专利名称：确定肿瘤分化等级的方法
技术领域：
本发明涉及确定肿瘤分化等级的方法。更特别的，本发明涉及通过筛选其表达水平与肝细胞癌(HCC)的各个分化等级相关的基因和/或蛋白，测定各个分化等级中人肿瘤组织的基因和/或蛋白的表达从而确定肿瘤分化等级的方法。本发明还涉及使用这些基因和/或蛋白在诊断HCC的分化等级和筛选用于HCC治疗的抗癌剂中的用途。
本发明还涉及用于实施本发明方法的试剂盒，其包括DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白阵列、RNA印迹法(northern blotting)、原位杂交、RNase保护试验、蛋白质印迹法(western blotting)、ELISA试验、反转录聚合酶链反应(下文表示为RT-PCR)所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、多肽、抗体、探针和引物，以测定表达水平与肿瘤分化等级相关的基因和/或蛋白的表达。
背景技术：
癌症是世界上主要的死亡原因。特别的，肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的癌症之一，其由于在许多国家增长的发病率而成为一个主要的国际性健康问题(Schafer，D.F.and Sorrell，M.F.Hepatocellular carcinoma，Lancet353，1253-1257(1999)，Colombo，M.Hepatitis C virus and hepatocellularcarcinoma，Semin.Liver Dis.19，263-269(1999)，和Okuda，K.Hepatocellularcarcinoma，J.Hepatol.32，225-237(2000))。慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染与乙型肝炎病毒(HBV)感染、酒精消耗(alcohol consumption)以及几种致癌物质如黄曲霉毒素B1一样是主要的HCC危险因子之一(Okuda，K.Hepatocellularcarcinoma，J.Hepatol.32，225-237(2000))。已经有几种治疗方法被用于HCC的治疗。这些方法包括外科切除、放射性疗法、化学疗法和包括激素和基因治疗在内的生物疗法。然而，这些治疗方法均无法治愈该疾病。HCC治疗的主要问题之一是在该疾病的发展和进展期间癌细胞特性的变化。特别的，肿瘤细胞分化等级的变化是明显而且频繁的。该变化改变了肿瘤细胞侵害(invade)和转移的能力以及癌细胞对不同治疗的敏感性，其导致对抗癌剂(agents)的抗性。如果准确诊断和控制癌细胞特性的变化，癌症治疗将会更加的有效。
先前的研究表明在肝癌发生中涉及肿瘤抑制基因和致癌基因如p53、β-连环蛋白(β-catenin)和AXIN1基因(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，Furukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomasusing cDNA microarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesisand tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001))。人们还认为，HCV相关HCC的发展可以表示为从早期到进展期肿瘤的病理进展，其与癌细胞的去分化相关联(Kojiro，M.Pathological evolution of early hepatocellularcarcinoma，Oncology 62，43-47(2002))。特别是将DNA微阵列技术引入医学后(Schena，M.，Shalon，D.，Davis，R.W.，and Brown，P.O.Quantitativemonitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray，Science 270，467-470(1995)，DeRisi，J.，Penland，L.，Brown，P.O.，Bittner，M.L.，Meltzer，P.S.，Ray，M.，Chen，Y.，Su，Y.A.，and Trent，J.M.Use of a cDNAmicroarray to analyse gene expression pattems in human cancer，Nat.Genet.14，457-460(1996))，许多研究显示了涉及HCC某些方面的基因表达谱(gene-expression patterns)(Lau，W.Y.，Lai，P.B.，Leung，M.F.，Leung，B.C.，Wong，N.，Chen，G.，Leung，T.W.，and Liew，C.T.Differential gene expression ofhepatocellular carcinoma using cDNA microarray analysis，Oncol.Res.12，59-69(2000)，Tackels-Horne，D.，Goodman，M.D.，Williams，A.J.，Wilson，D.J.，Eskandari，T.，Vogt，L.M.，Boland，J.F.，Scherf，U.，and Vockley，J.G.Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma andmetastatic liver tumors by oligonucleotide expression profiling，Cancer92，395-405(2001)，Xu，L.，Hui，L.，Wang，S.，Gong，J.，Jin，Y.，Wang，Y.，Ji，Y.，Wu，X.，Han，Z.，and Hu，G.Expression profiling suggested a regulatory role ofliver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma，CancerRes.61，3176-3681(2001)，Xu，X.R.，Huang，J.，Xu，Z.G.，Qian，B.Z.，Zhu，Z.D.，Yan，Q.，Cai，T.，Zhang，X.，Xiao，H.S.，Qu，J.，Liu，F.，Huang，Q.H.，Cheng，Z.H.，Li，N.G.，Du，J.J.，Hu，W.，Shen，K.T.，Lu，G.，Fu，G.，Zhong，M.，Xu，S.H.，Gu，W.Y，Huang，W.，Zhao，X.T.，Hu，G.X.，Gu，J.R.，Chen，Z.，and Han，Z.G.Insightinto hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing geneexpression profiles of hepatocellular carcinoma with those of correspondingnon-cancerous liver，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，15098-15094(2001)，Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，Furukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression inhuman hepatocellular carcinomas using cDAN microarrayidentification ofgenes involved in viral carcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)，Shirota，Y.，Kaneko，S.，Honda，M.，Kawai，H.F.，andKobayashi，K.Identification of differentially expressed genes in hepatocellularcarcinoma with cDNA microarrays，Hepatology 33，832-840(2001)，Delpuech，O.，Trabut，J.B.，Carnot，F.，Feuillard，J.，Brechot，C.，and Kremsdorf，D.Identification，using cDNA macroarray analysis，of distinct gene expressionprofiles associated with pathological and virological features of hepatocellularcarcinoma，Oncogene 21，2926-2937(2002)，Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison ofgene expression profiles between hepatitis B virus-and hepatitis C virus-infectedhepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray data based on asupervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)，and Midorikawa，Y.