专利名称：化学治疗应答者的确定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法通过测定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白在生物样品中的过量表达而进行。本发明还涉及获得候选药剂或者选择在患者中用于抑制肺癌进展的组合物的方法，在所述方法中使用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白。
背景技术：
由erbBl基因编码的EGFR已经以因果方式涉及人类恶性肿瘤。特别地，已经在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到增加的EGFR表达。表皮生长因子受体(EGFR)，一种170-kD的糖蛋白，由N端细胞外结构域、疏水跨膜结构域和包含激酶结构域的C端细胞内区域组成。EGFR配体-诱导的二聚体化作用激活内部的RTK结构域(一种Src同源结构域1，SHl)，这引起在细胞质结构域非催化尾的6个特异EGFR酪氨酸残基的自动磷酸化作用。癌细胞中EGFR激活的细胞作用包括增加的增殖、促进细胞运动、黏附、侵入、血管发生、以及通过抑制细胞程序性死亡而增加的细胞存活。激活的EGFR通过刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应而诱导肿瘤细胞增殖。一旦配体结合到EGFR上时，SOS鸟嘌呤核苷酸交换因子就通过Grb2连接蛋白补充到质膜上，其在小G蛋白Ras上刺激GTP交换成⑶P，随后激活由Raf、MEK和ERK组成的MAPK级联反应。激活的ERKs (pMAPK, pERKl/2)又磷酸化并且激活转录因子，诸如ELK-I或c-Myc，从而促进细胞生长。多种生长因子途径通过多种激酶的激活而促进NSCLC细胞的发展和存活。EGFR还经由通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K) /Akt途径和STAT途径进行信号传导而增强癌细胞的存活。Akt还通过其它生长因子激活，包括胰岛素生长因子-I、碱性成纤维细胞生长因子以及白细胞介素3和6。Akt的3个同种型1-3都是以相似的方式在活化结构域的残基T308和COOH-末端结构域的S473被磷酸化(pAKT)。Erlotinib (Tarceva·是一种有效的表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪氨酸-激酶抑制剂(TKI)，当用作单独的药剂时，其为先前化学治疗失败的非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者提供生存益处(W0 01/34574)。Tarceva^A功效在许多试验中进行研究。它的化学名为N-(3-乙块基苯基)-6, 7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。TALENT试验是在一线NSCLC患者中进行的安慰剂-对照的III期研究，所述患者接受吉西他滨和顺钼(这种同时的化学治疗是非美国护理标准(non-US standard ofcare)的)组合erlotinib (Tarceva 1150mg/天)或者组合安慰剂。初级目的是存活持续时间，次级目的是发展时间、反应率；反应的持续时间；药物动力学和药效参数，以及生活质量。还评估了 HER1/EGFR和HER2表达率。进行了标准的安全性分析。TALENT试验总的结果是阴性的。对于初级和次级目的，与单独的吉西他滨和顺钼相比，erlotinib (Tarceva·加化学疗法(吉西他滨和顺钼)不存在明显的益处(Gatzemeier, U.,等·，Proc Am SocClin Oncol 23 (2004)617 (Abstract 7010))。在使用 erlotinib 加卡钼和紫杉醇的基于美国的TRIBUTE研究中观察到相同的结果(Herbst, R. S.，等.，J Clin Oncol (2004) ASCOAnnual Meeting Proceedings. Post-Meeting Edition ；22 (July 15 Suppl.) (Abstract7011))。将单独的药剂erlotinib作为二线或三线治疗剂用于非小细胞肺癌(NSCLC)(BR. 21 ；NCIC/0SIP)的随机化安慰剂-对照的III期研究发现，与安慰剂(4. 7个月)相比，使用erlotinib在存活上有统计学显著的提高(6. 7个月)。许多研究涉及非小细胞肺癌中生物标记的研究以及它们与某些EGFR抑制剂药物的关系。Han，等·，Int J Cancer 113(2005) 109-115 用 Gefitinib (Iressa ，EGFRTKI)单一治疗研究了 65名患者。他们分析EGFR下游分子在化疗-抗性非小细胞肺癌中作为 gefitinib 的应答预见性标记。Cappuzzo, F.等·，JNCI 96 (2004) 1133-1141 用Gefitinibdressa ；EGFR TKI)单一治疗研究了 106名患者。他们在患有晚期非小细胞 肺癌的患者中研究Akt磷酸化作用和gefitinib的功效，并且发现接受gefitinib的具有P-Akt-阳性肿瘤的患者比患有P-Akt-阴性肿瘤的患者从所述治疗受益更多。Vicent,S.等.，Br J Cancer 90 (2004) 1047-1052研究了 111名NSCLC患者。他们发现在非小细胞肺癌中pERK被激活并且与晚期肿瘤相关。Han, S. W.等.，J Clin Oncol 23(2005)2493-2501用Gefitinib (EGFR TKI)单一治疗研究了 90名患者。他们分析表皮生长因子受体突变在用gefitinib治疗的非小细胞肺癌患者中的预见性和预后作用。Mukohara, T.等.，LungCancer 41 (2003) 123-130研究了 60名患者，每个阶段20名患者，其进行新佐剂化学治疗或者放射治疗。EGFR表达与pERK和pAkt表达相关。正如作者本身所提及的那样，样本的大小太小。Raben,D.等.，Int J Radiation Oncology Biol. Phys 59 (2004) 27-38 研究了对于非小细胞肺癌的靶向治疗。