专利名称：一种炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型，及其在炭疽菌检测中的应用。
背景技术：
咖啡衆果炭疽病(coffeeberry disease)是由 Colletotrichum kahawaeJ. M. Waller et Bridge引起的咖啡上的一种毁灭性病害，病原菌属于真菌界(Fungi)、无性型真菌(Anamorphic fungi)、炭疽菌属(Colletotrichum),寄主主要有阿拉伯种咖啡(Coffea arabica),甘弗拉种咖啡(Coffea canephora),利比里亚种咖啡(Coffealiberica)。咖啡浆果炭疽病菌主要分布在安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非、刚果(布)、刚果(金)、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺达、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦、古巴等国家，严重影响这些国家咖啡种植业，造成的经济损失可达到60%，喀麦隆曾报 道造成损失高达90%。病菌可以浸染从花到成熟果子的所有时期。主要危害未成熟的咖啡浆果，刚开始会产生针尖大小的斑点，之后迅速扩大呈黑褐色，病部向下凹陷，产生黑色小颗粒，此为病菌的分生孢子盘。在高湿条件下，会溢出粉红色的粘状物，为病原菌的分生孢子团。有时有潜伏侵染的情形发生，即病原菌在幼果期侵入寄主，但未表现症状，而是在果实成熟过中逐渐表现症状。若花瓣被感染，则会在花瓣上产生深褐色病斑，花朵会提早凋谢；若病原菌浸染植株枝条，则会在枝条上形成黄褐色凹陷病斑，严重时呈坏疽状或溃疡状，病部以上的组织因水分运输受阻而呈萎凋状。病菌可依靠带菌咖啡果实、种子、种苗和病残体进行远距离传播。当病菌的孢子传入新地区，遇到合适的寄主，则通过寄主体表自然孔口或伤口浸染植株，发病植株上产生大量的分生孢子可进行再侵染，从而造成流行。咖啡衆果炭疽病菌最早是McDonald在1926年以及Rayner在1952年开始研究报道，他们报道了肯尼亚在咖啡幼果上发生一种严重的炭疽病，1969年Gibbs根据MEA上的菌落及形态特征认为咖啡上的炭疽菌分为4组,分别是ccm、cca、ccp和CBD ； 1970 年 Hindorf 将 ccp 鉴定为 C. acutatum, ccm 和 cca 鉴定为 C. gloeosporioides,而认为CBD的病原是C. coffeanum。但C. coffeanum这个种是1901年Noack根据从巴西咖啡上分离的炭疽菌而定名的，后来认为巴西没有咖啡浆果炭疽病菌，该病菌应该是C. gloeosporioides。直到1993年,Waller对大量的咖啡上的炭疽菌进行形态学和生理特性的观察，最后根据形态学特征和碳源代谢特性，咖啡上分离到炭疽病病原其中有一种不同于 C. gloeosporioides 而将其定名为 C. kawahae。可见，对于炭疽菌的鉴定非常困难，病原菌的形态特征差异很小，需要通过复杂的碳源代谢来进行区别。而分子生物学方法分析方面，目前ITS区段是研究最广泛的，但是已公开登录的序列错误率高且命名混乱，多非模式种序列，而且依靠单一的基因片段分析不足以解决其分类问题，也不能完全解决炭疽菌的分类问题。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术是20世纪80年代发展起来的一项新的质谱技术，用于完整细胞的大量的动态的蛋白质的分析，具有灵敏度高、高通量、高精确及高检测范围。非常适合研究蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子，该项技术对样品纯度要求不高，能耐受一定量的小分子象盐，去污剂等，可以直接分析菌体培养液、菌体，动物组织等非常复杂的生物样品。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于特异性识别炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型和包含该模型的蛋白质检测分析系统，以及该模型或分析系统在炭疽菌的检测鉴定中的应用。本发明的另一目的是提供一种高效、灵敏的炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型，该蛋白质指纹图谱模型根据多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，蛋白质的质荷比分别为1097、1777、