，Tsutsumi，S.，Taniguchi，H.，Ishii，M.，Kobune，Y.，Kodama，T.，Makuuchi，M.，and Aburatani，H.Identification of genes associated with dedifferentiation ofhepatocellular carcinoma with expression profiling analysis，Jpn.J.Cancer Res.93，636-643(2002))。它们中，两个研究表明HCC的基因表达与其发展相关(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，Furukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wide analysis of geneexpression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)and Midorikawa，Y.，Tsutsumi，S.，Taniguchi，H.，Ishii，M.，Kobune，Y.，Kodama，T.，Makuuchi，M.，and Aburatani，H.Identification of genes associated with dedifferentiation of hepatocellularcarcinoma with expression profiling analysis，Jpn.J.Cancer Res.93，636-643(2002))。然而，不清楚在与HCV相关的HCC的肿瘤形成和发展过程中表征和/或调控HCC各个分化等级的基因和/或蛋白。调控HCC分化等级的基因和/或蛋白可以用于诊断HCC的分化等级和筛选用于治疗由慢性HCV感染所引起的HCC的抗癌剂。
在本发明中，发明人描述了一种诊断肿瘤分化等级和筛选用于其治疗的抗癌物质的方法。特别的，发明人描述了一种识别40个或更多其表达与HCC分化等级相关的基因和/或蛋白，并且应用这些基因和/或蛋白诊断HCC的分化等级和筛选用于不同等级HCC治疗的抗癌物质的方法。更特别的，发明人描述了一种用40个基因和/或蛋白预测非癌肝脏(non-cancerousliver)，癌前肝脏(pre-cancerons liver)以及HCC每个分化等级的方法。
发明的公开发明概述肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的癌症之一。然而，还没有能够治愈该疾病的治疗方法。这估计是由于在疾病的发展和进展过程中癌细胞的特性连续改变。特别地，癌症的进展通常与肿瘤细胞分化等级的变化相关。诊断和控制癌细胞的这种变化可以使得癌症治疗更加有效。在本发明中，通过代表来自50个丙型肝炎病毒(HCV)相关的HCC组织和11个无肿瘤(非癌和癌前)肝脏组织的大约11,000个基因的寡核苷酸微阵列来识别其表达与HCC的肿瘤的生成和发展相关的基因。
分化状态划分为5个等级。
非癌肝脏(L0)是组织学上正常并且对乙型肝炎病毒表面抗原和HCV抗体均呈血清反应阴性的肝脏。癌前肝脏(L1)是HCV感染并且组织病理学诊断为慢性肝炎或肝硬化的肝脏。良好(well)分化的HCC(G1)是由癌细胞组成的HCC，癌细胞的特征为细胞密度增长，以及与正常肝细胞相比具有升高的细胞核/细胞质比率，但是显示与正常肝细胞类似的形态学。中等(moderately)分化的HCC(G2)是由大并且含染色质多的(hyperchromatic)癌细胞组成的HCC。在G2等级的癌细胞巢中具有小梁(trabecular-)或腺(gland-)样的结构。不良(poorly)分化的HCC(G3)是由多形的或多核的癌细胞组成的HCC。在G3等级肿瘤生长为缺乏有序排列的实体或细胞巢。G1、G2和G3肿瘤分别对应于Edmondson和Steiner分类的类型I、II和III(Edmondson，H.A.and Steiner，P.E.Primary carcinoma of the livera study of 100 cases among48，900necropsies，Cancer7，462-504(1954))。
一种有监督的学习方法(supervised learning method)，并随后进行寡核苷酸微阵列数据的随机排列检验被用于筛选在从没有HCV感染的非癌肝脏(L0)到有HCV感染的癌前肝脏(L1)、从L1到良好分化的HCC(G1)、从G1到中等分化的HCC(G2)和从G2到不良分化的HCC(G3)的转变期间其表达明显变化的基因。具有所有筛选出的40个其表达在各个转变阶段明显改变的基因的自编图谱(self-organizing map)能够正确地预测肿瘤组织的分化等级。因此，这些基因能够用于诊断HCC的分化等级和筛选用于在每个分化等级治疗HCC的抗癌剂。
发明详述在本发明中，利用了人肝细胞癌(HCC)组织和非肿瘤(非癌或癌前)肝脏组织。利用有HCV感染的HCCs分析HCCs。HCV和/或HBV感染的存在可以通过针对抗HCV抗体和抗HBV抗体的免疫反应性或通过用PCR扩增HCV和/或HBV基因组进行检测。HCC的分化等级可以通过组织病理学检查进行检测，HCCs被划分为良好分化HCC(G1)、中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)。非肿瘤肝脏样本可以从因良性的或转移的肝脏肿瘤而进行肝脏切除的患者中获得。没有HCV感染的肝脏样本被分类为非癌肝脏(L0)，有HCV感染的肝脏样本被分类为癌前肝脏(L1)。在外科手术中切除肝脏组织后，优选立刻将组织在液氮或含有干冰的丙酮中冰冻并且保存于-70和-80℃之间直至使用。该组织可以或可以不包埋于O.C.T化合物中(Sakura-Seiki，Tokyo，Japan，目录号4583)。
HCC组织和非肿瘤肝脏组织的基因和/或蛋白的表达可以通过测量RNA和/或蛋白的水平进行分析。在大多数情况下，通过测量来自包括荧光素和若丹明(rhodamine)在内的物质的荧光、来自鲁米诺(luminole)的化学发光、包括3H、14C、35S、33P、32P和125I在内的放射性物质的放射性和光密度来检测RNA和/或蛋白水平。例如，通过已知的方法包括DNA微阵列(Schena，M.et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray，Science270，467-470(1995)and Lipshutz，R.J.et al.High density synthetic oligonucleotide arrays，Nat.Genet.21，20-24(1999))、RT-PCR(Weis，J.H.et al.Detection of rare mRNAs viaquantitative RT-PCR，Trends Genet.8，263-264(1992)and Bustin，S.A.Absolutequantification of m RNA using real-time reverse transcription polymerase chainreaction assays，J.Mol.Endocrinol.25，169-193(2000))、RNA印迹法(northernblotting)和原位杂交(Parker，R.M.and Barnes，N.M.mRNAdetection in situand northern hybridization，Methods Mol.Biol.106，247-283(1999))、RNase保护试验(Hod，Y.A.Simplified ribonuclease protection assay，Bio Techniques 13，852-854(1992)and Saccomanno，C.F.et al.A faster ribonuclease protectionassay，Bio Techniques 13，846-850(1992))、蛋白质印迹法(westernblotting)(Towbin，H.et al.Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，4350-4354(1979)and Burnette，W.N.Western blottingElectrophoretic transferof proteins form sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodifiednitrocellulose and radioiodinated protein A，Anal.Biochem.112，195-203(1981))、ELISA试验(Engvall，E.and Perlman，P.Enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA)Quantitative assay of immunoglobulin G，Immunochemistry 8，871-879(1971))和蛋白阵列(Merchant，M.and Weinberger，S.R.ReviewRecent advancements in surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，Electrophoresis 21，1164-1177(2000)and Paweletz，C.P.et al.Rapid protein display profiling ofcancer progression directly from human tissue using a protein biochip，Drug Dev.Res.49，34-42(2000))来检测RNA和/或蛋白的表达水平。
