专利名称：伤寒、甲型副伤寒沙门菌荧光定量pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
伤寒、甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，尤其涉及一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术：
伤寒(typhoid fever)是由伤寒杆菌引起的急性传染病，以持续菌血症，网状内皮系统受累，回肠远端微小脓肿及溃疡形成为基本病理特征。副伤寒是甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起的急性消化道传染病。可因水源和食物污染发生爆发流行。伤寒病与副伤寒均是我国法定乙类传染病，也是世界性的主要公共卫生问题之一。它们的病原伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌是肠杆菌科沙门菌属，革兰染色阴性，呈短杆状，长I 3. 5 μ m，宽O. 5 O. 8 μ m，周有鞭毛，能活动，不产生芽胞，无荚膜。兼性厌氧，最适的生长温度为35 37°C， Ph6.8 7.8。它们对营养的要求不高，普通培养基即可生长出圆形、光滑、湿润、半透明边缘整齐的菌落，但沙门菌经人工传代后会从光滑型菌落逐步过渡为粗燥型菌落。不发酵乳糖， 在SS琼脂平板上形成的菌落中心呈黑色。
目前对于伤寒沙门菌引起的伤寒及甲型副伤寒沙门菌引起的副伤寒的诊断方法包括
I.血常规检验白细胞数一般在(3飞)X 109/L，中性粒细胞减少，嗜酸性粒细胞减少或消失。嗜酸性粒细胞计数随病情好转而恢复正常，对伤寒的诊断与病情评估有一定参考价值，但不能检出是否有伤寒杆菌和副伤寒杆菌存在。
2.病原菌培养血培养为最常用的确诊依据。伤寒病程第广2周的阳性率最高 (80°/Γ90%),第3周约为50%,第4周后不易检出。可作为常规检验的依据。
3.肥达(Widal)反应通常在病后I周左右出现抗体，第Γ4周的阳性率可达70% 以上，效价亦较高，并可维持数月。有少数患者抗体阳性较迟出现，或者抗体效价水平较低。 约有109Γ30%患者肥达反应始终为阴性。“O”抗原为伤寒沙门菌
4.和副伤寒甲、乙、丙杆菌的共同抗原，血清中检出高效价“O”抗体不能区别四种不同的病原菌感染，但四者的鞭毛抗原(“H”、“A”、“B”、“C”)不同，可从四者的特异性抗体效价上升来判断感染的菌种。对未经免疫者，“O”抗体的凝集效价在1:80及“H”、“A”、“B”、 “C”抗体在1:160或以上时，可确定为阳性，有辅助诊断价值。通过每5 7日复检I次，若效价逐渐上升，价值较大。若只有“O”抗体上升，而“H”、“A”、“B”、“C”抗体不上升，可能是发病早期；若相反，只有“H”、“A”、“B”、“C”抗体上升而“O”抗体不增高可能是因其他发热性疾患所致的非特异性回忆反应。沙门菌D群与A群有部分的共同抗原，后者的感染可产生 “O”与“H”抗体的交叉反应。
5.其它检查一些新的免疫学诊断方法，包括PCR检测技术。常规PCR检测相对于传统的培养法具有快速、灵敏的优点，但临床常规应用中还有效果不稳定，容易出现交叉污染等问题。发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR 检测试剂盒，旨在解决现有技术中对于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测的周期长、操作繁琐、灵敏度低的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR 检测试剂盒，包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ IDNO :1和SEQ ID N0:2，该特异性探针序列为SEQ ID NO :3，针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO :4和SEQ IDNO :5，该特异性探针序列为SEQ ID NO :6，该第二反应液包含DNA 聚合酶O。
本发明实施例的另一目的在于提供本发明的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。
本发明的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒利用荧光定量PCR技术，避免了传统培养法中操作周期长、步骤繁琐等不足，具有快速准确灵敏度高等优点。而且本发明的试剂盒在用于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的应用过程中可直接利用血液样本进行检测，不需要DNA提取，缩短了检测时间，避免样本间交叉污染，结果准确可靠。


图I是现有技术中突光定量PCR检测结果示意图2是本发明实施例的试剂盒的PCR检测阳性结果判定示意图3是本发明实施例的试剂盒的PCR检测阴性结果判定示意图4为本发明实施例3的PCR检测阳性结果；
图5为本发明实施例3的PCR检测阴性结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，该特异性探针序列为SEQ ID NO :3 ;针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，该引物对序列为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，该特异性探针序列为SEQ ID NO 6 ;该第二反应液包含DNA聚合酶 O。
本发明实施例利用荧光定量PCR技术，其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图I所示，Ct值为每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，而在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可据此进行定量分析。
具体地，本发明实施例的试剂盒中，第一反应液中包含的反应缓冲液含有25mM 的 MgCl2、不含续离子的 lOXbuffer、dNTPs。其中 dNTP 为 deoxy-ribonucleoside triphosphate (脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写，在本发明实施例中dNTP包括dATP、dGTP、 dTTP、dCTP，用于作为PCR反应的原料。
具体地，本发明实施例的试剂盒中，第一反应液中针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2和特异性探针SEQ ID NO :3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5和特异性探针SEQ IDNO 6序列如表I所示
表I针对伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针序列
权利要求
1.一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，包含第一反应液、 第二反应液及石蜡，所述第一反应液包含反应缓冲液；针对伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，所述针对伤寒沙门菌的引物对序列为SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针序列为SEQ ID NO :3 ;以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对和特异性探针，所述针对甲型副伤寒沙门菌的引物对序列为SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，所述针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针序列为SEQ ID NO :6，所述第二反应液包含DNA聚合酶O。
2.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO :3和针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针SEQ ID NO :6的5’端连接有FAM或HEX，3’端连接有DABCYL或BHQ。
3.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液含有25mM的MgCl2、不含镁离子的IOXbuffer和dNTPs。
4.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液还包含显色液。
5.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和所述第二反应液被所述石蜡隔开。
6.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO 1和SEQ IDNO :2，所述针对伤寒沙门菌的特异性探针序列SEQ ID NO :3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO 4和 SEQ ID NO :5，所述针对甲型副伤寒沙门菌的特异性探针序列SEQ ID NO :6在与所述第一反应液中其他组分混合前浓度为45-55 μ M0
7.如权利要求I所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶O在与所述第二反应液的其他组分混合前的浓度为40-44U/μ L。
8.如权利要求I至7中任一项所述的伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测包括PCR反应，所述PCR反应条件为50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10s,55-60°C 40-80s ;40 个循环。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测包括利用全血直接进行PCR反应的步骤。
全文摘要
本发明适用于生物技术和医学领域，提供了一种伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含第一反应液、第二反应液及石蜡，该第一反应液包含反应缓冲液，针对伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2和特异性探针SEQ ID NO3，以及针对甲型副伤寒沙门菌的引物对SEQ ID NO4和SEQ ID NO5和特异性探针SEQ ID NO6；该第二反应液包含DNA聚合酶O。本发明还提供了该试剂盒在伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。本发明的检测试剂盒缩短了检测时间，避免样本间交叉污染，结果准确可靠。
文档编号G01N21/64GK102978282SQ201210457269
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者卢柳燕, 吴成贡, 田仁鹏, 吴炳义 申请人:深圳市生科源技术有限公司