专利名称：基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法
技术领域：
本发明涉及汞离子浓度检测范围，特别是基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法。
背景技术：
汞是环境中重金属污染的重要元凶之一，是一种具有严重生物毒性的化学物质，由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使汞成为目前最受关注的环境污染物之一，尤其是溶解态的Hg2+具有较高的化学活性和稳定性，是排入环境水体中污染物的主要存在形式，对细胞具有腐蚀性和致癌性，因此发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法进行汞离子的检测成为必要，开发和研究新的检测汞离子的材料和方法成为热点。随着指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)的发展和应用，越来越多的对祀分子具有亲和性和特异性的核酸适体从大容量的寡核苷酸库中筛选获得，研究发现，一个汞离子能特异地和两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构，利用这一原理，已经建立了多种基于荧光信号转变的检测萊离子的方法，如Akira Ono等设计了一条富含碱基(T)的寡核苷酸序列,其5’端标记有猝灭素，3’端标记有荧光素，当汞离子存在时，由于T-Hg2+-T的结合作用而使寡核苷酸形成发夹结构并导致3’端和5’端靠近引起荧光猝灭从而对汞离子进行定量测定(Akira Ono, Humika Togashi. Angew. Chem. , 2004, 116: 4400 4402)。而 Wang Z D 也是利用T-Hg2+-T的结合原理设计了发夹结构的汞离子的寡核苷酸适体，通过荧光强度的上升定量检测汞离子(Wang Z D, Lee J H, Lu Y. Chem. Commun., 2008，45: 6005 6007)。采用源于镍离子RNA核酸适体的碱基序列合成的DNA碱基序列，再对它的部分碱基进行改造后获得新的汞离子核酸适体，并设计与该汞离子核酸适体匹配的互补序列Q2，建立新的荧光信号转变机制，利用它们检测汞离子残留，目前未见报道。

发明内容
本发明的目的在于打破之前固有的基于T-Hg2+-T结构建立的检测方法和模式，开创汞离子新型的核酸适体，并利用荧光信号转化机制建立新的检测汞离子的方法，并将其应用于环境水中汞离子检测，达到快速、简便、准确、样品需求量少的检测目的。本发明的目的是这样实现的一种基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，是以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体与标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列构成荧光检测体系，其特征在于所述的汞离子核酸适体为源于镍离子RNA核酸适体的碱基序列合成的DNA碱基序列SEQ ID N0. 7中截取的第23位至第44位碱基序列，并对该部分碱基序列进行改造后获得，获得的汞离子核酸适体是由27 28个碱基组成的茎环结构，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，所述互补序列Q2的碱基序列为SEQ ID N0. I ;荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法为
a)将以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2按照浓度比1: 2^4投放在bufferA缓冲液中，经过变性和复性，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测，记录荧光强度； b)将含有不同浓度汞离子的标样分别加入含有复合物的bufferA缓冲液，经过变性和复性，萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,分别进行荧光检测，记录与不同浓度汞离子标样对应的荧光强度，建立标准曲线，确定该复合物的相关系数、最小检出限以及线性检测范围，建立与线性检测范围对应的线性方程；
c)向含有复合物的bufferA缓冲液中加入待测物质，经过变性和复性，待测物质中的萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,进行突光检测，记录待测物质的荧光强度；
d)将待测物质的荧光强度与线性检测范围的标准曲线进行对照，通过标准曲线确定或通过线性方程计算得到待测物质中的汞离子残留量；
所用 bufferA 缓冲液的成分为50mM NaCl+7mM MgC12+50mM Tris/HCl, bufferA 缓冲液的 ΡΗ=7· 5 ；
所述的变性和复性是指在94°C变性5分钟，然后在25°C复性30分钟。在本发明中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指保留碱基序列SEQ ID N0. 7的第23位至第44位碱基，将保留段的第14位碱基A用碱基GC替换，然后在5’端增加碱基GG，在3’端增加碱基CCG，并将保留段中所有碱基U全部替换成碱基T，获得汞离子核酸适体NI，汞离子核酸适体NI的碱基序列为SEQ ID N0. 2 ；由汞离子核酸适体NI与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9993，最小检出限为O. 625ppm，线性检测范围I. 25_20ppm。在本发明中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基全部替换成碱基T，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N4，其碱基序列为SEQ ID N0. 3，由汞离子核酸适体N4与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9703，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。