通过比较各个分化等级的HCC组织和非肿瘤肝脏组织中基因和/或蛋白的表达水平筛选出在HCC各个分化等级和非肿瘤(非癌和癌前)肝脏中加以有差别地表达的基因和/或蛋白。通过比较非癌肝脏组织和癌前肝脏组织之间各个基因和/或蛋白的表达水平，来识别非癌肝脏(L0)和感染有HCV的癌前肝脏(L1)之间区别表达的基因和/或蛋白。通过比较癌前肝脏组织和良好分化的HCC组织(HCC(G1))之间各个基因和/或蛋白的表达水平，来识别癌前肝脏(L1)和良好分化的HCC(G1)之间区别表达的基因和/或蛋白。通过比较HCC(G1)和中等分化的HCC组织(HCC(G2))之间各个基因和/或蛋白的表达水平，来识别良好分化的HCC(G1)和中等分化的HCC(G2)之间区别表达的基因和/或蛋白。类似的，通过比较HCC(G2)和不良分化的HCC组织(HCC(G3))之间各个基因和/或蛋白的表达水平，来识别中等分化的HCC(G2)和不良分化的HCC(G3)之间区别表达的基因和/或蛋白。
可以通过已知的统计学分析方法分析和检测非癌肝脏、癌前肝脏、良好分化HCC、中等分化HCC和不良分化HCC的基因和/或蛋白在表达水平上的差异。在所有比较选自L0、L1、G1、G2和G3的两个等级之间的基因和/或蛋白表达水平的实验中，均采用下述步骤。
第一步，筛选出在所有HCC样本和在非癌和癌前肝脏样本中具有一定表达水平的基因和/或蛋白(例如根据Affymetrix基因芯片结果的规定单位判断表达水平大于40的基因)。该筛选获得了一定数量的基因和/或蛋白。而后，通过Fisher比率测定各个基因和/或蛋白从L1中区分L0、从G1中区分Ll、从G2中区分G1以及从G3中区分G2的分辨能力。基因j的Fisher比率通过下式给出F(j)=(μj(A)-μj(B))2σ2j(A)+σ2j(B)]]>其中μj(i)为等级i的样本中基因j表达水平的样本平均值，σ2j(i)为等级i的样本中基因j表达水平的样本方差。
第二步，筛选出的基因和/或蛋白根据Fisher比率数值递减的顺序排序。还进行随机排列检验以决定确定HCC分化等级的基因和/或蛋白的数量。在排列检验中，样本标签随机排列于要被比较的两个等级之间，并重新计算每个基因和/或蛋白的Fisher比率。样本标签的随机排列重复进行1,000次。从实际数据中获得的Fisher比率被设定为基于随机数据的Fisher比率分布的Ps。从基于随机数据的Fisher比率的分布，筛选通过随机排列检验测定的在两个等级之间具有统计学差异的基因和/或蛋白。更特别的，筛选随机排列检验中两个等级之间P值小于0.005的基因和/或蛋白。在这些筛选出的基因和/或蛋白中，进一步筛选出在非癌肝脏(L0)和癌前肝脏(L1)、癌前肝脏(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之间的每个比较中具有最高Fisher比率的40个基因和/或蛋白。
利用最小距离分类法(minimum distance classifier)和自编图谱(SOM)验证筛选获得的40个基因和/或蛋白从癌前肝脏(L1)中区分非癌肝脏(L0)、从良好分化HCC(G1)中区分癌前肝脏(L1)、从中等分化HCC(G2)中区分良好分化HCC(G1)、从不良分化HCC(G3)中区分中等分化HCC(G2)的能力。
使用每个转变阶段中上述40个筛选获得的基因和/或蛋白来设计最小距离分类法使用来自两个等级的全部训练样本正规化每个基因和/或蛋白的表达水平以使得具有零平均值和单位方差。测量样本和每个均值向量之间的欧几理得距离(Euclidean distance)后，样本指定至最近的均值向量的等级。用在每个转化阶段中上述筛选获得的40个基因和/或蛋白创建的最小距离分类法也可用于预测分化等级尚未测定的HCC样本的分化等级。为了诊断HCCs的分化等级，使用上文所述的μj(A)和μj(B)，由等级A和B组成的混合集合中基因j的样本均值μj由下式获得μj=NANA+NBμj(A)+NBNA+NBμj(B)]]>其中Nj为来自等级i的样本数量。接下来，由等级A和B组成的混合集合中基因j的样本方差σ2j由下式获得σ=1NA+NB-1[(NA-1)σ2j(A)+(NB-1)σ2j(B)+NANBNA+NB(μj(A)-μj(B))2]]]>使用μj和σ2j，μ和v定义为μ＝[μ1，μ2，...，μ40]T1σ1---0]]>V=1σ2]]>0---1σ40]]>
而后，样本x正规化为x＝VT(x-μ)其中x为正规化的样本。使用正规化样本，获得每个等级的样本均值向量。在最小距离分类法中，分值通过下式计算T1(x)＝‖x-μL0‖2-‖x-μL1‖2T2(x)＝‖x-μL1‖2-‖x-μG1‖2T3(x)＝‖x-μG1‖2-‖x-μG2‖2T4(x)＝‖x-μG2‖2-‖x-μG3‖2使用四个最小距离分类法，HCCs的分化等级可以如下进行诊断(i)如果T1(x)＜0、T2(x)＜0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么将正规化样本x分类到等级L0。
(ii)如果T1(x)＞0、T2(x)＜0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么将正规化样本x分类到等级L1。
(III)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＜0且T4(x)＜0，那么将正规化样本x分类到等级G1。
(iv)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＞0且T4(x)＜0，那么将正规化样本x分类到等级G2。
(v)如果T1(x)＞0、T2(x)＞0、T3(x)＞0且T4(x)＞0，那么将正规化样本x分类到等级G3。
SOM为一种广泛应用于聚类的神经网络算法，其公知为进行多维数据可视化的有效工具(Tamayo，P.et al.Interpreting patterns of gene expressionwith self-organizing mapsmethods and application to hematopoieticdifferentiation，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，2907-2912(1999)and Sultan，M.et al.Binary tree-structured vector quantization approach to clustering andvisualizing microarray data，Bioinformatics Suppl1，S111-S119(2002))。根据含有SOM工具箱(toolbox)的MATLAB R13的方法实现具有全部上述筛选获得的40个基因和/或蛋白的SOM，该工具箱可以从网址http//www.cis.hut.fi//projects/somtoolbox/获得(Kohonen，2001)。
其表达在从非癌肝脏(L0)到癌前肝脏(L1)、从癌前肝脏到良好分化HCC(G1)、从良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、从中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的转变期间明显改变的每组四十个基因和/或蛋白被用于诊断HCC的肝癌发生等级，并且还被用于筛选用于各个等级HCC治疗的抗癌剂。
其表达在从非癌肝脏(L0)到癌前肝脏(L1)、从癌前肝脏到良好分化HCC(G1)、从良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、从中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的转变期间明显改变的每组四十个基因和/或蛋白在细菌、真核细胞和无细胞体系(cell-free systems)中加以表达。通过监测表达和/或功能来筛选出影响基因和/或蛋白表达和/或功能的药剂。还获得蛋白的单克隆抗体并将其用于治疗不同等级的HCC。如同单克隆抗体一样，还可以获得纯化蛋白的完整小鼠单克隆抗体(whole mouse monoclonal antibodies)、人源抗体、嵌合抗体、单链抗体、二价单链抗体和/或双特异性抗体，并且它们被用于诊断HCC等级及其治疗。
还构建了检测基因和/或蛋白表达的试剂盒。该试剂盒由包括用于RNA提取的试剂、用于合成cDNA和cRNA的酶、DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、用于基因的探针和引物、对照基因的DNA片段和蛋白的抗体的成分组成。试剂盒的组成成分可以容易的从市场上购得。


