专利名称：水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处
理方法。
背景技术：
硝基呋喃类药物(Nitrofurans)是人工合成的具有5_硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，对常见的革兰氏阳性菌、阴性菌均有作用，主要适用于肠道细菌感染及原虫病。硝基呋喃类对光敏感，在生物体内代谢迅速，由于原药及其在动物体内残留的代谢产物有致畸、致突变和致癌的危险，出于安全性考虑，欧美等发达国家及我国先后颁布了禁止使用该类兽药的禁令。所以在食品安全的检测中检测硝基呋喃代谢物。入世后，动物源性食品中抗生素残留量的检出已成为世界肉类贸易中的重要技术指标和技术壁垒之一。我国出口欧盟的水产品，如鱼虾等曾被检出过含有呋喃唑酮、呋喃西林等兽药残留，这已严重制约了我国水产品的出口。近年来报导了一系列在鱼、虾、贝类等样品中检测硝基呋喃类代谢物的检测方法，其中以酶联免疫法的报导最多，并有一些商品化的试剂盒出现。然而，酶联免疫法的缺点也很明显,一般一个试剂盒只能检测一种硝基呋喃类代谢物,并且试剂盒的成本较高。因此，目前对硝基呋喃类代谢物的检测，国际上通用的方法依旧是经2-硝基苯甲醛衍生化后用液相色谱-串联质谱法测定，而该方法的关键是样品的前处理技术。

发明内容
本发明的目的在于提供一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，经该方法处理后的待测样品能够直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。该前处理方法与现有国标方法相比，具有操作简单有效、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法包括以下步骤
(1)称取2.00 g(精确至O. 01 g)水产品于50 mL离心管中；
(2)往上述离心管中加入O.2 mol/L盐酸15 mL和O. 2wt%邻硝基苯甲醛-乙腈溶液O. 5 mL，充分涡旋摇匀，在37°C下恒温振荡14 16 h ；
(3)将离心管取出，适当冷却后用pH缓冲液调节pH至7.O 7. 5 ;
(4)往离心管中加入20mL乙酸乙酯,加盖振荡萃取3min,在3500r/min离心5min,用塑料吸管将上清液吸取到150mL鸡心瓶中，40°C下减压旋转蒸发至干；
(5)用2mL乙腈水(体积比为I :9)溶液和2 mL乙腈饱和正己烷洗脱，洗脱液于15000r/min高速离心分层，取下层清液用O. 25 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液即为待测液。所述的水产品包括鱼、虾、蟹。 所述步骤(3)中的pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。所述步骤(4)中的萃取溶液为乙酸乙酯,萃取次数为I次。
本发明的显著优点为
(1)在国标方法中的衍生剂用二甲亚砜溶解；本发明则用乙腈溶解，可有效减少样品中的溶剂成分(因为后面会用到乙腈作为洗脱剂)，有利于提高后续步骤的洗脱效果。(2)在本发明中调pH=7_7. 5时采用磷酸盐缓冲体系，更有利于调酸；而国标方法直接用NaOH调pH。(3)流程中直接用20 mL乙酸乙酯萃取一遍后高速离心取此层浓缩；而国标方法萃取2次,每次用量40mL,萃取后用NaCl水溶液洗漆，乙酸乙酯层过无水硫酸钠后浓缩。由于目标物分配比大，流程操作方法简单可行，可有效减少前处理步骤，缩短分析时间。


图I是本发明的水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法流程图。图2是呋喃唑酮代谢物(AOZ )的衍生产物的MRM谱图。图3是呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生产物的MRM谱图。图4是呋喃妥因代谢物(AHD )的衍生产物的MRM谱图。图5是呋喃西林代谢物(SEM)的衍生产物的MRM谱图。
具体实施例方式一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法包括以下步骤
(1)称取2.00 g(精确至O. 01 g)水产品于50 mL离心管中；
(2)往上述离心管中加入O.2 mol/L盐酸15 mL和O. 2wt%邻硝基苯甲醛-乙腈溶液O. 5 mL，充分涡旋摇匀，在37°C下恒温振荡14 16 h ；
(3)将离心管取出，适当冷却后用pH缓冲液调节pH至7.O 7. 5 ;
(4)往离心管中加入20mL乙酸乙酯,加盖振荡萃取3min,在3500r/min离心5min,用塑料吸管将上清液吸取到150mL鸡心瓶中，40°C下减压旋转蒸发至干；