2551、2988、3381、3708、5492、6007、7144、8012。需要说明的是，上述质荷比的值是一组相对稳定的值，但是，本领域技术人员可以理解，在不同实验条件下，在这些数值的基础上进行的小数点值的变化，或者说其中个别值进行的0-1的数值变化，也属于本申请的保护范围。进一步的，蛋白质的质荷比及蛋白质波峰强度系数由激光解吸电离飞行时间质谱仪的软件统计分析得到。本发明还公开了一种包括上述蛋白质指纹图谱模型的蛋白质检测分析系统。本发明还公开了上述蛋白质指纹图谱模型或蛋白质检测分析系统在炭疽菌的检测或鉴定中的应用。本发明还公开了一种炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法，包括样品蛋白质芯片制备、激光解吸电离飞行时间质谱仪检测，以及样品蛋白质图谱比对，其中，样品蛋白质图谱比对是将激光解吸电离飞行时间质谱仪检测分析获得的样品蛋白质图谱，与本发明的蛋白质指纹图谱模型比较；或者将样品蛋白质图谱在本发明的蛋白质检测分析系统中比对。本发明实施方式的检测方法中，样品蛋白质芯片制备包括蛋白质样品溶液制备和点样，其中点样的步骤包括，先在质谱靶芯片上点蛋白质样品溶液，晾干后再点基质溶液。进一步的，检测方法中，基质溶液的溶剂为乙腈三氟乙酸无菌去离子水按体积比 I O. 02-0. 07 O. 93-0. 98 混合而成。进一步的，检测方法中，基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。本发明实施方式的检测方法中，蛋白质样品溶液的溶剂包括第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的至少一种；第一溶剂为70%的甲酸乙腈按体积比I : 0.8-1.2混合而成；第二溶剂为氯仿甲醇按体积比I : O. 8-1. 2混合而成；第三溶剂为0.1%的三氟乙酸异丙醇无菌去离子水按体积比I : I. 5-2. 5 2. 5-4混合而成。本发明实施方式的检测方法中，样品蛋白质图谱比对采用激光解吸电离飞行时间质谱仪自带的软件进行，且比对获得的Iog(Score)值为2. 3_3。由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于本发明的炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型是一种全新的，区别于现有的蛋白质指纹图谱的模型。该蛋白质指纹图谱模型包含炭疽菌的特异性的蛋白质图谱信息，具有特异识别作用，可用于商业化的检测分析系统，用以对炭疽菌的特异性检测或鉴定。本发明的炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法，将检测获得的样品蛋白质图谱与本发明提供的蛋白质指纹图谱模型进行比对，可以准确的定性检测出样品中的炭疽菌。为炭疽菌提供了一种灵敏度高、特异性强、检测效率高的检测方法，特别适用于口岸检验检疫等部门。


图I是本发明实施例中炭疽菌激光解吸电离飞行时间质谱检测的蛋白质指纹图
-i'TfeP曰。
具体实施方式

本申请的蛋白质指纹图谱模型是一种现有的蛋白质图谱中没有的，新的蛋白质指纹图谱；包括炭疽菌的蛋白质的质荷比信息以及与其对应的蛋白质波峰强度系数信息，蛋白质的质荷比分别为 1097、1777、2551、2988、3381、3708、5492、6007、7144、8012。其中，对应的蛋白质波峰强度系数是由激光解吸电离飞行时间质谱仪根据具体检测对象中对应的蛋白质的含量自动计算得出的；一般来说某个蛋白质的含量越高，其蛋白质波峰强度系数就越大，在质谱图中的波峰值就越高。由于不同的菌株或者同一菌株在不同时期在不同的检测条件下，其蛋白质波峰强度系数会有细微差异，因此，具体的蛋白质波峰强度系数值在本申请中不做具体限定。该蛋白质指纹图谱根据炭疽菌标准菌株的激光解吸电离飞行时间质谱检测获得的，具有特异识别作用，可用于炭疽菌的特异性检测或鉴定。