专利名称：微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶体金免疫层析领域，具体涉及一种微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒及其制备工艺。
背景技术：
微量白蛋白尿(又名微量尿白蛋白，Microalbuminuria, MAU)是指在尿中出现的微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，在正常生理条件下尿液中也会出现极少量白蛋白，排泄量一般在30mg/天(或20mg/L)之内。人尿液中的白蛋白达到在30 300mg/ 天或20 200mg/L浓度间称为微量白蛋白尿，白蛋白浓度大于300mg/天或200mg/L时称为大量白蛋白尿。
微量尿白蛋白(MAU)的非正常出现，通常被认为是肾功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并发症等的重要临床标志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的检测对肾病、糖尿病和心血管疾病的早期诊断、早期治疗和减小风险有重要的参考价值和临床意义。
目前，临床检测微量蛋白质诊断早期肾损害的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附实验法(ELISA)等，这些检查较为繁琐、历时较长、费用较高，不利于临床医生的及时诊断和疗效观察。
国内现有的微量尿白蛋白检测方法的相关专利有申请号01U6895. 6，提供了一种快速检测肾脏损害的尿蛋白芯片，但其未对芯片的制备工艺、检测灵敏度、最低检出量等重要特性给予阐述，限制了其应用的可靠性。本发明的目的在于提供一种检测试剂盒是利用胶体金层析技术，以抗原抗体免疫反应法，来检测人尿液中出现的微量白蛋白，该试剂盒具有等优点。发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测快速的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒。
本发明一方面公开了一种微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有抗人白蛋白单克隆抗体II的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。
较优的，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。
更优的，所述两步还原法的步骤为
a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 1 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；
b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置4. 0°C水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 沈1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 2.0 2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；
两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L。
最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。
最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/S。
最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。
步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。
采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。
较优的，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0.5 0. 8v% Tween-20，12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
更优的，所述预处理的预处理液包括0. 7% Tween-20,16W/V%蔗糖，溶剂为水。
本发明的另一方面，提供了一种微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤
1)两步还原法制备胶体金溶液；
2)用步骤1)制备的胶体金标记抗人白蛋白单克隆抗体I，获得胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I ；
3)免疫胶体金纸片的制备预处理玻璃纤维纸；稀释步骤幻制备的胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；
4)将抗人白蛋白单克隆抗体II和羊抗鼠抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；
6)将试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒，获得微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒。 较优的，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。更优的，所述两步还原法的步骤为
a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 1 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液。
b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置4. 0°C水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0°C的抗坏血酸与PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 26 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 2. 0 2. 1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液。
两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L。
最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。
最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP (聚乙烯吡咯烷酮)的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。
最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。
步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。
较优的，步骤2)中，胶体金标记抗人白蛋白单克隆抗体I的比例为向胶体金中按照6μ g抗体/(ml胶体金)的比例加入抗人白蛋白单克隆抗体I，制备得到免疫胶体金。
较优的，所述步骤幻免疫胶体金纸片的制备为
A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，获得OD54tl值为1.6 的免疫胶体金溶液；
B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。
本发明中，指体积百分比；w/v%指重量体积百分比，如即为IOOml溶液中含lg。
更优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下8 12v% 1.0M Tris液，0.2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v %牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶， 0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 0 士0. 1，余量为水。
最优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下10v% 1.0M 1Tris液、0. 3 八％聚乙二醇20000,0. 2W/V%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脱脂牛奶、0. 3w/v%酪蛋白，和0. 05w/v% 叠氮化钠，用盐酸调节PH至8.0 士0. 1，余量为水。
更优的，所述步骤B中的预处理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20，12 18 八％蔗糖，溶剂为水。
最优的，所述步骤B中的预处理液包括0.7v% TWeen-20，16W/V%蔗糖，溶剂为水。
更优的，步骤B中，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸^lmmX 220mm，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每26ImmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂25ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。