0ηο，Μ·等·，Μο1 Cancer Ther 3 (2004) 465-472 检验了 9 种 NSCLC细胞系，并且用 gefitinib 处理。Hirsch, F. R.等.，Curr Opin Oncol 17 (2005) 118-122 综述了 Akt和MAPK的磷酸化作用状况作为gefitinib抗性的潜在标记。Meert,等.,ClinicalCancer Research 9 (2003) 2316-2326 在 EGFR 抑制剂活性方面研究了 NSCLC 细胞系。EGFR和Her2表达水平都不与EGFR抑制剂的敏感性相关。Brognard, J.等·，Cell Death andDifferentiation 9 (2002) 893-904 分析了 19 株 NSCLC 细胞系，其中 17 株表现出 Erkl/2 磷酸化作用和组成型活性。David, 0.等·，Clinical Cancer Research 10 (2004) 6865-6871公开pAkt的过量表达是NSCLC中独立的预后因子。Kakiuchi, S.等.，Human MolecularGenetics 13 (2004) 3029-3043研究了 33名NSCLC患者的基因组广谱cDNA微点阵。所有微点阵都在单一治疗设备中给予gefitinib。对于Akt/pAkt表达水平、EGFR基因状况或者PEGFR染色以及gefitinib应答之间的相关性没有发现任何证据。Kim，R. H.等·，Cancer Cell 7 (2005) 263-273 公开了癌基因 DJ-I 表达与 pAkt 水平相等。Balsara，B. R.等·，Carcinogenesis 25 (2004) 2053-2059 研究了 110 名具有 TMA pAkt 表达的 NSCLC患者。在pAkt阴性和阳性之间不存在存活的显著差异。Hirami, Y.等·，Cancer Letters214(2004) 157-164研究了非小细胞肺癌中表皮生长因子受体、pAkt和低氧诱导因子_1 α的关系。Lee,S. H.等.，APMIS 110 (2002) 587-592 分析 NSCLC 患者的 43LN 转移。NSCLC 中的Akt激活在肿瘤发育中而不是在发展中起作用。Engelman, JA.等.，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 102 (2004) 3788-3793分析erbB_3在gefitinib-敏感性非小细胞肺癌细胞系中介导磷酸肌醇 3-激酶活性。David,0. ,J Cell Mol Med 5 (2001) 430-433 讨论了 Akt 和 PTEN在肺癌中作为新的诊断标记的作用。Mantha, A.等.,Clin. Cancer Res. 11 (2005) 2398-2407研究了抑制表皮生长因子受体功能的甲羟戊酸途径的靶向。在WO 2004/046386中研究了与EGFR阳性癌症相关的预后标记。US 2004/0157255公开了应答EGFR抑制剂药物的基因表达标记。WO 2004/063709公开了测定对表皮生长因子受体调节剂敏感性的生物标记和方法。WO 01/00245描述了人源化抗-ErbB2抗体和用抗-ErbB2抗体诸如人源化抗_erbB2抗体治疗癌症的方法。发明概沭 还存在提供测定对EGFR抑制剂治疗的敏感性、特别是EGFR抑制剂与化学治疗剂组合治疗的敏感性的方法的需要。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种测定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法包括测定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在生物样品中的过量表达，由此磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的过量表达是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的指示。在本发明的另一个实施方案中，应用与磷酸化的AKT蛋白结合的抗体或与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体来测定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。在本发明的另一个实施方案中，提供选择用来在患者中抑制肺癌发展的组合物的方法，所述方法包括a)在多种测试组合物存在下，分别暴露包含来自患者的对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样；b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与没有接触测试组合物的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较；c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组合物的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10%的差异是选择所述测试组合物的指示。在本发明的另一个实施方案中，提供了获得候选药剂的方法，所述方法包括(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样与候选药剂接触，(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的效果，(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10%的差异是所述候选药剂效果的指示。在本发明的另一个实施方案中，提过通过按照本发明的方法获得(derived)的候选药剂和包括按照本发明的药剂的药物制剂。在本发明的另一个实施方案中，按照本发明的药剂用来制备抑制肺癌发展的组合物。
·
在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明的方法的步骤和(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步骤(C)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或(ii)将步骤(C)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物与药用载体组