(5)用2mL乙腈水(体积比为I :9)溶液和2 mL乙腈饱和正己烷洗脱，洗脱液于15000r/min高速离心分层，取下层清液用O. 25 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液即为待测液。所述的水产品包括鱼、虾、蟹。所述步骤(2)中O. 2wt%的邻硝基苯甲醛配制方法如下称取160毫克邻硝基苯甲醛，用光谱纯的乙腈溶解后，用同种类的乙腈定容至10毫升。所述步骤(3)中的pH缓冲液为浓度为I. O摩尔每升、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液。所述步骤(4)中的萃取溶液为乙酸乙酯，萃取次数为I次。步骤(5)中的O. 25 μ m微孔滤膜为有机相滤膜。实施例I
以下实施例结合附图来叙述本发明的具体工作原理
本发明所说的水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法的具体操作流程如图I所示。首先是待测样品的称取、溶解。然后在37 °C下恒温振荡1Γ16 h对样品的硝基呋喃代谢物进行衍生。接下来用I. O摩尔每升、pH为7. 4的磷酸盐缓冲液调节衍生后的溶液pH至
7.O 7. 5，然后用乙酸乙酯对经衍生后的硝基呋喃代谢产物进行萃取。这一操作将使样品中的硝基呋喃代谢产物与复杂的样品基质进行分离。最后再用制备色谱进一步纯化经乙酸乙酯萃取物，得到能够直接进高效液相色谱柱进行分离检测的产物。具体步骤
(1)称取2.00 g(精确至O. 01 g)烤鳗样品于50 mL离心管中；
(2)往上述离心管中加入O.2 mol/L盐酸15 mL和O. 2%邻硝基苯甲醛溶液O. 5 mL,充分涡旋摇匀，在37 °C下恒温振荡1Γ16 h ；
(3)将离心管取出，适当冷却后用pH缓冲液调节pH至7.O 7. 5 ;
(4)往离心管中加入20mL乙酸乙酯,加盖振荡萃取3min,在3500r/min离心5min,用塑料吸管将上清液吸取到150mL鸡心瓶中，40 °C下减压旋转蒸发至干；
(5)用2mL乙腈水(I 9)溶液和2 mL乙腈饱和正己烷洗脱，洗脱液于15000r/min高速离心分层，取下层清液用O. 25 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机测试。精密度对比数据
权利要求
1.一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，其特征在于所述的前处理方法包括以下步骤 (1)称取2.OO g水产品于50 mL离心管中； (2)往上述离心管中加入O.2 mol/L盐酸15 mL和O. 2wt%邻硝基苯甲醛-乙腈溶液O.5 mL，充分涡旋摇匀，在37°C下恒温振荡14 16 h ； (3)将离心管取出，适当冷却后用pH缓冲液调节pH至7.O 7. 5 ; (4)往离心管中加入20mL乙酸乙酯,加盖振荡萃取3min,在3500r/min离心5min,用塑料吸管将上清液吸取到150mL鸡心瓶中，40°C下减压旋转蒸发至干； (5)用2mL乙腈与水的体积比为I :9的混合溶液和2 mL乙腈饱和正己烷洗脱，洗脱液于15000r/min高速离心分层，取下层清液用O. 25 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液即为待测液。
2.根据权利要求I所述的水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，其特征在于所述的水产品包括鱼、虾、蟹。
3.根据权利要求I所述的水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，其特征在于所述步骤(3)中的pH缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求I所述的水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，其特征在于所述步骤(4)中的萃取溶液为乙酸乙酯，萃取次数为I次。
全文摘要
本发明公开了一种水产品中硝基呋喃代谢物检测的前处理方法，该方法包括待测样品的称量、溶解、衍生、萃取和层析分离步骤；所用仪器包括恒温振荡器、减压旋转蒸发仪、硅胶层析柱和高速冷冻离心机；用本方法制备出的样品溶液可以直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。该前处理方法与现有国标方法相比,具有操作简单有效、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性，有望在环保、商检及出入境检验检疫等行业大规模推广应用，具有显著的经济和社会效益。
文档编号G01N30/06GK102621252SQ201210070890
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者陈劲星 申请人:福建中检华日食品安全检测有限公司