图1图解了152个在从L0到L1的转变期间其表达明显改变的基因(a)、191个在从L1到G1的转变期间其表达明显改变的基因(b)、54个在从G1到G2的转变期间其表达明显改变的基因(c)和40个在从G2到G3的转变期间其表达明显改变的基因(d)表达的彩色显示。图板e、f、g和h图示了所有样本中所选的40个基因在每个转变阶段的表达。显示出所选的在从L0到L1(e)、从L1到G1(f)、从G1到G2(g)、从G2到G3(h)转变期间其表达明显改变的40个基因的表达。在每个转变阶段中所选的40个基因对转变之前和之后的样本加以区分。基因以Fisher比率的降序显示并且用GenBank登记号标示。
每个样本的名称标示在每个照片(e-h)的顶部；从左起为NL-64，NL-65，NL-66，NL-67，NL-68，NL-69，IL-49，IL-58，IL-59，IL-60，IL-62，G1-26T，G1-42T，G1-85T，G1-86T，G1-87T，G1-147T，G1-165T，G2-1T，G2-2T，G2-6T，G2-8T，G2-10T，G2-12T，G2-16T，G2-18T，G2-20T，G2-22T，G2-23T，G2-27T，G2-28T，G2-29T，G2-31T，G2-34T，G2-37T，G2-43T，G2-45T，G2-46T，G2-49T，G2-58T，G2-59T，G2-60T，G2-62T，G2-89T，G2-90T，G2-105T，G2-151T，G2-155T，G2-161T，G2-162T，G2-163T，G2-171T，G2-182T，G3-19T，G3-21T，G3-25T，G3-35T，G3-80T，G3-81T，G3-107T，G3-174T。
每个基因的名称标示在照片的右侧。在图板e中，从顶部起为M18533，AF035316，AL049942，L27479，“纤连蛋白，(Fibronectin)，Alt.剪接(Splice)1”，U19765，X55503，AL046394，AB007886，AL050139，AF012086，AI539439，M19828，U92315，D76444，X02761，AF001891，AI400326，AI362017，L13977，D32053，AF038962，AL008726，J03909，Z69043，AL080080，M63138，L09159，AF017115，M13560，M36035，U47101，U81554，M21186，D32129，AL022723，M83664，U50523，M81757，AF102803。在图板f中，从顶部起为M93221，AF079221，V01512，D88587 U12022，AF055376，R93527，R92331，U83460，AF052113，H68340，M10943，M13485，U75744，X02544，M93311，Z24725，U22961，M62403，M35878，U84011，AF055030，L13977，D13891，M63175，AB023157，U20982，M14058，AL049650，U61232，AI991040，U64444，D63997，X55503，AL080181，X76228，AB018330，D76444，U70660，U10323。在图板g中，从顶部起为M87434，M12963，AI625844，M97936，Z99129，L07633，D50312，U07364，AA883502，M97935，AF061258，AB007447，M97935，W28281，M97935，Y00281，D28118，AF104913，AA675900，L27706，D32050，M63573，AF014398，X70944，U70671，AA447263，AB014569，M23115，D38521，X00351，L11672，X82834，AB007963，U76247，X68560，AB015344，AB018327，AF004430，D14697，AB028449。在图板h中，从顶部起为AA976838，Z11793，AB002311，Y18004，AL031230，AF002697，AB014596，U49897，AF070570，M80482，AI263099，U22961，Z24725，U77594，L34081，M88458，U68723，X92098，D10040，AB023194，AF001903，X96752，AB006202，M75106，Y12711，D14662，S87759，Z48199，AF088219，AA453183，D31767，AB000095，AB006782，M21186，AB002312，U44772，AI541308，Z49107，U77735，M38449。
图2图示了所选的40个基因在每个转变阶段区分HCC分化等级的有效性(validation)。
在每个转变中，从L0到L1(a)，从L1到L2(b)，从G1到G2(c)，从G2到G3(d)，用显示为红色条状的连续两个分化等级中的样本(训练样本)构建最小距离分类法，并且应用于显示为黑色条状的余下分化等级中的样本(测试样本)。获得的分类法以92％(a)、98％(b)、84％(c)和100％(d)的准确率分类测试样本。
图3图示了在从非癌肝脏(L0)到癌前肝脏(L1)、从癌前肝脏到良好分化HCC(G1)、从良好分化HCC(G1)到中等分化HCC(G2)、从中等分化HCC(G2)到不良分化HCC(G3)的转变期间其表达改变的基因的自编图谱(SOM)算法分析结果。
图3a图示了样本的聚类(表1)。
SOM栅格中每个单元对应一个聚类。相邻单元的向量通常位于互相靠近的位置。
(m，n)，位于第m行第n列的单元的位标。
NL-XX，来自没有HCV感染的非癌肝脏(L0)的样本；IL-XX，来自HCV感染的癌前肝脏(L1)的样本；G1-XxT，来自良好分化HCC(G1)的样本；G2-XXT，来自中等分化HCC(G2)的样本；G3-XXT，来自中等分化HCC(G3)的样本。
图谱显示样本按照L0、L1、G1、G2和G3的顺序清晰地形成S形曲线(sigmoid curve)。没有血管缠绕(vessel involvement)的G2样本(蓝色字母)位于接近G1样本的位置，具有血管缠绕的G2样本(红色字母)位于接近G3样本的位置。
图3b图示了相邻聚类间的距离。
(m，n)，位于第m行第n列的单元的位标。
单元的颜色显示了相邻聚类间的距离；红色表示长距离。上部区域的红色单元清楚地表示非肿瘤(非癌和癌前)肝脏样本与HCC样本之间在所有所选的40个基因中相隔相对较远。
表1显示样本的聚类，其表示如图3a所示的L0、L1、G1、G2和G3。
表2显示本发明使用的HCC的临床病理学因素。
表3显示在L0和L1中最优的40个具辨别力基因。
表4显示在L1和G1中最优的40个具辨别力基因。
表5显示在G1和G2中最优的40个具辨别力基因。
表6显示在G2和G3中最优的40个具辨别力基因。
实施本发明的最佳模式下列实施例仅显示识别和使用在非癌肝脏、癌前肝脏、良好分化HCC、中等分化HCC和不良分化HCC中区别表达的基因和/或蛋白的优选方法。
在下文，本发明将使用实施例进行特别的描述，但是，其并不构成任何限定作用。
实施例1人组织的制备五十名患者于1997年5月至2000年8月间在Yamaguchi大学医院进行针对HCC的外科手术治疗(surgical treatment)。手术前已经获得所有患者的书面同意。研究协议通过了Yamaguchi大学医学院的“使用人类个体制度评审委员会”的批准。所有50个患者对HCV抗体(HCVAb)血清反应呈阳性，对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清反应呈阴性。手术后对所有病例进行HCC的组织病理学诊断。该组织病理学检查显示七名患者具有良好分化的HCC(G1)、35名具有中等分化的HCC(G2)、余下的八名具有不良分化的HCC(G3)。根据国际抗癌联盟TNM分类法检测临床病理学因子。使用Fisher′s精确检验(Fisher′s exact test)、Student′s t检验和Mann-Whitney′s U检验来阐明在三个等级G1、G2和G3的HCC之间临床病理特征的差异。P＜0.05被认为是统计学上有意义的。
六个非癌肝脏样本是从六名患者中获得，这六名患者因良性或转移的肝脏肿瘤进行肝脏切除，并被证实具有组织学上正常的肝脏。他们全部对HbsAg和HCVAb血清反应呈阴性。五个HCV感染的肝脏样本也是从五名患有HCC的患者的非肿瘤区域制备得到的。所有的五个肝脏样本被组织病理学诊断为慢性肝炎或肝硬化。手术前已获得所有患者的书面同意。
实施例2HCCs的临床病理特征组织学检测显示，在本研究使用的50个HCV相关的HCCs中，七个为良好分化的HCC(G1)、35个为中等分化的HCC(G2)、余下的八个为不良分化的HCC(G3)(表2)。G2和G3HCCs的肿瘤大小明显大于G1HCC的肿瘤大小(Mann-Whitney′s U检验中分别为p＝0.0007和p＝0.028)。在G2和G3HCCs中血管缠绕的发生率明显高于G1HCC中的发生率(Fisher′s精确检验中p＝0.038)。平行于从G1到G3的去分化，肿瘤阶段更为进展(Fisher′s精确检验中p＝0.066)。因此，正如Kojiro所提出的一样，本研究中使用的G1、G2和G3HCCs的每个类型均显示相应于去分化的特征，即肿瘤大小、迁移可能和肿瘤阶段(Kojiro，M.Pathological evolution of early hepatocellularcarcinoma，Oncology 62，43-47(2002))。