在本发明中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TCTTCTTGTT，再剪切SEQ ID N0. 2的剪切第28位碱基，获得汞离子核酸适体N5，其碱基序列为SEQ ID Ntj. 4，由汞离子核酸适体N5与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9909，最小检出限为O. 078ppm，线性检测范围O. 156-2. 5ppm。在本发明中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTCCCCTTTT，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N6，其碱基序列为SEQ ID N0. 5，由汞离子核酸适体N6与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9932，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。在本发明中，对碱基序列SEQ ID N。. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTGGGGTTTT再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N7，其碱基序列为SEQ ID N0. 6，由汞离子核酸适体N7与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9583，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 625-lOppm。在本发明中，所述的将以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2按照浓度比1: 2^4投放在bufferA缓冲液中形成复合物是指汞离子核酸适体的5’端标记荧光基团FAM，互补序列Q2的3’端标记有猝灭基团DABCYL，它们按照浓度比为1: 2^4的比例投放在bufferA缓冲液中，94°C变性5分钟，25°C下复性30分钟后，它们之间通过氢键的结合作用在bufferA缓冲液中形成复合物；所述的以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测是指取出检测对象50 μ I置于96微孔板中利用荧光检测仪器进行检测。本发明的优点在于本发明涉及的汞离子核酸适体是源于镍离子的改造核酸适体，它具有由27 28个碱基，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，对汞离子具有较好的结构识别功能，基于碱基T与汞离子特异性结合的机理，在对汞离子核酸适体的改造过程中，强化了碱基Τ，加强了核酸适体与汞离子的结合活性，因此本发明涉及的核酸适体同时兼有对汞离子结构识别和碱基结合功能。本发明的优点还在于本发明采用荧光标记寡核苷酸建立荧光检测汞离子的方法，并将其应用于环境水中加标检测，具有背景值小，检测信号高，检测体系稳定，抗基质干扰能力强，检测体系及样品需求量少(每个样各需50 μ 1)，检测总时间为45分钟，检测通量可达30样/板(以96孔，I个样做3个重复计算)，汞离子的最低检出限为78ppb。


图I汞离子核酸适体NI和镍离子核酸适体DNAl-B的DNA 二级茎环结构。其中a为汞离子核酸适体NI ；b为镍离子核酸适体DNAl-B
图2是核酸适体NI荧光猝灭体系的荧光强度变化值与汞离子浓度的关系。图3是核酸适体NI改造后的几种DNA 二级茎环结构，其中a为核酸适体N4 ;b为核酸适体N5 ；c为核酸适体N6 ；d为核酸适体N7。图4是改造后适体荧光猝灭体系的荧光强度变化值与汞离子浓度的关系。图5是核酸适体N5荧光猝灭体系与不同金属离子结合后荧光强度变化值。图6镍离子核酸适体DNAl-IB和汞离子核酸适体N5建立的检测体系与汞离子作用的比较。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的描述。实施例I
汞离子核酸适体NI的构建
首先按照文献报道的镍离子RNA核酸适体的碱基序列参照文献Hofmann, H P, Limmer S，Hornung V, Sprinzl M. RNA, 1997，3: 1289 1300 记载的方法合成其 DNA 序列，其碱基序列为SEQ ID N0. 7
5， -AUAGUCAGGGAACAUGACAAACACAGGGACUUGCGAAAAUCAGUGUUUUG -3'该碱基序列自定义为DNAl-B。构建汞离子核酸适体NI时，保留DNAl-B的第23位至第44位碱基，将保留段第14位碱基A (相当于DNAl-B的第36位碱基)用GC替换(使该处增加了一位碱基)，最后在5’端增加碱基GG，同时在3’端增加碱基CCG，并将保留段中所有碱基U全部替换成碱基T，即得到汞离子核酸适体NI，其碱基序列为SEQ ID N0. 2
5’ - GGACAGGGACTTGCGGCAAATCAGTCCG-3’。NI和DNAl-B的二级结构见图I，其中，NI拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，
实施例2
利用核酸适体NI建立荧光检测体系
合成与核酸适体NI的互补序列Q2，其碱基序列为SEQ ID N0. I
5’ -GTCCCTGTCC-3’ ；
配制 bufferA 缓冲液50mM NaCl+7mM MgCl2+50mM Tris/HCl，缓冲液的 PH=7. 5 ；
荧光基团FAM，由上海捷瑞生物公司合成，并将它标记在核酸适体NI的5’端；