八
口 ο在本发明的另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白结合的抗体来获得候选药剂，或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组合物。在本发明的另一个实施方案中，提供包含针对磷酸化MAPK和/或磷酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。术语“生物样品”应该一般意指从个体、体液、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样品。体液例如淋巴、血清、血浆、尿、精液、滑液和脊髓液。按照本发明，所述生物样品包括肺癌细胞和非肺癌细胞(其它细胞)。获得来自哺乳动物的组织活检和体液的方法是本领域公知的。术语“表达的水平(levelof expression) ” 或“表达水平(expression level)”通常是指样品中氨基酸产物或蛋白的量，优选为按照本发明的样品中磷酸化的氨基酸产物或或磷酸化的蛋白的量。“表达”是指这样的过程，即通过这样的过程基因编码的信息转化成在在细胞中存在并且运作的结构，按照本发明包括它们的磷酸化作用。当用于本文时，“表达的基因”包括转录成mRNA然后翻译成蛋白并且翻译后修饰如磷酸化的那些基因。只是为了完整，这一术语还应该包括转录成RNA但是不翻译成蛋白的那些表达的基因(例如，转运和核糖体RNAs)。术语“过量表达”和“低量表达(underexpression) ”分别是指当与用作对照的样品中的基线表达水平相比时表达水平的向上或向下的偏差。因此，“过量表达”也是“增加的表达”，“低量表达”是“减少的表达”。本文中术语“抗体”以最宽泛的意义应用，并且特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(multispecific antibodies)(例如双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出理想的生物活性。当用于本文时，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上均一的抗体获得的抗体，SP，包括所述群体的个体抗体是相同的，除了可能天然存在的突变之外，而且这种突变可能以较少量存在。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原性位点。此外，多克隆抗体制备物包含针对不同决定簇(表位)的不同的抗体，与多克隆抗体制备物相反，每一单克隆抗体针对抗原上的单一的决定簇。除了它们的特异性，由于它们可以不受其它抗体的污染而合成，所以单克隆抗体是是有利的。修饰词“单克隆”是指抗体的特征，即从基本上均一的抗体群体获得，并且不解释成(constructed)需要通过任何具体方法的抗体生产。例如，按照本发明应用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler，G.等.，Nature 256(1975)495描述的杂交瘤方法进行制备，或者可以通过重组DNA方法进行制备(参见，例如，U. S.Pat.No. 4，816，567)。“抗体片段”包括完整的抗体的片段。“结合”按照本发明的目的抗原(即磷酸化MAPK或磷酸化的pAKT蛋白)的抗体是这样的一种抗体，即能够以足够的亲和力与所述抗原结合，以致所述抗体用于检测所述抗原的存在。按照本发明的抗体是一种结合磷酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白的抗体，与 非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT蛋白相比，它通常优选地结合磷酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白，或者不显著地与非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT蛋白交叉反应。在这样的实施方案中，当通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定时，所述抗体与非磷酸化的蛋白的结合程度应该低于10%。换句话说，它应该特异性地结合磷酸化MAPK或磷酸化pAKT蛋白，并且不特异性地结合或者全然不结合非磷酸化MAPK或非磷酸化pAKT蛋白。“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗药剂的实例包括烷基化试齐U，诸如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN )、烷基磺酸酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙唳诸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；氮丙唳和methylamelamines,包括六甲蜜胺、三乙蜜胺(triethylenemelamine)、三乙憐酉先胺(trietyIenephosphoramide)、三乙硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphaoramide)和三轻甲蜜胺(trimethyIoIomeIamine)；氮芥(nitrogen