实施例3从组织中提取RNA组织块(大约125mm3)悬浮于TRIZOL(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号15596-018)或Sepasol-RNAI(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目录号306-55)中，用Polytron(Kinematica，Littau，Switzerland)匀浆两次(用最快速度进行五秒)。加入氯仿后，组织匀浆以15,000xg离心10分钟，收集含有RNA的水相。总的细胞RNA用异丙醇沉淀，用70％乙醇洗一次，悬浮于DEPC处理过的水(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号10813-012)中。用1.5单位的DNase I(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目录号18068-015)处理后，RNA用TRIZOL/氯仿再次提取，用乙醇沉淀，并溶解于DEPC处理过的水中。其后，根据厂商提供的用法指南使用RNeasy MiniKit(QIAGEN，Hilden，Germany，目录号74104)去除小分子量核苷酸。总RNA的品质根据琼脂糖凝胶电泳后28S和18S核糖体RNA的比率进行判断。纯化的总RNA于-80℃保存在70％的乙醇溶液中直至使用。
实施例4合成cDNA和标记cRNA探针根据厂商提供的用法指南使用反向SuperScript Choice System(LifeTechnologies，Gaithersburg，USA，目录号18090-019)合成cDNA。五微克纯化的总RNA与oligo-dT引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)杂交，所述引物含有T7启动子的序列和200单位的SuperScriptII逆转录酶，而后于42℃温育1小时。获得的cDNA用苯酚/氯仿提取并用Phase Lock GelTMLight(Eppendor，Hamburg，Germany，目录号0032005.101)纯化。
根据厂商提供的用法指南，通过使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion，Austin，USA，目录号1334)以cDNA为模板合成cRNA。大约5μg的cDNA在37℃与2μl的酶混合物一起培养6小时，酶混合物中含有T7聚合酶、腺苷三磷酸(ATP)和鸟苷三磷酸(GTP)各7.5mM、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)各5.625mM以及Bio-11-CTP和Bio-16-UTP各1.875mM(分别为，ENZO Diagnostics，Farmingdale，USA，目录号42818 and 42814)。通过使用CHROMA SPIN+STE-100柱(CLONTECH，Palo Alto，USA，目录号K1302-2)的柱层析去除单核苷酸和短的寡核苷酸，在洗出液中的cRNA通过加入乙醇进行沉淀。cRNA的品质根据琼脂糖凝胶电泳后cRNA的长度进行判断。纯化的cRNA于-80℃保存在70℃的乙醇溶液中直至使用。
实施例5在不同分化阶段HCC的基因表达分析使用高密度寡核苷酸微阵列(U95A阵列，Affymetrix，Santa Clara，USA，目录号510137)检测来自神经胶质瘤患者的人原发性肿瘤的基因表达(Lipshutz，R.L.et al.High density synthetic oligonucleotide arrays，Nat.Genet.21，20-24(1999))。为了在芯片上与寡核苷酸杂交，cRNA于95℃在缓冲液中断裂35分钟，该缓冲液中含有40mM Tris(Sigma，St.Louis，USA，目录号T1503)-乙酸(Wako，Osaka，Japan，目录号017-00256)(pH8.1)、100mM乙酸钾(Wako，Osaka，Japan，目录号160-03175)和30mM乙酸镁(Wako，Osaka，Japan，目录号130-00095)。杂交在200μl缓冲液中于45℃进行12小时，该缓冲液中含有0.1M 2-(N-吗啉代)甲磺酸(MES)(Sigma，St.Louis，USA，目录号M-3885)(pH6.7)、1M NaCl(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目录号313-20)、0.01％polyoxylene(10)辛基苯基醚(polyoxylene octylphenyl ether)(Wako，Osaka，Japan，目录号168-11805)、20μg鲱鱼精DNA(Promega，Madison，USA，目录号D181B)、100μg乙酰化牛血清蛋白(Sigma，St.Louis，USA，目录号B-8894)、10μgcRNA片段和生物素化的对照寡核苷酸，生物素-5′-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3′(Sawady technology，Tokyo，Japan)。用含有0.01M MES(pH6.7)、0.1M NaCl和0.001％polyoxylene(10)辛基苯基醚缓冲液的缓冲液洗芯片后，芯片与生物素化的抗链霉亲和素抗体(Funakoshi，Tokyo，Japan，目录号BA0500)共孵育并如用法指南所述用链霉亲和素R-藻红蛋白(Molecular Probes，Eugene，USA，目录号S-866)染色以增添杂交信号(Affymetrix，Santa Clara，USA)。用激光扫描仪(Affymetrix，Santa Clara，USA)收集每个象素水平，每个cDNA的表达水平和可靠性(存在/不存在比例)通过Affymetrix基因芯片3.3型和Affymetrix微阵列组4.0型软件进行计算。从这些实验中，检测了神经胶质瘤患者的人原发性肿瘤中大约11,000个基因的表达。
实施例6寡核苷酸微阵列数据的统计学分析筛选出在所有50个HCC样本和11个非肿瘤(非癌和癌前)肝脏样本中平均差额大于40(Affymetrix的规定单位)的基因。该步骤从大约11,000个基因中获得3,559个基因。然后，测定Fisher比率(Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepatitis B virus-and hepatitisC virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray databased on a supervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)andLuo，J.，Duggan，D.J.，Chen，Y.，Sauvageot，J.，Ewing，C.M.，Bittner，M.L.，Trent，J.M.，and Isaacs，W.B.Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasiamolecular dissection by gene expression profiling，Cancer Res.61，4683-4688(2001))，以将这些基因作为从L1中区分L0、从G1中区分L1、从G2中区分G1以及从G3中区分G2的辨别物进行评价。将上述3，559个基因按照Fisher比率数值的降序排列。进行随机排列检验以决定确定HCC分化等级的基因数量。随机排列检验的实施如前所述(Iizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepaitis B virus-and hepatitisC virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray databased on a supervised learning method，Cancer Res.62，3939-3944(2002)andLuo，J.，Duggan，D.J.，Chen，Y.，Sauvageot，J.，Ewing，C.M.，Bittner，M.L.，Trent，J.M.，and Isaacs，W.B.Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasiamolecular dissection by gene expression profiling，Cancer Res.61，4683-4688(2001))。在该检验中，样本标签随机排列于两个待考虑的等级间，并重新计算每个基因的Fisher比率。该样本标签的随机排列重复1,000次。从实际数据中获得的Fisher比率被设定为基于随机数据的Fisher比率分布的Ps。从基于随机数据的Fisher比率的分布，筛选所有可通过随机排列检验(P＜0.005)的基因。在所有比较两个等级的实验中进行该步骤。结果，152个Fisher比率高于4.90的基因是L0和L1之间有统计学意义的分辨物。类似的，识别了191个从G1中区分L1的Fisher比率高于4.08的基因，54个从G2中区分G1的Fisher比率高于1.52的基因，40个从G3中区分G2的Fisher比率高于1.34的基因。
实施例7筛选其表达与HCC分化等级相关的基因通过寡核苷酸阵列数据，分析肿瘤发生，即从非癌肝脏(L0)到HCV感染的癌前肝脏(L1)和从L1到良好分化HCC(G1)期间以及HCC去分化(G1到G2和G2到G3)期间基因表达的变化。通过有监督的学习方法并随后进行识别了152个其表达水平在从L0到L1的转变期间明显变化的基因。在这152个基因中，在该转变期间有67个上调，85个下调。用同样的方式，识别了191个表达水平在从L1到G1HCC的转变期间明显变化的基因。在这191个基因中，在该转变期间有95个上调，96个下调。54个基因在G1和G2HCCs之间显示不同的表达，它们中，在从G1到G2的转变期间36个基因的表达增加，18个基因的表达减少。40个基因在G2和G3HCCs之间产生不同的表达，它们中，在从G2到G3的转变期间10个基因的表达增加，30个基因的表达减少。
为了检测在肿瘤发生和HCC发展中每个等级所选基因的表现，发明人将这些基因的数据应用于所有的样本。结果，几乎所有的在每个转变阶段所选的基因均适用于L0-L1转变、L1-G1转变、G1-G2转变和G2-G3转变。例如，从G1HCC中区分L1的191个基因能够清楚的从HCCs(G1、G2和G3)中区分非肿瘤肝脏(L0和L1)(图1)。该结果显示所选基因加以变化了的水平在决定每个HCC病理等级中行使关键作用。
实施例8在从非癌症肝脏(L0)到癌前肝脏(L1)转变期间其表达变化了的基因在从L0到L1的转变期间，大部分免疫应答相关基因、代谢相关基因、转运相关基因、蛋白水解相关基因和肿瘤发生相关基因的表达增加，转录相关基因的表达降低(表3)。