荧光猝灭基团DABCYL，由上海捷瑞生物公司合成，并将它标记在互补序列Q2的3’端。将标记有荧光基团FAM的核酸适体NI和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2分别以浓度比1:(T4 (核酸适体NI的终浓度为50nmol/L、互补序列Q2的终浓度依次分别为0、50、100、150、200nmol/L)投放在bufferA缓冲液中反应30分钟，在bufferA缓冲液中存在标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2时，它们会形成处于部分荧光猝灭或荧光猝灭状态的复合物，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，对室温(25°C)下直接反应30分钟的复合物(非变性)进行荧光检测(作为对照组)，在94°C变性5分钟，然后在室温(25°C)下复性30分钟再检测，分别将荧光强度结果记录在表I中，在表I中，F表示标记有荧光基团FAM的核酸适体NI，Q表示标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2。表I Q2与NI结合的浓度比及结合方式对荧光猝灭效率的影响
非变性 Normal变性 Denainration
"q ^荧光强度 I猝灭效率(％) ^焚光優度^猝灭效率(^)
Fluorescence Quenching Fluorescence Quenching __tensity__effect (° o)__tensity__effect (°o)_
09946-67=3 73,62__0__10504=148.16__0_
17137.33z14SJ7 28,24__4SS6.4=6S.13__53J8
23S 16=^02 __61-63__11114^55.59__89.42
3lS08=413.iS__S1S2__S20.27=3S.41__92.19
756=6.9394.00T65.33=47,2Q [ 92,72
由表I可见，当Q/F比值为2，经过变性复性过程的荧光猝灭效率达到89. 42%，荧光猝灭程度接近90%，因此，当Q/F比值为应该大于或等于2，即标记有荧光基团FAM的核酸适体NI和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2分别以浓度比在1:2飞之间为宜，鉴于当Q/F比值为3，经过变性复性过程的荧光猝灭效率达到92. 19%，荧光猝灭程度趋于饱和，因此选择这一参数为最佳条件。实施例3
核酸适体NI通过不同浓度汞离子建立的检测标准曲线。
荧光检测体系的构建方法与实施例2相同将NI与Q2按照1:3的比例混匀在bufferA缓冲液体系中(NI终浓度为150nmol/L、Q2终浓度为450nmol/L)。94°C变性5分钟，25°C下孵育30分钟，从体系中取出50u I,测定其荧光强度；然后再分别依次加入50 u I的汞离子标准液，汞离子浓度从160ppm到
0.156ppm进行2倍梯度稀释，并以等体积的bufferA缓冲液作为对照。5分钟后，在激发光波长495nm、发射光波长535nm下测各个孔的荧光强度。标准曲线见图2，由图2可见，核酸适体Ni与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为0. 9993，最小检出限为0. 625ppm，线性检测范围I. 25-20ppm。实施例4
基于核酸适体NI的几种改进
将核酸适体NI的第13 22位碱基全部替换成碱基T，再剪切NI的第28位碱基，获得核酸适体N4，核酸适体N4保留了核酸适体NI的二级茎环结构(见图3中的a)，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，其碱基序列为SEQ ID N0. 3
5’ - GGACAGGGACTTTTTTTTTTTTAGTCC -3’。对核酸适体NI的第13 22位碱基替换为TCTTCTTGTT，再剪切NI的剪切第28位碱基，获得核酸适体N5，核酸适体N5保留了核酸适体NI的二级茎环结构(见图3中的b)，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，其碱基序列为SEQ ID N0. 4
5’ - GGACAGGGACTTTCTTCTTGTTAGTCC -3’。对核酸适体NI的第13 22位碱基替换为TTTCCCCTTTT (在这个区段相比NI增加了一位碱基)，再剪切NI的第28位碱基，获得核酸适体N6，核酸适体N6保留了核酸适体NI的茎结构(见图3中的C)，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，其碱基序列为SEQ IDN0. 5
5’ - GGACAGGGACTTTTTCCCCTTTTAGTCC -3’。对核酸适体NI的第13 22位碱基替换为TTTGGGGTTTT (在这个区段相比NI增加了一位碱基)，再剪切NI的第28位碱基，获得核酸适体N7，核酸适体N7保留了核酸适体NI的二级茎环结构(见图3中的d)，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，其碱基序列为SEQ ID N0. 6
5’ - GGACAGGGACTTTTTGGGGTTTTAGTCC -3’。实施例5
NI的几种改进核酸适体通过不同浓度汞离子建立的检测标准曲线 按照Q/F比值为3建立含有复合物的bufferA缓冲液。检测标准曲线的构建方法与实施例3相同，几种改进核酸适体的检测标准曲线分别如下
核酸适体N4的检测标准曲线记录在图4a中，由图4a可见，它对汞离子残留量的相关系数为0. 9703，最小检出限为0. 156ppm，线性检测范围0. 3125_5ppm。核酸适体N5的检测标准曲线记录在图4b中，由图4b可见，它对汞离子残留量的相关系数为0. 9909，最小检出限为0. 078ppm，线性检测范围0. 156-2. 5ppm。核酸适体N6的检测标准曲线记录在图4c中，由图4c可见，它对汞离子残留量的相关系数为0. 9932，最小检出限为0. 156ppm，线性检测范围0. 3125_5ppm。
核酸适体N7的检测标准曲线记录在图4d中，由图4d可见，它对汞离子残留量的相关系数为0. 9583，最小检出限为0. 156ppm，线性检测范围0. 625-10ppm。由图4和图6可见，核酸适体N5建立的检测体系的线性检测范围为
0.156-2. 5ppm，检测灵敏度最高，说明核酸适体N5与核酸适体NI及另外3个由核酸适体NI改造后的核酸适体相比，它对汞离子具有更强的识别作用。实施例6 汞离子与其适体结合的特异性检测