mustards)诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥，苯芥胆留醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitiOsureas)，诸如卡莫司汀，氮脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素诸如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin,偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C, calicheamicin,carabicin,去甲柔红霉素，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D,柔红霉素，地托比星,6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，poffiromycin,嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物诸如denopterin，甲氨喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨，6-巯嘌呤，thiamiprine,硫鸟嘌呤(thioguanine);喃啶类似物诸如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，5-FU ;雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺(anti-adrenals)诸如氨鲁米特,米托坦，曲洛司坦；叶酸补偿物诸如frolinic acid ;醋葡醒内酯；轻醒磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ;5-氨基酮戍酸；安卩丫唳；bestrabucil ;比生群；依达曲沙(edatraxate) ；defofamine ;秋水仙胺；地吖醌；elformithine ;依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；轻基脲；香燕多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁 ；异丙嗪(Phenamet);吡柔比星；鬼臼酸；2_乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK·;雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2/，2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替哌；紫杉烧类,例如，紫杉醇(TAXOLBristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)和多西他赛(TAXOTERE Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他滨；δ-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；钼类似物诸如顺钼和卡钼；长春碱；钼；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C ;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins ;卡培他滨；以及任何上述 物质的药用盐，酸或衍生物。下列物质也包含在本发明中，它们是作用调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制的4(5)-咪唑(aromatase inhibiting4 (5) -imidazoles), 4-轻基他莫昔芬，曲沃昔芬,keoxifene, LY117018,奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素诸如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及药用盐、酸或者任何上述物质的衍生物。“化学治疗剂”本身可以是上文提及的用于治疗癌症组合的化学化合物的组合，即，所述组合可以是吉西他滨/顺钼，还可以如顺钼/紫杉醇、顺钼/多西他赛、顺钼/长春瑞滨、吉西他滨/卡钼、或卡钼/多西他赛。术语“EGFR抑制剂”是指与EGFR结合并且任选地抑制EGFR活化的治疗药剂。这样的药剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实例包括MAb579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb528 (ATCC CRL 8509)(参见，US 4，943，533，Mendelsohn 等·)以及其变体，诸如嵌合的225 (C225 或 Cetuximab ；ERBUTIX φ )和改造的人 225 (H225)(参见 TO 96/40210，ImcloneSystems Inc.);结合 11 型突变体 EGFR 的抗体(US 5，212，290);如 US 5，891，996 所述与EGFR结合的人源化的和嵌合的抗体；以及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)。抗EGFR抗体可以与细胞毒素试剂缀合，这样产生一种免疫缀合物(参见，例如，EP O 659 439 A2, Merck Patent GmbH)。与EGFR结合的小分子的实例包括ZD1839 或 Gefitinib (IRESSA ；Astra Zeneca)，CP-358774 (Tarceva ；Genentech/0SI)和AG1478，AG1571(SU 5271 ;Sugen)。本申请中特别优选的是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如Tarceva .例如，“小分子”可以是具有低于每摩尔大约10，000克、优选地低于每摩尔大约5，000克的分子量的肽或肽拟物。优选地，“小分子”是一种化合物，即，有机或无机化合物，其具有这样的分子量低于每摩尔大约5，000克，优选地低于每摩尔大约1，000克，更优选地低于每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，其为具有下述分子量的化合物低于每摩尔大约5，000克，优选地低于每摩尔大约1，000克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。