研究结果表明，AD患者的年龄分布和对照组之间无差别(u=0. 97，P>0.05)。等位基因在AD组与正常对照组之间有非常显著的差异(P < 0.01)。其中e2、e 3等位基因在AD组与对照组之间的比较无明显差异(u=l. 79，P > 0. 05)，e 4等位基因在对照组和研究者们的结果与国外报道一致。并且在AD组中，携帯e 4基因型与对照组之间也有明显差异(P< 0.01)，而携带￡3等位基因，无明显差异。e4等位基因与对照组比较差异明显(P < 0. 05)。1994年有报道百岁老人普遍携帯AP0E2等位基因。因此e 2等位基因似乎不仅可 以保护人们免患AD，而且还与长寿有夫。这ー关系可能是由于e 2等位基因通过减少LDL—胆固醇浓度而达到保护机体的作用。[0008]AD组与正常对照组中APOE基因型差异显著。AD患者e 3的频率与对照组相似。对照组e 2的频率较高，但均无统计学差异。而患者e 4的频率明显高于对照，说明^4对AD的发展及结果确实有一定的影响。这可能是AD患者特殊的脑损伤由APOE多态性所致。许多人倾向认为ム0是首要的并且首先发生淀粉样蛋白沉积。特别AP0E4比AP0E3结合
的速度快，pH范围狭窄。A0PE4还可以同AP结合形成新的单纤维，沉寂后形成高密度的结构。最近有学者认为，淀粉蛋白形成是AD的第一歩，P淀 粉蛋白斑的形成可能先于通常见到的导致AD脑细胞凋亡的“神经元纤维缠结”的产生。另ー种与AD损伤有关的重复蛋白是微管蛋白Tau。APOE-Tau相互作用可能是防止Tau磷酸化的保护机制。对于携带ー个或两个e 4等位基因的患者，游离的Tau可能被磷酸化，从而影响了神经纤维的结构。综上所述，APOE特别是AP0E4在多种神经退化过程的发展中起作用。研究者们研究AD患者的遗传与APOE基因多态性的相关性，实验结果阐明e 4与AD的发病有着一定的相关作用，而AP0E3或AP0E2与病理改变无明确的牵连。脊髓灰质炎病韋受:体相关2 (polivovirus receptor related 2, PVRL2)属于免疫球蛋白超家族中的Nectin家族,基因全长约43kb,亦定位于19ql3,有9个外显子和两种亚型，在氨基酸水平上与PVR有55%的同源性。PVRL2编码I型穿膜糖蛋白，结构中也有两个免疫球蛋白样C2型区域和ー个免疫球蛋白样V型区域。其分子定位于内皮细胞的细胞间连接处，它的两种亚型互相作用，通过S亚型向细胞内传递信息，发挥粘附作用。葛晓东等研究认为PVRL2是单纯疱疹病毒(HSV)和假狂犬病病毒的受体，介导这些病毒株入侵细胞，而且与这些病毒在细胞间的扩散有关，大多数研究亦认为PVRL2的基因遗传多态性现象对多发性硬化症的严重程度有所影响，认为病毒与多发性硬化症的临床病程相关。Takahashi等的研究更进一步证实PVRL2是一种Ca2+非依赖性的粘附分子(cellular adhesionmolecule, CAM),在细胞粘附、迁移和极化中起重要作用。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个老年性痴呆相关基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，载脂蛋白E (APOE)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GAGATGAGAGTTGGT -3’下游引物序列5’- GAAGAGAAACGCTGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GGGTTGGaGTGGAG - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5，-VIC-GGGTTGGgGTGGAG - TAMRA -3’脊髄灰质炎病毒受体相关2 (PVRL2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CTTGGGACTTGGAGG -3’[0021]下游引物序列5，-TAGAGACGGGAGAAG -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - GGTGGAACgGCACACT -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积10 iil，其中Siil PCR反应液，2 检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读取，根据得到的ニ维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测老年性痴呆相关基因SNP位点，从而告知被检者患病风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行针对性治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个老年性痴呆相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患老年性痴呆症风险性的评估也更便捷。

图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料[0039]血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针 基于载脂蛋白E (APOE)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GAGATGAGAGTTGGT -3’下游引物序列5’- GAAGAGAAACGCTGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GGGTTGGaGTGGAG - TAMRA _3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GGGTTGGgGTGGAG - TAMRA -3’ 脊髄灰质炎病毒受体相关2 (PVRL2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- CTTGGGACTTGGAGG -3’下游引物序列5，-TAGAGACGGGAGAAG -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - GGTGGAACgGCACACT -TAMRA -3’3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定患老年性痴呆症的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95で、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1. ー种老年性痴呆相关基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测老年性痴呆相关基因位点是否发生突变从而评估个体患老年性痴呆症风险性的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个老年性痴呆症相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患老年性痴呆症风险性的评估也更便捷。
文档编号G01N21/64GK202401070SQ20112056947
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司