免疫应答相关基因包括I类MHC家族(HLA-A、-C、-E和-F)、II类MHC家族(HLA-DPB1和HLA-DRA)、CD74、NK4、LILRB1、FCGR3B和IFI30。干扰素(IFN)可诱导的基因，如IFI30，的上调可以代表宿主对病毒感染的抵抗；然而，需要注意的是如下文章节所述的，几种IFN相关基因在G1到G2的去分化期间是降低的(见实施例10)。
代谢相关基因包括KARS、ALDOA、ASAH、MPI和GAPD。KARS和ALDOA水平的增加分别增强了蛋白生物合成和糖酵解。ASAH、MPI和GAPD的上调分别增加了脂肪酸、甘露糖和甘油醛的生物合成。
转运相关基因包括VDAC3、SSR4、BZRP和ATOX1。SSR4负责新合成的多肽的有效转运。ATOX1为铜转运体(copper transporter)，并且其表达的增强导致各种代谢途径的激活，因为许多酶需要铜离子作为酶活性的辅助因子。
蛋白水解相关基因包括CST3和CTSD。CST3涉及血管的形成。在可能发育出癌前肝小结(hepatic nodules)的肝硬化患者中观察到CTSD蛋白血清水平的增加(Leto，G.，Tumminello，F.M.，Pizzolanti，G.，Montalto，G.，Soresi，M.，Ruggeri，I.，and Gebbia，N.Cathepsin D serum mass concentrations inpatients with hepatocellular carcinoma and/or liver cirrhosis，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.34，555-560(1996))。
肿瘤发生相关基因包括MBD2、RPS19、RPS3、RPS15和RPS12。DNA甲基化是一种在许多恶性肿瘤中常见的后生(epigenetic)变化，因此，DNA甲基化模式通过甲基化和去甲基化的酶过程进行检测。MBD2的上调(所述MBD2抑制从甲基化DNA转录)在下调在启动子区域具有甲基化DNA的肿瘤抑制基因中起着重要作用。
在从L0到L1的转变过程中可以观察到转录相关基因，RB1CC1的下调。RB1CC1蛋白是肿瘤抑制基因RB1的主要调控因子，因此RB1CC1水平的下降能够通过降低RB1蛋白的活性促进肿瘤的发生。
因此，HCV感染的癌前肝脏的特征在于这些基因表达的改变，这表明肝癌发生的起始出现在HCV感染期间。在从L0到L1的转变期间其表达改变的基因中，那些涉及蛋白质水解和肿瘤形成的基因可以作为分子目标用于化学预防HCV相关的HCC。
实施例9在从癌前肝脏(L1)至良好分化HCC(G1)转变的过程中其表达改变的基因在从L1至G1改变的过程中其表达改变的基因包括大部分与肿瘤形成相关的基因、与信号转导相关的基因、与转录相关的基因、与转运相关的基因、与解毒作用相关的基因、以及与免疫应答相关的基因(表4)。
与肿瘤形成相关的基因，诸如能够诱导一些癌细胞凋亡的BNIP3L、FOS、MAF和IGFBP3，以及作为IGF诱导的细胞增殖的抑制剂的IGFBP4，其在转变的过程中被下调，这表明这些基因的下调对肝癌发生的促进也是重要的。之前的报道也显示出IGFBP3和IGFBP4在HCC中与非肿瘤肝脏相比表达降低(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y.，Tsunoda，T.，Furukawa，Y.，and Nakamura，Y.Genome-wideanalysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNAmicroarrayidentification of genes involved in viral carcinogenesis and tumorprogression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)and Delpuech，O.，Trabut，J.B.，Carnot，F.，Feuillard，J.，Brechot，C.，and Kremsdorf，D.Identification，usingcDNA macroarray analysis，of distinct gene expression profiles associated withpathological and virological features of hepatocellular carcinoma，Oncogene21，2926-2937(2002))。本发明的数据提供了另外的发现，这两种基因的下调在良好分化的HCC中已经出现。MAF作为细胞分化的调控因子发挥作用。BNIP3L通过抑制BCL2的活性诱导细胞凋亡。在一些情况下，FOS的表达似乎与凋亡细胞死亡相关。因此，这五种基因的下调可能在慢性HCV感染之后引发肝细胞的转变。
与信号转导相关的基因诸如CAMKK2、GMFB、RALBP1、CDIPT、ZNF259和RAC1，以及与转录相关的基因诸如DRAP1、ILF2、BMI1、和PMF1在从L1至G1转变的过程中被上调。其它与信号转导相关的基因诸如CALM1、RAB14、TYROBP、和MAP2K1在该转变中被下调。在G1 HCC中TYROBP的下调可以反映出减弱的免疫应答。涉及各种信号转导途径的基因表达的改变可以反映出起源于HCV感染的癌前肝脏的良好分化HCC的真实情况。
在从L1至D1转变的过程中，与转运相关的基因诸如TBCE、ATP6V1E、ATOX1和SEC61G被上调，而那些诸如SLC31A1和DDX19被下调。细胞内铜转运体(copper transporter)ATOX1在从L0至L1转变的过程中被上调，在从L1至G1转变的过程中进一步被上调。由于额外的铜对肝细胞而言是有毒的或者甚至是致死的，ATOX1基因的不同的表达改变了细胞内铜离子的浓度，因此促进了DNA损伤和细胞损伤。事实上，最近的研究显示出铜-鳌合剂试剂在鼠HCC异种移植模型中对肿瘤发展的预防作用(Yoshii，J.，Yoshiji，H.，Kuriyama，S.，Ikenaka，Y.，Noguchi，R.，Okuda，H.，Tsujinoue，H.，Nakatani，T.，Kishida，H.，Nakae，D.，Gomez，D.E.，De Lorenzo，M.S.，Tejera，A.M.，和Fukui，H.The copper-chelating agent，trientine，suppresses tumordevelopment and angiogenesis in the murine hepatocellular carcinoma cells，Int.J.Cancer.94，768-773(2001))。
DNA损伤和细胞损伤可能通过抗氧化剂基因CAT和与解毒作用相关的基因诸如MT1H、MT1E、MT1F、MT1B、MT3、和UGT2B7的下调而增加，从而促进HCC的去分化。
使用抗透明质烷受体-1抗体，Carreira等显示出在HCC中的淋巴管的数量比在非肿瘤肝脏组织诸如肝硬化中的少(Mouta Carreira，C.，Nasser，S.M.，di Tomaso，E.，Padera，T.P.Boucher，Y.，Tomarev，S.I.，and Jain，R.K.LYVE-1isnot restricted to the lymph vesselsexpression in normal liver blood sinusoidsand down-regulation in human liver cancer and cirrhosis，Cancer Res.61，8079-8084(2001))。在本发明中，与免疫应答相关的基因诸如ORM1、C1R、C6、IL4R、C8B、和C1S的表达在从L1至G1的转变过程中降低，表明在从L1至G1的转变过程中HCC内微环境发生了变化。如同之前报道的，编码补体组分的许多基因在该转变过程中被下调(Okabe，H.，Satoh，S.，Kato，T.，Kitahara，O.，Yanagawa，R.，Yamaoka，Y，Tsunoda，T.，Furukawa，Y，andNakamura，Y.Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellularcarcinomas using cDNA microarrayidentification of genes involved in viralcarcinogenesis and tumor progression，Cancer Res.61，2129-2137(2001)andIizuka，N.，Oka，M.，Yamada-Okabe，H.，Mori，N.，Tamesa，T.，Okada，T.，Takemoto，T.，Tangoku，A.，Hamada，K.，Nakayama，H.，Miyamoto，T.，Uchimura，S.，and Hamamoto，Y.Comparison of gene expression profiles between hepatitisB virus-and hepatitis C virus-infected hepatocellular carcinoma byoligonucleotide microarray data based on a supervised learning method，CancerRes.62，3939-3944(2002))。
实施例10在从良好分化HCC(G1)至中等分化HCC(G2)转变的过程中其表达改变的基因在从G1至G2转变的过程中其表达变化的基因包括与IFN相关的基因、与细胞结构和活动性相关的基因、与转录相关的基因、以及肿瘤抑制基因(表5)。