换句话说，所述EGFR抑制剂是一种抑制EGFR酪氨酸激酶活性的化合物，并且具有这样的分子量低于每摩尔大约5，000克，优选地低于每摩尔大约1，000克，更优选地低于每摩尔大约500克，以及这样的化合物的盐、酯和其它药用形式。“吉西他滨”是化学治疗剂2'，2' - 二氟脱氧胞苷(dFdC)，其为脱氧胞苷的嘧啶类似物，其中脱氧核糖部分在2'位置包含2个氟原子(参见Heinemann, V.等.，CancerRes 48 (1988) 4024)。它可以作为 Gemzar ⑧从 Eli Lilly 和 Company, Indianapolis,Indiana, USA商购获得。当贯穿本申请应用时，“顺钼”是化学治疗剂顺-二氨基二氯钼(参见US5，562，925),作为 Platinol 翁从 Bristol-Myers Squibb Company, New York, NY, USA 商购获得。“顺钼”是一种重金属复合物，其包含一个中央的钼原子，钼原子被在顺式位置上的2个氯原子和2个氨分子围绕。按照本发明，表述“包含对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的人肺癌细胞的生物样品”应该意指，与只用表皮生长因子抑制剂治疗比较，所述包含人肺癌细胞的生物样品对用表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合治疗敏感。“敏感”还可以理解为“与之反应”或“表现出与之反应”，特别是这样的反应对肺癌患者有益。因而，与只用·表皮生长因子抑制剂治疗比较，可以测定肺癌患者是否对用表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合治疗敏感。这意味着患者将从这样的治疗中受益。“MAPK”蛋白是高度保守的胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，叫作促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)或细胞外信号调控的激酶(ERKs)。这一蛋白家族具有一些亚组。ERKs被激活并且酪氨酸或苏氨酸被磷酸化，以应答广泛种类的细胞外信号，包括渗透压、热激、促炎细胞因子、激素和分裂原。当用于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选地是指MAPK蛋白家族的一员，包括或者优选地由MAPKl和MAPK3组成。MAPKl (ERK2)的氨基酸序列是SEQID NO 1,MAPK3 (ERKl) (SEQ ID NO :2)。这些氨基酸序列由mRNA序列编码，S卩，对于MAPKl，cDNA序列SEQ ID NO :3和4，对于MAPK 3，为SEQ ID NO :5。MAPKl的初级磷酸化位点是Thrl85和Tyrl85，MAPK3的初级磷酸化位点是Thr202和Tyr204。这些磷酸化位点还由用于本发明的抗体识别，即，优选地由针对MAPKl和MAPK3磷酸化形式的多克隆抗体血清识别。术语“ Akt ”蛋白是指第二信使调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的Akt/PKB亚家族的蛋白，该亚家族蛋白具有3个成员，分别叫作Aktl/ΡΚΒα，Akt2/PKB β (Staal，S. P.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987)5034-5037)和 Akt3/PKB y (Nakatani, K.等·，Biochem. Biophys. Res. Comm. 257(1999)906-910 ；US 6，881，555)。所述同种型是相似的，并且响应磷脂酰肌醇3' -OH激酶(PI3K)信号传导通过磷酸化被激活。PI3K/Akt/PKB途径似乎还对于肿瘤发生中的调控细胞存活/细胞死亡很重要(Dudek，H.等.，Science275(1997)661-665)。当用于本申请时，术语“Akt蛋白”是指Akt蛋白家族的一员，Akt蛋白家族包括或者优选地由Aktl、Akt2和Akt3组成。Aktl/PKB α的磷酸化发生在两个位点Thr308 和 Ser473 上(Meier, R.，等·，J. Biol. Chem. 272 (1997) 30491-30497)。等效的磷酸化位点发生在 Akt2/PKB0 (Thr3°9 和 Ser474)和 Akt3/PKB Y (Thr3°5 和 Ser472)中。术语“磷酸化的Akt”蛋白是指磷酸化的“Akt”蛋白，优选地在上述位点磷酸化。当用于本发明时，术语“MAPK蛋白”优选是指MAPK蛋白家族的一员，该蛋白家族包括或者优选地由MAPKl和MAPK3组成。Akt I也叫作人RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2. 7. I. 37) (RAC-PK-α )，蛋白激酶B (PKB) (C-AKT)，并且Akt I的氨基酸序列是SEQ ID NO :6。ΑΚΤ2也叫作人RAC- β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2.7. 1.37) (RAC-ΡΚ-β)，蛋白激酶Akt-2或蛋白激酶B，β (ΡΚΒβ)，并且Akt 2的氨基酸序列是SEQ ID NO :7。ΑΚΤ3也叫作人RAC-Y丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EC 2. 7. 1.37) (RAC-PK-Y)，蛋白激酶Akt-3或蛋白激酶B，Y (PKB Y )(STK-2)，并且Akt 3的氨基酸序列是SEQ ID NO :8。发明详沭文献中阐释了分子生物学和核酸化学的常规技术，这些技术是本领域技术之内的。例如，参见 Sambrook, J.等.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ；Gait, M. J. (ed.),Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach, IRL Press,1984 ;Hames, B. D.,和Higgins,S.J. (eds. ), Nucleic Acid Hybridisation-Α Practical Approach, IRL Press,1985 ;以及系列丛书，Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.，所有这些通过参考结合于此。本文提及的所有专利、专利申请和公布，上文所述和下文所述的，都通过参考结合于此。