同时，该蛋白质指纹图谱模型也可以用于商业化的蛋白质检测分析系统，用于炭疽菌的检测或鉴定。在此基础上，本申请提供了一种炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法，包括样品蛋白质芯片制备、激光解吸电离飞行时间质谱仪检测，以及样品蛋白质图谱比对。其中，样品蛋白质图谱比对即，将检测获得的样品的蛋白质图谱与本申请的提供的蛋白质指纹图谱模型比对，从而定性的判断样品中是否含有炭疽菌，即实现炭疽菌的检测。本申请中，样品蛋白质芯片制备包括蛋白质样品溶液制备和点样，其中点样的步骤包括，先在质谱靶芯片上点蛋白质样品溶液，晾干后再点基质溶液。需要指出的是，点样步骤中蛋白质样品溶液和基质溶液的顺序，主要是影响基质和样品形成结晶的均匀性，从而影响蛋白质图谱中质荷比对应的蛋白质波峰效果。本申请的点样步骤，使得基质和样品的结晶均匀，从而获得重复性好的蛋白质图谱。本申请中，基质溶液的溶剂为溶剂A、溶剂B、溶剂C中的至少一种；溶剂A包括乙腈三氟乙酸无菌去离子水按体积比I : O. 02-0. 07 O. 93-0. 98混合而成；溶剂B包括乙腈甲醇无菌去离子水按体积比I : O. 8-1. 2 0.8-1. 2混合而成；溶剂C包括乙腈乙醇无菌去离子水按体积比I : O. 8-1. 2 O. 8-1. 2混合而成。基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸、芥子酸中的至少一种。蛋白质样品溶液的溶剂包括第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的至少一种；第一溶剂为70%的甲酸乙腈按体积比I : O. 8-1. 2混合而成；第二溶剂为氯仿甲醇按体积比I : O. 8-1. 2混合而成；第三溶剂为0.1%的三氟乙酸异丙醇无菌去离子水按体积比1:1. 5-2. 5 2. 5-4混合而成。本领域技术人员熟知，在实际操作过程中，对上述基质溶剂或蛋白质溶剂的体积比进行适当调整同样可以满足本申请的要求；因此，在该范围外进行的，符合本领域技术人员认知的适当调整，仍然在本申请的体积比保护范围内。下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例一、材料I、供试菌株本研究供试的菌株(见表I)均为培养物，LC编号均为模式菌株，由中科院微生物所蔡磊教授提供，MYA4519购自ATCC菌种保藏中心，CBS396. 67购自CBS菌种保藏中心。
表I供试炭疽菌菌株
序号I菌株编号拉丁学名
1LC0082Colletotrichum kahawae
2CBS396. 67C. coffeanum
3MYA4519C. acutatum
4LC 0032C. fructicola
5LC 0033C. fructicola
6LC 0034C. siamense
7LC 0037C. asianum
8LC 0039C. hymenocallidis ~9 LC 0042 C. karstii
10 LC 0081C. gloeosporioides
~Π LC 0218C.horii
~12 LC 0220C. fragariae
13 LC 0937C. simmondsii2、实验试剂(I)基质溶液的溶质ct -氰基-4-轻基肉桂酸(HCCA ；Alpha-cyano-4hydroxy-cinnamic acid)，来源于德国Bruker Daltonics公司；芥子酸(SA ；Sanipinic acid)，来源于德国BrukerDaltonics 公司。