在从G1至G2的转变过程中，最显著的遗传学的改变似乎是与IFN相关的基因诸如OAS2、STAT1、PSME1、ISGF3G、和PSMB9的下调。在前列腺癌细胞中也观察到了类似的遗传学的改变(Shou，J.，Soriano，R.，Hayward，S.W.，Cunha，G.R.，Williams，P.M.，and Gao，W.Q.Expressionprofiling of a human cell line model of prostatic cancer reveals a directinvolvement of interferon signaling in prostate tumor progression，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，2830-2835(2002))。IFN不仅作为抗病毒试剂还作为抗癌试剂；然而，某种类型的HCC对IFN没有应答。与IFN相关的基因的下调可以减弱肿瘤细胞对IFN的应答，这暗示在从G1至G2的转变的过程中利用了HCC对IFN的抗药性。在与IFN相关的基因中，STAT1在我们的从G2中区分G1的辨别物列表中出现了四次(表5)。与相同家族的其它基因不同，STAT1功能为肿瘤抑制基因(Bromberg，J.F.Activation of STAT proteinsand growth control，Bioessays 23，161-169(2001))。有趣的是，IFN治疗增加了在肝细胞中STAT1以及许多IFN相关基因的表达(Radaeva，S.，Jaruga，B.，Hong，F.，Kim，W.H.，Fan，S.，Cai，H.，Strom，S.，Liu，Y，El-Assal，O.，and Gao，B.Interferon-alpha activates multiple STAT signals and down-regulates c-Met inprimary human hepatocytes，Gastroenterology 122，1020-1034(2002))。在由丁酸钠诱导的分化中可观察到HCC细胞系内STAT1的上调(Hung，W.C.andChuang，L.Y Sodium butyrate enhances STAT 1 expression in PLC/PRF/5hepatoma cells and augments their responsiveness to interferon-alpha，Br.J.Cancer 80，705-710(1999))。STAT1为IGFBP3的IGF-独立凋亡作用的转录靶点(Spagnoli，A.，Torello，M.，Nagalla，S.R.，Horton，W.A.，Pattee，P.，Hwa，V.，Chiarelli，F，Roberts，C.T.Jr.，and Rosenfeld，R.G.Identification of STAT-1 as amolecular target of IGFBP-3 in the process of chondrogenesis，J.Biol.Chem.277，18860-18867(2002))，而IGFBP3在从L1至G1的转变过程中被下调，这些事实有力地表明在从G1至G2HCC的转变过程中STAT1的表达降低促进了HCC的进一步去分化。
涉及各种生物学过程包括细胞生长、分化和致病的转录相关基因TRIM16以及促进细胞增殖的肿瘤抑制基因TPD52L2在从G1至G2的转变过程中也被上调。在G2HCC中这些基因的上调可以促进肿瘤细胞的生长和侵入。
实施例11在从中等分化HCC(G2)至不良分化HCC(G3)转变的过程中其表达改变的基因在从G2至G3转变的过程中其表达改变的基因包括与蛋白水解作用相关的基因、与BCL2相关的基因、以及与新陈代谢和能量产生相关的基因(表6)。
SPINT1和LGALS9在从G2至G3的转变过程中出现上调。SPINT1涉及受损的组织中肝细胞增长因子(HGF)蛋白水解活性的调节。之前，Nagata等指出反义SPINT1(HAI-1)的转导抑制了人类肝细胞瘤细胞的生长，这表明SPINT1在HCC的发展过程中起到重要的作用(Nagata，K.，Hirono，S.，Ido，A.，Kataoka，H.，Moriuchi，A.，Shimomura，T.，Hori，T.，Hayashi，K.，Koono，M.，Kitamura，N.，and Tsubouchi，H.Expressi on of hepatocyte growth factoractivator and hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1 in humanhepatocellular carcinoma，Biochem.Biophys.Res.Commun.289，205-211(2001)).LGALS9属于植物凝血素家族，其涉及细胞粘着、细胞生长调节、炎症、免疫调节、凋亡和转移。几种半乳凝集素(galectins)被认为与癌细胞粘着相关(Ohannesian，D.W.，Lotan，D.，Thomas，P.，Jessup，J.M.，Fukuda，M.，Gabius，H.J.，and Lotan，R.Carcinoembryonic antigen and otherglycoconjugates act as ligands for galectin-3in human colon carcinoma cells，Cancer Res.55，2191-2199(1995))。
BINP3，一种与BCL2相关的基因，其在从G2至G3的转变过程中被下调。BNIP3与BNIP3L有56％的氨基酸序列同一性。如上文所提到的，BNIP3L的表达在从L1至G1的转变过程中降低。由于BCL2的功能为抗凋亡因子，BNIP3L和BNIP3的下调促进了肿瘤发生，促进了肿瘤细胞的去分化。
很多与新陈代谢和能量产生相关的基因在该转变过程中也被下调。此外，PGRMC1的表达在从G2至G3的转变过程中也降低了，PGRMC1编码结合至孕酮和RARRES2的在肝脏中含量丰富的蛋白。RARRES2表达的降低可能导致G3HCC对视黄酸应答不良。
实施例12在每个转变阶段中所选基因表达的彩色显示在L0至L1转变的过程中其表达显著改变的152个基因(图1a)、在从L1至G1转变的过程中其表达显著改变的191个基因(图1b)、在从G1至G2转变的过程中其表达显著改变的54个基因(图1c)、以及在从G2至G3转变的过程中其表达显著改变的40个基因(图1d)的表达通过彩色显示表示。这些基因清楚地区分了两个连续分化等级中的样本。图1e-h表明在所有的样本中每个转变阶段中所选的40个基因的表达。所选的在从L0至L1(图1e)、从L1至G1(图1f)、从G1至G2(图1g)、和从G2至G3(图1h)转变的过程中表达显著改变的40个基因的表达也通过彩色显示表示。每个转变阶段中所选的40个基因区分了转变之前和之后的样本。
实施例13确认每个转变阶段中所选的用于区分HCC分化等级的40个基因为了确认在每个转变阶段所选的40个基因的辨别性能，创建了每个转变阶段中所选40个基因的最小距离分类法。在每个转变中，根据以红色条状显示的连续两个分化等级中的样本(训练样本)构建最小距离分类法，并将其应用于以黑色条状显示的余下的分化等级中的样本(测试样本)(图2)。所获得的分类法以92％(图2a)、98％(图2b)、84％(图2c)、和100％(图2d)的精确率分类测试样本。
实施例14利用在从非癌肝脏(L0)至癌前肝脏(L1)、从癌前肝脏(L1)至良好分化HCC(G1)、从良好分化HCC(G1)至中等分化HCC(G2)、以及从中等分化HCC(G2)至不良分化HCC(G3)转变过程中其表达改变的基因的自编图谱(SOM)算法进行的分析在非癌肝脏(L0)和癌前肝脏(L1)、癌前肝脏(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、以及中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之间其表达在统计学上显著不同的基因的表达根据带有SOM工具箱的MATLAB R13的方法进行分析，该工具箱可在网址http//www.cis.hut.fi/projects/somtoolbox/中获得(Kohonen，2001)。在非癌肝脏(L0)和癌前肝脏(L1)、癌前肝脏(L1)和良好分化HCC(G1)、良好分化HCC(G1)和中等分化HCC(G2)、以及中等分化HCC(G2)和不良分化HCC(G3)之间的每个对比中使用40个基因。相邻单元的向量在155维(dimentional)基因空间中位置彼此靠近(图3a)，其中(m，n)表示该单元位于在第m行和第n列，NL-XX表明无HCV感染的非癌肝脏(L0)中获得的样本，IL-XX表示从HCV感染的癌前肝脏(L1)中获得的样本，G1-XXT表示从良好分化HCC(G1)中获得的样本，G2-XXT表示从中等分化HCC(G2)中获得的样本，G3-XXT表示从中等分化HCC(G3)中获得的样本。图谱显示出样本按照L0、L1、G1、G2和G3的顺序清晰地形成S状曲线。无血管缠绕的G2样本(蓝色字母)位于靠近G1样本的位置而有血管缠绕的G2样本(红色字母)位于靠近G3样本的位置(图3a)。无静脉侵害(venous invasion)的G2样本位于靠近G1样本的位置而有静脉侵害的G2样本位于靠近G3样本的位置。因此，SOM将G2样本按照去分化等级分为两种亚型，即，具有静脉侵害的肿瘤和不具有静脉侵害的肿瘤。邻近的聚类之间的距离通过彩色显示，其中红色表示长距离，在上部的区域中红色单元清楚地证明了非肿瘤(非癌和癌前)肝脏和HCC样本在155维(dimentional)基因空间中相隔相对较远(图3b)。
工业实用性肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的癌症之一。然而，还没有能够治愈该疾病的治疗方法。这大概是由于在疾病的发展和进展中癌细胞的特征连续改变。特别地，癌的进展通常与肿瘤细胞的分化等级的变化相关。对癌细胞这种变化的诊断和控制将使得癌症的治疗更加有效。在本发明中，确定了其表达与HCC的肿瘤形成和发展相关的基因。采用有监督的学习方法并随后进行随机排列检验来筛选在从无HCV感染的非癌肝脏(L0)至带有HCV感染的癌前肝脏(L1)、从L1至良好分化HCC(G1)、从G1至中等分化HCC(G2)、以及从G2至不良分化HCC(G3)转变过程中其表达显著变化的基因。用所选的在每个转变阶段中其表达显著改变的40个基因进行的最小距离分类法和自编图谱(SOM)可以正确地预测肿瘤组织的分化等级。因此，这些基因可以用于诊断HCC的分化等级和筛选用于每个分化等级中HCCs治疗的抗癌剂。
表1.表示L0、L1、G1、G2和G3样品的聚类.