在本发明的一个实施方案中，提供确定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法包括确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达是包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的指示。优选地，在按照本发明的方法中，生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤确定a)测定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，b)测定在包含对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合不敏感的人肺癌细胞的生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，c)测定步骤a)和b)中而测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达。优选地，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至少为10%。更优选地，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至少为25%。在另一个实施方案中，步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异至少为50%，75%，100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 300 % , 400 %, 500 % 1,000 %。步骤 a)和 b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10，000或50，000%。步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选地在10%到10，000%之间，更优选地25%到10，000%,50%到10，000%,100%到 10，000%，甚至更优选地 25%到 5，000%,50%到 5，000%, 100%到 5，000%。在本发明的一个优选的实施方案中，所述生物样品是原发性肺肿瘤或转移瘤(局部的或远端的)，例如，其可以通过肺部组织活检或者通过组织活检方式从其它器官获得。例如，转移瘤还可以是肝脏或淋巴节的远端转移瘤。必须理解当转移瘤发源于肺部时，这样的远端转移瘤也包括肺癌细胞。在另一个实施方案中，所述癌症是除肺癌以外的另一种癌症，如胰腺癌。然而，具有实体瘤的其它癌症也是可行的，诸如卵巢、结肠直肠、头颈、肾细胞癌、神经胶质瘤以及胃肠癌，特别是胃癌。在另一个优选的实施方案中，EGFR抑制剂是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，特别是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如Tarceva·。因此，换句话说，在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述EGFR抑制剂是erlotinib或N-(3-乙炔基苯基)_6，7_ 二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。在本发明的另一个优选实施方案中，化学治疗剂是吉西他滨和/或顺钼。在本发明的 另一个实施方案中，磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达是使用特异性结合磷酸化的蛋白并且优选地不特异性或者全然不结合非磷酸化蛋白的试剂而测定的。优选地，抗体、抗体衍生物或抗体片段特异性地结合磷酸化的AKT蛋白或者磷酸化的MAPK蛋白，并且优选地不特异性地或全然不结合非磷酸化的AKT蛋白或非磷酸化的MAPK蛋白。在本发明的另一个优选的实施方案中，磷酸化的AKT蛋白是在与Aktl蛋白氨基酸位置473对应的氨基酸位置被磷酸化，或者MAPK蛋白在与MAPKl氨基酸位置202和204对应的氨基酸位置被磷酸化。优选地，MAPK蛋白的氨基酸序列为氨基酸序列SEQ ID NO :1或2，AKT蛋白的氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO :6，7或8。存在可以用于本发明方法的许多不同类型的免疫检测，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光免疫吸附测定(FIA)，化学物质联接的免疫吸附测定(chemical linkedimmunosorbent assay, CLIA),放射免疫测定(RIA),和免疫印迹。关于可以应用的不同免疫检测的综述，参见:Lottspeich 和 Zorbas (eds. ), Bioanalytik,第一版 1998, SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,Berlin,德国。因此，在本发明的另一个实施方案中，表达水平应用选自由下列各项组成的组的方法进行测定蛋白质组学、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。在本发明的一个优选实施方案中，磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤测定a)将生物样品进行免疫组织化学染色，b)在肉眼观察生物样品中细胞的染色后，对于磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平,指定一个选自数字1，2, 3和4的等级，由此指定关于表达水平的最闻可检测的等级，c)确定在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百分比，d)将在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百分数乘以指定的等级并且乘以100,和e)当步骤d)的乘法结果高于100时，确定生物样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白过量表达。