为了考察本发明的选择性，配置了 5ppm的各个金属离子溶液，分别加入N5荧光猝灭体系中，再记录荧光强度变化值。具体过程如下N5与Q2按照1:3的比例混匀在bufferA缓冲液体系中(NI终浓度为150nmol/L、Q2终浓度为450nmol/L)，94°C变性5分钟，25°C下孵育30分钟后，取出50iU于13个孔中测荧光强度，再分别依次加入50iU的bufferA、50 ill 的 5ppm 的 Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cd2+、Ni2+、Pb2+、Cr2+、As2+、Hg2+，5 分钟后，测荧光强度，然后再于前12个空中均加入50iil、5ppm的Hg2+，记录荧光强度变化值。如图5所示，在所有待检测的金属离子中，只有Hg2+能使荧光强度明显上升，其他金属离子不起作用，但是当在其他金属离子中加入Hg2+后，荧光强度又明显上升，说明该方法对Hg2+具有良好的选择性。实施例7
采用实施例4改造的N5为核酸适体，采用实施例2的互补序列Q2作为核酸适体N5的互补序列。以实施例I中自定义的DNAl-B为对照核酸适体，其碱基序列为SEQ ID N0. 7，同时合成与核酸适体DNAl-B的对照互补序列Q1-B，其碱基序列为SEQ ID N0. 8
5’ -ATGTTCCCTGACTAT-3’。使用的荧光基团FAM、荧光猝灭基团DABCYL和缓冲液均与实施例2相同。将荧光基团FAM分别标记在核酸适体N5和对照核酸适DNAl-B的5’端，将荧光猝灭基团DABCYL分别标记在互补序列Q2和对照互补序列Ql-B的3’端。将标记有荧光基团FAM的核酸适体N5和对照核酸适体DNAl-B分别与其匹配的标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2和对照互补序列Ql-B按照物质的浓度比为1:3混匀到缓冲液中(N5和DNAl-B终浓度为150nmol/L、Q2和Ql-B终浓度为450nmol/L)，分别建立各自独立的荧光检测体系，在94°C变性5分钟，然后在25°C复性30分钟后，取出50 U I于3个孔中测荧光强度，然后再分别依次加入50iU的bufferA缓冲液、5ppm Hg2+、20ppmHg2+，10分钟后测荧光强度，同时N5作为对照，与DNAl-B做相同处理。如图6所示，随着Hg2+浓度的提高，DNAl-B荧光猝灭体系的荧光强度并没有明显变化，与不加Hg2+的一致，而N5荧光猝灭体系荧光值随着Hg2+浓度的提高而不断显著升高，说明DNAl-B对汞离子无识别能力。观察图I中NUDNAl-B和图3b中N5的结构可以发现尽管三者都具有茎环构成的二级结构，甚至NI的大部分碱基序列与DNAl-B相同，但由于核酸适体NI及N5拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，它们与镍离子核酸适体DNAl-B的茎环结构不同，导致其不能特异性识别汞离子，说明NI及其改造后的适体所特有的碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎是识别汞离子的活性部位。实施例8利用实施例4获得 的检测标准曲线，对待测物进行检测
采集江苏省农业科学院池塘水，将其通过0. 22 y m的滤膜过滤后，添加Hg2+标准液，配置成含终浓度分别为4ppm、2ppm、lppm Hg2+的水样品，再与实施例7中建立的N5的荧光检测体系反应，测定荧光强度变化值。在N5的荧光检测体系中加入待测物质，在94°C变性5分钟，然后在25°C复性30分钟，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测，记录待测物质的荧光强度；
如表2所示，池塘水样品中标准Hg2+回收率为85-90. 5%，准确性较好，
说明池塘水中的杂质对本发明检测Hg2+的干扰很小。将待测物质的荧光强度与实施例5获得的与N5的荧光检测体系对应的线性检测范围的标准曲线进行对照，通过标准曲线确定或通过线性方程计算得到待测物质中的汞离子残留量。表2池塘水样中Hg2+加标回收检测结果__
权利要求
1.一种基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，是以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体与标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列构成荧光检测体系，其特征在于所述的汞离子核酸适体为源于镍离子RNA核酸适体的碱基序列合成的DNA碱基序列SEQ ID N0. 7中截取的第23位至第44位碱基序列，并对该部分碱基序列进行改造后获得，获得的汞离子核酸适体是由27 28个碱基组成的茎环结构，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，所述互补序列Q2的碱基序列为SEQ ID N0. I ;荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法为 a)将以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2按照浓度比1: 2^4投放在bufferA缓冲液中，经过变性和复性，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测，记录荧光强度； b)将含有不同浓度汞离子的标样分别加入含有复合物的bufferA缓冲液，经过变性和 复性，萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,分别进行荧光检测，记录与不同浓度汞离子标样对应的荧光强度，建立标准曲线，确定该复合物的相关系数、最小检出限以及线性检测范围，建立与线性检测范围对应的线性方程； c)向含有复合物的bufferA缓冲液中加入待测物质，经过变性和复性，待测物质中的萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,进行突光检测，记录待测物质的荧光强度； d)将待测物质的荧光强度与线性检测范围的标准曲线进行对照，通过标准曲线确定或通过线性方程计算得到待测物质中的汞离子残留量； 所用 bufferA 缓冲液的成分为50mM NaCl+7mM MgC12+50mM Tris/HCl, bufferA 缓冲液的 ΡΗ=7· 5 ； 所述的变性和复性是指在94°C变性5分钟，然后在25°C复性30分钟。