(2)其它试剂E. coli DH5 alpha standards (校准标准品，德国 Bruker Daltonics 公司)；分析纯无水乙醇(Ethanolabs)、琼脂粉、葡萄糖，来源于上海生工生物工程有限公司。3、主要仪器设备和材料质谱仪microflexMALDI TOF(德国 Bruker Daltonics 公司)；超声波清洗仪舒美KQ5200B型(昆山市超声波仪器有限公司)；Eppendorf 离心机δ481 (德国 Eppendorf 公司)；斡旋振荡器其林贝尔CL-861 ； 样品祀德国Bruker Daltonics 公司；高压灭菌锅HV 50 ；生物安全柜SC18 Rff 1800型；数显摇床KS501；电子天平PB602N、L220；离心机Spectrafuge24D ；Eppendorf离心管及tips,购自德国Eppendorf公司。4、主要试剂的配制(I)基质溶剂的配制按体积比进行如下溶剂的配制乙腈三氟乙酸无菌去离子水(50% : 2. 5% ； 47. 5% ) ο(2)基质溶液的配制准确称量5mgHCCA溶于500 μ L基质溶剂中，振荡使其尽量溶解，但离心管底部仍会有少量结晶，每次使用时均新鲜配置，饱和溶液约10mg/mL。(3)样品处理用溶剂的配制按照体积比进行如下溶剂的配置，混匀，室温放置使用a. 70% 甲酸100% 乙腈(I I);b.氯仿甲醇(1:1);c. O. I %三氟乙酸异丙醇水(I : 2 : 3)。二、实验方法I、样品的处理(I)菌丝体获取用消毒灭菌过的接种针挑取适量液体培养物于装有300 μ L灭菌去离子水的
I.5mL离心管中，振荡混匀，14000g离心3min，去除上清，再加入300 μ L灭菌去离子水振荡混匀，加入900 μ L无水乙醇振荡混匀，14000g离心2min，去除上清留沉淀菌丝体备用。(2)点样样品处理将获取的菌丝体分别重悬于50 μ L三种样品处理用溶剂[a溶剂.70%甲酸100%乙腈(I I) ;b溶剂·氯仿甲醇(I I) ;c溶剂.0. I %三氟乙酸异丙醇水(I : 2 : 3)]中，振荡混匀，在有冰袋降温的条件下超声波处理10min，14000g离心2min，取I μ L上清液点样于MALDI TOF样品板上，室温条件下晾干，再点加I μ L基质溶液[以HCCA为基质，乙腈三氟乙酸无菌去离子水(50% 2. 5% 47. 5% )为基质]。
2、蛋白质芯片点样吸取I μ L样品上清点样于MALDI TOF样品板上，室温条件下晾干，再直接点加入I μ L HCCA基质溶液覆盖于样品之上，室温条件下晾干上机检测。3、MALDI TOF MS 检测(I)设置仪器参数离子源I电压设置为20. 08KV,离子源2电压设置为18. 60KV,正离子检测方式，脉冲离子提取时间340ns，设置质量范围m/z值2000Da_19770Da，激光能量35%。(2)质量校正校正标准样品采用大肠杆菌(E. coli)DH5 alpha standards,在fIexControl中的calibration 中对 m/z 4364.33000,5095. 82000,5380. 39000,6254. 39000,6315. 19000 等
进行校正。4、图谱分析(I)图谱的调基MALDI TOF MS带有flexanalysis专业技术软件,在此软件中打开需要分析的图谱，点击工具栏 process,选择 subtract mass spectrum baseline。调基目的是使基线降低，比较直观。(2)图谱的标峰调基之后的图谱，点击工具栏Method,点击open,选择proteins5_20kDa. FAMSMethod,点击工具栏 Mass List 选择 find。对其他图谱同样标峰，可以通过copy已标峰图谱，然后选定待标峰图谱pastespecial,选择method,后点击工具栏Mass List选择find。标峰的目的是使主要信号峰的m/z值显示，比较直观。(3)图谱的矫正打开标准图谱和待校正的图谱，选定标准图谱，点击工具栏Calibrate,选择copyCalibration,选定需要校正的图谱文件，点右键选择Replace Calibration。对标品的m/z进行校正可以在工具栏Calibrate中选择internal后在MassControl 中选择 E. coli DH5 alpha standards 进行校正。矫正的目的是为了使图谱更加准确。三、蛋白质指纹图谱模型的建立采集不同批次的Colletotrichum kawahae炭疽菌检测图谱20张，采用MALDITOF MS自带的Biotyper专业技术软件,对20张图谱进行综合分析,得出炭疽菌的特异性识别图谱，从而建立具有特异性识别作用的蛋白质指纹图谱模型；即，蛋白质的质荷比分别为 1097. 594,1777. 133,2551. 820,2988. 099,3381. 554,3708. 773,5492. 821,6007. 389、7144. 