在本发明的另一个实施方案中，提供确定肺癌患者是否受益于表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合的方法，所述方法包括确定来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达是患者受益于表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂组合的指示。上文所述的所有其它优选的实施方案同等地适用于这一实施方案。优选地，在按照本发明的方法中，来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达通过下列步骤确定a)测定来自患者的样品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，b)在来自肺癌患者的样品中，测定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，其中所述肺癌患者不受益于表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合，c)确定步骤a)和b)测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异，由此确定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的过量表达。术语“受益”意指与只用表皮生长因子受体抑制剂治疗相比，患者没有从表皮生长因子受体抑制剂 和化学治疗剂的组合治疗中受益。在本发明的另一个优选的实施方案中，将与磷酸化的AKT蛋白结合的抗体或者与磷酸化的MAPK蛋白结合的抗体用来确定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子抑制剂和化学治疗剂的组合敏感。在本发明的另一个实施方案中，提供了选择抑制患者的肺癌发展的组合物的方法，所述方法包括a)在多种测试组合物的存在下，将来自患者的包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样分别暴露； b)将与测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平与在不接触测试组合物的生物样品的等分试样中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平相比较，c)选择相对于没有接触测试组合物的等分试样，在包含所述测试组合物的等分试样中改变了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平的测试组合物之一，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10%的差异是选择所述测试组合物的指示。优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少25%。更优选地，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50%。在另一个实施方案中，步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少75%，100%，125%,150%,175%, 200%,300%,400%，500%或1，000%。步骤c)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异可以多达10，000或50，000%。步骤c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选地在10%到10，000%之间，更优选地，25%到10，000%，50%到 10，000%, 100%到 10，000%，甚至更优选地25%到 5，000%,50%到 5，000%, 100%到 5，000%。在本发明的另一个实施方案中，提供获得候选药剂的方法，所述方法包括(a)将包含对EGFR抑制剂和化学治疗剂敏感的肺癌细胞的生物样品的等分试样与候选药剂接触，(b)测定与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，并且测定在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平，
(c)通过将与所述候选药剂接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述候选药剂的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平进行比较，而观察所述候选药剂的效果，(d)从所述观察到的效果获得所述药剂，其中在与所述测试组合物接触的生物样品的等分试样中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平与在没有接触所述测试组合物的生物样品的等分试样中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表达水平之间存在至少10%的差异是所述候选药剂效果的指示。优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少25%。更优选地，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少50%。在另一个实施方案中，步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少75%，100%，125%,150%,175%, 200%,300%,400 %，500 %或I，000 %。步骤d)中测定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表 达水平的差异可以多达10，000或50，000%。