较优的，步骤4)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗鼠IgG的浓度为 0. 15 0. 3mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗人白蛋白单克隆抗体II浓度为 0. 2 ~ 0. 4mg/ml。
较优的，每Im长硝酸纤维素膜分别包被有Iml的羊抗鼠IgG和抗人白蛋白单克隆抗体II溶液，检测线和质控线的间距为4. 0 6. 0mm。
本发明的关键在于(1)两步还原法制备分子大小均一的胶体金颗粒，( 疫胶体金纸片制备工艺的改进，其余步骤均可采用常规制备胶体金检测试剂条的条件进行。本发明的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒的工作原理，即是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术来定性检测人尿液中出现的白蛋白。检测时，(一)如果尿液中没有人白蛋白尿液中的其他成分不与免疫胶体金纸片上的抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金结合，尿液经毛细作用在硝酸纤维素膜上层析，依次通过T线和C线，在样品混合物通过T线时，不会被包被在T线的抗人白蛋白单克隆抗体II 结合，T线捕捉不到胶体金因而不显色，只在C线出现一条红色线条。(二)如果尿液中含有人白蛋白尿液中人白蛋白便首先与免疫胶体金纸片上的抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金结合，形成“人白蛋白-抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金”；样品混合物继续在硝酸纤维素膜上层析，依次通过T线和C线，在样品混合物通过T线时，包被在T线的抗人白蛋白单克隆抗体II与尿样中的人白蛋白结合形成“抗人白蛋白单克隆抗体II-人白蛋白-抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金”复合物，T线捕捉到胶体金颗粒因而显色；尿液中人白蛋白浓度的越高，T线的颜色越深。(三)包被在质控线(C线)上的羊抗鼠IgG为多克隆抗体，其总是能捕获鼠源性的单克隆抗体，所以总能与抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金形成“羊抗鼠IgG-抗人白蛋白单克隆抗体I-胶体金”复合物；因此，在C线处总是形成一定深度的红线，C线的出现和尿液中有无人白蛋白无关，它的出现表明检测操作正确、试剂盒反应系统工作正常；同时，C线也是判断T线强度的参照线。本发明试剂盒的使用方法为1.将试剂盒放置在水平台面上。2.用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120 μ 1)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。3.观察结果在滴加样品后10-15分钟判读结果。检测结果的判断方法阳性在结果观察窗口内出现两条色带，即检测线(Τ线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中有尿白蛋白的存在。阴性只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(Τ线) 未出现任何线条，表示样品中无尿白蛋白的存在。无效质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。 C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。本发明的有益效果(1)采用了两步还原法制备胶体金分子，使得到的胶体金分子呈大小均一的40nm 的球形颗粒；由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定。(2)免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方对玻璃纤维膜进行预处理及采用较好的喷金缓冲液，在保障胶体金释放完全的基础上可有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。(3)本发明制备的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒操作简单，检测结果肉眼可见，无需特殊实验仪器和专业技术人员；检测快速，10-15分钟内可显示检测结果；特异性强， 与牛奶、人血红蛋白、PBS缓冲液反应结果均为阴性；而且检测结果费用低廉，储存和运输方便等优点。


图1 微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒试剂条示意图(1.滤样纸2.免疫胶体金纸 3.免疫硝酸纤维素膜4.吸水纸5.检测线6 质控线)图2:微量白蛋白尿胶体金检测试剂盒示意图(5.检测线6.质控线7.加样口 8.盒座)图3 胶体金透射电镜图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例1微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒的制备一、试剂来源抗人白蛋白单克隆抗体I、抗人白蛋白单克隆抗体II、羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自美国美迪生物技术有限公司MAXMED LABORATORIES INC.)硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸(购自德国赛多利斯公司SART0RIUS)二、制备步骤方法1 1、胶体金的制备a)第一次还原氯金酸溶液将6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0. 016mol/L柠檬酸三钠水溶液。超声振荡2分钟后冷却至室温，超声震荡的频率为25KHZ，制得约15nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液取第一步制得的胶体金原核溶液^ml,并放置于4°C 水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4. O0C的含0. 018mol/L的抗坏血酸与0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，制得40nm粒径的胶体金溶液。制备好的胶体金颗粒通过透射电镜观察，结果见图3，所制备的胶体金颗粒分散性好，粒径大小均一，为40nm左右。2.免疫胶体金制备a)将抗人白蛋白单克隆抗体I用0. IM pH 7. 9的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 1. Omg/ml的抗体溶液。b)取IOOOml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0. IM pH7. 9磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗人白蛋白单克隆抗体I溶液6ml加入其中，室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。c)反应结束后，在上述反应液中快速加入25ml的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。
d)将制备好的免疫胶体金8000转/分钟离心20分钟，保留沉淀，并收集上清 10000转/分钟离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0. 1 % BSA的硼酸缓冲液复溶到OD54tl为14。3.免疫胶体金纸片的制备1)预处理液的制备准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至 IOOOml ；2)喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 0。准确称取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脱脂牛奶，3. Og酪蛋白溶液和0. 5g叠氮化钠加入纯化水中，充分溶解，混合均勻，用纯化水定容至1000ml。3)用喷金缓冲液稀释免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1. 6，获得免疫胶体金溶液。4)用第一步获得的预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 261mmX 220mm，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每^lmmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂25ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4、免疫硝酸纤维素膜的制备1)将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 2mg/ml，制得质控线(C线)溶液。2)将抗人白蛋白单克隆抗体II用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 3mg/ml制得检测线(T线)溶液。3)用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜各包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5. 0mm。5、将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图1所示)。6、将检测试剂条装入塑料盒内即得微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒。方法2 1、胶体金的制备参考本实施例方法1的步骤。