144,8012. 514的蛋白质波峰图。该蛋白质指纹图谱模型可单独的用于炭疽菌的检测鉴定，或者，整合到其它商业用途的蛋白质检测分析系统或数据库，用于炭疽菌的检测鉴定。四、炭疽菌检测采用上述“实验方法”对样品进行检测，获得样品菌株的质谱分析图谱，采用MALDITOF MS自带的软件与本实施例建立的炭疽菌蛋白质指纹图谱模型比对，若全部峰值均严格的与本实施例建立的模型相同，则该样品中含有炭疽菌；若与本实施例的模型存在细微差另|J，则通过软件计算得到一个log(score)值,log (score)值2. 3-3之间则该样品中含有炭疽菌。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种炭疽菌的蛋白质指纹图谱模型系统，其特征在于包括炭疽菌的蛋白质的质荷比信息以及与其对应的蛋白质波峰强度系数信息，所述蛋白质的质荷比分别为1097、1777、2551、2988、3381、3708、5492、6007、7144、8012。
2.根据权利要求I所述的蛋白质指纹图谱模型系统，其特征在于所述蛋白质的质荷比及蛋白质波峰强度系数由激光解吸电离飞行时间质谱仪的软件统计分析得到。
3.一种包括权利要求I或2所述的蛋白质指纹图谱模型的蛋白质检测分析系统。
4.权利要求I或2所述的蛋白质指纹图谱模型在炭疽菌的检测或鉴定中的应用。
5.一种炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法，包括样品蛋白质芯片制备、激光解吸电离飞行时间质谱仪检测，以及样品蛋白质图谱比对，其特征在于所述样品蛋白质图谱比对是将激光解吸电离飞行时间质谱仪检测分析获得的样品蛋白质图谱，与权利要求I或2所述的蛋白质指纹图谱模型比较；或者在权利要求3所述的蛋白质检测分析系统中比对。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述样品蛋白质芯片制备包括蛋白质样品溶液制备和点样，所述点样的步骤包括，先在质谱靶芯片上点蛋白质样品溶液，晾干后再点基质溶液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述基质溶液的溶剂为，乙腈三氟乙酸无菌去离子水按体积比I : 0.02-0.07 O. 93-0. 98混合而成。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述蛋白质样品溶液的溶剂包括第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的至少一种； 第一溶剂为70%的甲酸乙腈按体积比I : O. 8-1. 2混合而成； 第二溶剂为氯仿甲醇按体积比I : O. 8-1. 2混合而成； 第三溶剂为O. I %的三氟乙酸异丙醇无菌去离子水按体积比I I. 5-2. 5 2. 5-4 混合而成。
10.根据权利要求5-9任一项所述的检测方法，其特征在于所述样品蛋白质图谱比对获得的log score值为2. 3-3。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质指纹图谱模型，该模型根据多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成，其质荷比分别为1097、1777、2551、2988、3381、3708、5492、6007、7144、8012。本发明还公开了基于该模型的蛋白质检测分析系统，及炭疽菌的激光解吸电离飞行时间质谱检测方法。该检测方法中，将样品的蛋白质图谱与本发明的模型比对，从而定性的检测样品中的炭疽菌。本发明的蛋白质指纹图谱模型包含炭疽菌的特异性的蛋白质图谱信息，具有特异识别作用，可用于商业化的炭疽菌的检测分析系统。本发明为炭疽菌提供了一种灵敏度高、特异性强、检测效率高的检测方法，特别适用于口岸检验检疫等部门。
文档编号G01N27/64GK102818837SQ20121011216
公开日2012年12月12日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者程颖慧, 王颖, 章桂明 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心