表2.每个研究组的临床病理学特征.

*，肿瘤分化、阶段、和静脉侵害在UICC的TNM分类的基础上确定。
Fisher′s精确检验，Student′s t检验，和Mann-Whitney′s U检验用于说明在背景中在每个分化等级之间的区别.
N.S.，不显著.
表3.在L0和L1中最佳的40个辨别基因.
在L1中与在L0中相比下调的18个基因


表3.在L0和L1中最佳的40个辨别基因.(续)

在L1中与在L0中相比上调的22个基因

表3.在L0和L1中最佳的40个辨别基因.(续)

表3.在L0和L1中最佳的40个辨别基因.(续)

表4.在L1和G1中最优选的40个辨别基因.
在G1中与在L1中相比下调的28个基因

表4.在L1和G1中最优的40个辨别基因.(续)

表4.在L1和G1中最佳的40个辨别基因.(续)

在G1中与在L1中相比上调的12个基因

表4.在L1和G1中最佳的40个辨别基因.(续)

表5.在G1和G2中最佳的40个辨别基因.
在G2中与在G1中相比下调的15个基因

表5.在G1和G2中最佳的40个辨别基因.(续)

在G2中与在G1中相比上调的25个基因

表5.在G1和G2中最佳的40个辨别基因.(续)

表5.在G1和G2中最佳的40个辨别基因.(续)

表6.在G2和G3中最佳的40个辨别基因.
在G3中与在G2中相比下调的30个基因

表6.在G2和G3中最佳的40个辨别基因.(续)

表6.在G2和G3中最佳的40个辨别基因.(续)

在G3中与在G2中相比上调的10个基因

表6.在G2和G3中最优选的40个辨别基因.(续前)

权利要求
1.确定肿瘤分化等级的方法，所述方法使用通过统计学分析而加以选择的基因和/或蛋白，所述统计学分析以可取自癌症患者的人类肿瘤组织的基因和/或蛋白的表达水平或模式为基础。
2.按照权利要求1的方法，其中人类组织为人类肝脏组织。
3.按照权利要求2的方法，其中肿瘤的分化等级选自非癌肝脏、癌前肝脏、良好分化的肝细胞癌(HCC)、中等分化的HCC、或不良分化的HCC。
4.按照权利要求3的方法，其中基因和/或蛋白在非癌肝脏和癌前肝脏、癌前肝脏和良好分化的肝细胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之间表达不同。
5.按照权利要求1至4中任一的方法，其中基因和/或蛋白的表达水平或模式通过DNA微阵列、反转录聚合酶链反应或者蛋白阵列的方法进行检测。
6.按照权利要求5的方法，其中基因和/或蛋白以Fisher比率递减的顺序进行选择。
7.按照权利要求5或者6的方法，其中基因和/或蛋白的数量在40和100之间。
8.按照权利要求5或者6的方法，其中基因和/或蛋白的数量在35和45之间。
9.按照权利要求8的方法，其中基因和/或蛋白的数量为40。
10.确定肿瘤的分化等级的方法，该方法包括以下步骤(a)选择在非癌肝脏和癌前肝脏、癌前肝脏和良好分化的肝细胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之间比较具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(b)通过使用所述基因和/或蛋白确定肿瘤的分化等级。
11.确定肿瘤的分化等级的方法，该方法包括以下步骤(a)决定用来确定肿瘤分化等级的基因和/或蛋白的数量；(b)选择多个在步骤(a)中决定的在非癌肝脏和癌前肝脏、癌前肝脏和良好分化的肝细胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之间比较具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(c)将在步骤(b)中选择的基因和/或蛋白的数据应用于所有样本；以及(d)确定肿瘤的分化等级。
12.确定肿瘤的分化等级的方法，该方法包括以下步骤(a)决定用来确定肿瘤的分化等级的基因和/或蛋白的数量；(b)选择多个在步骤(a)中决定的在非癌肝脏和癌前肝脏、癌前肝脏和良好分化的肝细胞癌(HCC)、良好分化的HCC和中等分化的HCC、或者中等分化的HCC和不良分化的HCC之间比较具有最高Fisher比率的基因和/或蛋白；(c)将在步骤(b)中选择的基因和/或蛋白的数据应用至所有样本；(d)用在步骤(b)中选择的基因和/或蛋白的数据设计最小距离分类法；(e)将在步骤(d)中设计的最小距离分类法应用至所有样本；(f)用在步骤(b)中选择的所有基因和/或蛋白的数据产生自编图谱；(g)将在步骤(f)中产生的自编图谱应用至所有样本；以及(h)确定肿瘤的分化等级。
13.实施按照权利要求1至12中的任一方法的试剂盒，该试剂盒中包含进行DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白阵列、RNA印迹法、RNase保护试验、蛋白质印迹法和反转录聚合酶链反应所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、探针或引物，以检测通过权利要求1至12中的统计学分析所选择的基因和/或蛋白的表达。
14.权利要求1至12中的任一的基因和/或蛋白用于筛选抗癌剂的用途。
15.特异于权利要求1至12中任一的基因和/或蛋白的抗体用于治疗不同等级肿瘤的用途。
全文摘要
本发明涉及通过筛选其表达水平与肿瘤的各个分化等级相关的基因和/或蛋白，测定各个分化等级中人肿瘤组织中基因和/或蛋白的表达从而确定肿瘤分化等级的方法。本发明还涉及使用上述基因和/或蛋白诊断肿瘤的分化等级和筛选用于肿瘤治疗的抗癌剂。
文档编号G01N33/574GK1764727SQ0382633
公开日2006年4月26日 申请日期2003年4月8日 优先权日2003年4月8日
发明者冈正朗, 浜本义彦, 饭塚德男, 冈部尚文, 浜田健嗣 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司