2.根据权利要求I所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于对碱基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指保留碱基序列SEQ ID N0. 7的第23位至第44位碱基，将保留段的第14位碱基A用碱基GC替换，然后在5’端增加碱基GG，在3’端增加碱基CCG，并将保留段中所有碱基U全部替换成碱基T，获得汞离子核酸适体NI，汞离子核酸适体NI的碱基序列为SEQ ID Ntj. 2;由汞离子核酸适体NI与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9993，最小检出限为O. 625ppm，线性检测范围I. 25_20ppm。
3.根据权利要求2所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于对碱基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基全部替换成碱基T，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N4，其碱基序列为SEQ ID N0. 3，由汞离子核酸适体N4与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9703，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。
4.根据权利要求2所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于对碱基序列SEQ ID Ntj. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TCTTCTTGTT，再剪切SEQ ID N0. 2的剪切第28位碱基，获得汞离子核酸适体N5，其碱基序列为SEQ ID N0. 4，由汞离子核酸适体N5与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9909，最小检出限为O. 078ppm，线性检测范围O. 156-2. 5ppm。
5.根据权利要求2所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于对碱基序列SEQ ID %. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTCCCCTTTT，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N6，其碱基序列为SEQ ID N0. 5，由汞离子核酸适体N6与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9932，最小检出 限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。
6.根据权利要求2所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于对碱基序列SEQ ID %. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTGGGGTTTT再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N7，其碱基序列为SEQ ID N0. 6，由汞离子核酸适体N7与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9583，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 625_10ppm。
7.根据权利要求f6之一所述的基于核酸适体结构的荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法，其特征在于所述的将以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2按照浓度比1:2 4投放在bufferA缓冲液中形成复合物是指汞离子核酸适体的5’端标记荧光基团FAM，互补序列Q2的3’端标记有猝灭基团DABCYL,它们按照浓度比为1: 2^4的比例投放在bufferA缓冲液中，94°C变性5分钟，25 V下复性30分钟后，它们之间通过氢键的结合作用在bufferA缓冲液中形成复合物；所述的以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测是指取出检测对象50 μ I置于96微孔板中利用荧光检测仪器进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种基于核酸适体结构及荧光信号转变的机制检测汞离子残留的方法，是以标记有荧光素分子的汞离子核酸适体与标记有猝灭素的互补序列构成荧光检测体系，其中汞离子核酸适体由27~28个碱基组成的茎环结构，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，互补序列Q2的碱基序列为SEQIDNO.1；荧光检测体系检测汞离子残留的方法为加入系列浓度的汞离子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，根据荧光信号的变化来建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围，然后对待测样品进行加标检测，根据标准曲线判断样品中汞离子含量。本方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，样品需求量少，适用于实际样品中汞离子的检测。
文档编号G01N21/64GK102621120SQ201210095340
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者刘媛, 刘贤金, 张存政, 雷兆静 申请人:江苏省农业科学院