步骤d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异优选地在10%到10，000%之间，更优选地，25%到10，000%，50%到 10，000%, 100%到 10，000%，甚至更优选地25%到 5，000%,50%到 5，000%, 100%到 5，000%。在一个优选实施方案中，所述候选药剂是候选的抑制剂或候选的增强剂。在本发明的另一个实施方案中，提供了通过按照本发明的方法获得的候选药剂。在另一个实施方案中，提供了包括按照本发明的药剂的药物制剂。在另一个实施方案中，将按照本发明的一种药剂用于制备抑制肺癌发展的组合物。在本发明的另一个实施方案中，提供生产药物的方法，其包括本发明的方法的步骤以及(i)以足以对受试者提供治疗有效量的所述药物的量合成在步骤(C)中鉴定的候选药剂或其类似物或衍生物；和/或(ii)将步骤(C)中鉴定的候选药物候选药剂或其类似物或衍生物与药用载体组
八
口 ο在另一个实施方案中，应用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、选择性与磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白结合的抗体来获得候选药剂,或者来选择在患者中抑制肺癌发展的组合物。在本发明的另一个实施方案中，考虑包括针对磷酸化MAPK和/或磷酸化Akt蛋白的抗体的试剂盒。本领域已知的这样的试剂盒还包括塑料器皿，例如，其可以在扩增步骤中用作96或384孔形式的微量滴定板，或者只用作普通反应管，例如由Eppendorf，Hamburg，德国制备，并且所述试剂盒包括实行按照本发明的方法的所有其它试剂，所述方法优选地为免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫吸附测定(FIA)、化学物质联接的免疫吸附测定(CLIA)、放射免疫测定(RIA)和免疫印迹。关于可以应用的不同免疫检测的综述，参见:Lottspeich 和 Zorbas (eds. ), Bioanalytik,第一版 1998, SpektrumAkademischer Verlag, Heidelberg, Berlin,德国。提供下述实施例、参考文献、序列表和附图
以帮助理解本发明，在附上的权利要求中阐述本发明真正的范围。应该理解，在不背离本发明的实质时，在提出的步骤中可以进行更改。附图描沭
权利要求
1.特异性结合磷酸化的AKT蛋白或磷酸化的MAPK蛋白的试剂在制备用于通过确定磷酸化AKT蛋白和磷酸化MAPK蛋白在生物样品中过表达来确定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的试剂盒中的应用， 由此所述磷酸化AKT蛋白和磷酸化MAPK蛋白的过量表达是所述包含人肺癌细胞的生物样品对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的指示，其中所述磷酸化的AKT蛋白是在与Aktl蛋白氨基酸位置473对应的氨基酸位置被磷酸化，和所述磷酸化的MAPK蛋白在与MAPKl的氨基酸位置202和204对应的氨基酸位置被磷酸化， 其中所述磷酸化AKT蛋白和磷酸化MAPK蛋白在所述生物样品中的过量表达通过下列步骤测定 a)将所述生物样品进行免疫组织化学染色， b)在肉眼观察生物样品中细胞的染色后，对于所述磷酸化的AKT蛋白和磷酸化的MAPK蛋白的表达水平，指定一个选自数字1，2, 3和4的等级，由此指定关于表达水平的最闻可检测等级， c)确定在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百分比， d)将在免疫组织化学染色的生物样品中具有最高可检测等级的细胞的百分比乘以指定的等级并且乘以100,和 e)当步骤d)的乘法结果高于100时，确定所述生物样品中磷酸化的MAPK蛋白过量表达，和当步骤d)的乘法结果高于300时，确定所述生物样品中磷酸化的AKT蛋白过量表达。
2.权利要求I的应用,其中步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少10%。
3.权利要求2的应用，其中步骤a)和b)中测定的磷酸化的AKT蛋白和磷酸化的MAPK蛋白的表达水平的差异为至少25%。
4.权利要求I的应用，其中所述生物样品是原发性肺肿瘤或转移瘤。
5.权利要求I的应用，其中所述表皮生长因子受体抑制剂是N-(3-乙炔基苯基)_6，7- 二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
6.权利要求I的应用，其中所述化学治疗剂是吉西他滨或顺钼。
7.权利要求I的应用，其中所述特异性地结合所述磷酸化的AKT蛋白或磷酸化的MAPK蛋白的试剂是抗体、抗体衍生物或抗体片段。
8.权利要求I的应用，其中MAPK蛋白的氨基酸序列为氨基酸序列SEQID NO :1或2，AKT蛋白的氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO :6，7或8。
9.权利要求I的应用，其中表达水平是应用选自由下列各项组成的组的方法进行测定蛋白质组学、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。
全文摘要
本发明涉及一种测定包含人肺癌细胞的生物样品是否对表皮生长因子受体抑制剂和化学治疗剂的组合敏感的方法，所述方法通过测定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白在生物样品中的过量表达而进行。本发明还涉及用于获得候选药剂或者用于选择抑制患者肺癌发展的组合物的方法，其中应用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白。
文档编号G01N33/574GK102854315SQ201210321790
公开日2013年1月2日 申请日期2006年5月10日 优先权日2005年5月11日
发明者乌尔里克·布伦沙伊特, 阿斯特丽德·黑勒, 韦雷娜·卢策, 约阿希姆·默克斯, 卡罗尔·沃德 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司