2、抗体的制备参考本实施例方法1的步骤。3、免疫胶体金纸片的制备1)预处理液的制备准确称取8ml Tween-20,120g蔗糖，加纯化水定容至 IOOOml ；2)喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 0。准确称取4. Og聚乙二醇20000、1. 5g牛血清白蛋白，3. Og脱脂牛奶，2. 5g酪蛋白溶液和0. 2g叠氮化钠加入纯化水中，充分溶解，混合均勻，用纯化水定容至1000ml。3)用喷金缓冲液稀释免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1. 6。4)用第一步获得的预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 261mmX 220mm,干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每^lmmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂25ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4、免疫硝酸纤维素膜的制备1)将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 3mg/ml，制得质控线(C线)溶液。2)将抗人白蛋白单克隆抗体II用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 2mg/ml制得检测线(T线)溶液。
3)用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜各包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为4. 0mm。5、将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条。6、将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。方法3:1、胶体金的制备参考本实施例方法1的步骤。2、抗体的制备参考本实施例方法1的步骤。3、免疫胶体金纸片的制备1)预处理液的制备准确称取5ml Tween-20,180g蔗糖，加纯化水定容至 IOOOml ；2)喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入120ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 0。准确称取2. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脱脂牛奶，3. 5g酪蛋白溶液和0. 8g叠氮化钠加入纯化水中，充分溶解，混合均勻，用纯化水定容至1000ml。3)用喷金缓冲液稀释免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1.6。4)用第一步获得的预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 261mmX 220mm,干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每^lmmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂25ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4、免疫硝酸纤维素膜的制备1)将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 15mg/ml，制得质控线(C线)溶液。2)将抗人白蛋白单克隆抗体11用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 4mg/ml制得检测线(T线)溶液。3)用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜各包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为6. 0mm。5、将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条。6、将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。实施例2微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒的灵敏度实验检测方法1、取实施例1制得的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。2、用加样吸管吸取待测尿样，然后滴2-3滴(约100 μ 1)样品到试剂盒的加样孔中，每检测一份不同的样品使用不同的吸管。3、观察结果在滴加样品后10-15分钟判读结果。检测样品配置人白蛋白浓度为7. 5 μ g/mlUO μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml的质控参考品作为标准品。检测结果表1试剂盒灵敏度结果
权利要求
1.一种微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、 免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗人白蛋白单克隆抗体II的检测线和包被了羊抗鼠IgG的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
4.权利要求1-3任一权利要求所述的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)两步还原法制备胶体金溶液；2)用步骤1)制备的胶体金标记抗人白蛋白单克隆抗体I，获得胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I ；3)免疫胶体金纸片的制备预处理玻璃纤维纸；稀释步骤幻制备的胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；4)将抗人白蛋白单克隆抗体II和羊抗鼠抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；6)将试剂条装入塑料盒，获得微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述两步还原法的步骤为a.第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0.0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 1 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b.第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0°C水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 沈1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 2.0 2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L，超声震荡的频率为20-30KHZ。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为0. 017-0. 019mol/L, PVP的浓度为0. 137-0. 139g/L。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)免疫胶体金纸片的制备为A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体I，获得OD54tl值为1.6的免疫胶体金溶液；B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下 8 12v% 1. OM Tris液，0. 2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶，0. 25 0. 35w/v%酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v%叠氮化钠，用盐酸调节PH至8.0 士0. 1，余量为水。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的预处理液包括0.5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
11.权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒在制备微量尿白蛋白检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及胶体金免疫层析领域，公开了一种微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗人白蛋白单克隆抗体Ι，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗人白蛋白单克隆抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗鼠IgG的质控线。本发明的微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒反应灵敏，检测方便、检测结果稳定，节约成本。
文档编号G01N33/531GK102539786SQ201110458518
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者张国华 申请人:上海凯创生物技术有限公司