专利名称：生物标记物成像期间增加可检测光子数目的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的使来自生物标记物的光信号红移的方法。尤其本发明涉及发光的生物标记物和荧光团之间的激发 机制。本专利申请还涉及用于实施根据本发明方法的试剂盒以及未结合的荧光团产生光子的用途，与生物标记物产生的光子相比，未结合的荧光团产生光子为红移的。
背景技术：
产生光信号的生物标记物的用途已经改革了生命科学的多个方面，特别是其允许实时观察体内如内吞作用、胚胎发育、感染、肿瘤发展和钙信号的现象。越来越多地，此类相同的技术还被用于使更多的生物和药学过程在靶细胞、分离的组织或整个生物体中原位可视化。实质上有三个用于使用生物标记物产生基于光信号的光发射的机制I、生物发光。2、化学发光。3、荧光。生物发光是由活生物体或其片段如酶产生和发射光。生物发光是化学发光(见下文)的天然发生的形式，其中能量通过化学反应以光发射的形式释放。在大多数生物发光反应中涉及三磷酸腺苷(ATP)，因而通常生物发光反应发生在体内。化学发光是化学反应产生的光的发射。其不同于生物发光，因为化学反应的成分没有必要发生在体内。荧光是由吸收不同波长辐射的物质的光发射。在大多数情况下，某一波长的光的吸收诱导具有更长波长的光的发射。荧光分子通常称为荧光团，在激发后光的发射中不涉及化学反应。以生物发光为例，已经用编码生物发光探针(如水母发光蛋白(aequorin)或各种荧光素酶)的基因进行遗传修饰的生物体的使用，允许在活生物体或小动物模型中使得许多生物过程非侵入地可视化(1-3)。生物发光成像是高度敏感的，理由在于由于哺乳动物组织的非常低水平的内在生物发光，在完整生物体如小鼠中，信号可被视觉检测(4)。生物发光探针，如水母发光蛋白(5、6)或酶荧光素酶(细菌、萤火虫、海萤(Cypridina) (7)或海肾(Renilla) (8))已被整合到宿主细胞或病原体中用于生物发光成像。这些工具已被应用于范围从感染和肿瘤发展到钙信号的研究。然而，这些生物标记物的大多数在色谱的蓝一绿一黄(400-650nm)区域内发射光(9)，其与哺乳动物组织的主要吸收谱重叠，特别地与氧合血红蛋白、脱氧合血红蛋白和黑色素的吸收谱重叠，从而降低了检测效力(1、10)。由于这些吸收物的存在，体内光学成像中的主要挑战是通过开发近红外(NIR)红谱(650-900nm)发射光的光学探针，实现更高水平的灵敏度，在活哺乳动物组织中，该光仅被微弱吸收。即使有这些缺点，该技术的使用其自身已便于应用于涉及比如麻醉的和非麻醉/清醒的小啮齿动物的实验中(21)。如上所述，在小啮齿动物模型中(以及更通常地在哺乳动物中)，容易在色谱的蓝一黄区域中被吸收的各种血红蛋白和组织的存在降低了激发和检测荧光团的能力，或者如果其在相同谱中，降低了监测由修饰的细胞和细菌产生的发光信号的能力。改善来自生物发光源的可检测光子的数目的显著努力导致开发了大量新的和/或改善的生物发光探针以及增加在色谱红区域(>650nm)发射光子的数目的技术。没有证实由于太难而不能够设计在近红外(NIR)-红区即能激发又能发射的荧光团或荧光蛋白(22)。但是，已经证实，为了实现生物发光发射的相似红移更加困难。一种建立所需红移的方法已经开发能够在光谱NIR红区部分的这一部分发射的荧光素酶变体。但是，目前为止开发的大多数突变体/突变已经导致在黄一绿区域发射(9)，并且仅有几个成功的红色 生物发光产物的实例(11)，而且这样的NIR红区工程化的蛋白质通常产生比非工程化黄一绿版本显著更低的信号。考虑到产生NIR红区生物发光的困难，因而显著的努力已经朝向了创造可用的方法以使用生物发光共振能量转移(BRET)在发射的光子中产生红移(13)。一些小组已经证实利用结合至QDs的荧光素酶(8)或其它具有大的斯托克斯位移的荧光团(7)的技术是成功的。在这些以前的方法中,研究者调查了通过使海肾线虫(Renilla reniformis)的八突变变体缀合至量子点的BRET，其中海肾线虫作为能量供体，量子点(QDs)作为能量受体，从而实现能量转移后来自QD的在655nm处的发射峰值(8)。更最近地，将生物素化的海萤荧光素酶缀合至远红荧光靛青衍生物，在675nm提供了发射峰(7)。但是，在BRET中，供体和受体必需极为贴近(IOnm以下(12-15))，因为其涉及从发光供体至受体的非辐射能量转移。BRET的使用已经非常成功，但是实施可能困难，因为为了使供体荧光素酶缀合至受体QD或其它荧光团来实现想要的共振能量转移，必需利用各种合成技术。使生物标记物结合至QD或其它发射受体的“红”光子的需要，可能使生物标记物作为使“体内”细胞、组织或生物体可视化的手段的效率降低。适当时，这可以是干扰生物标记物产生信号和/或自由移动从而结合其靶的功能或能力的结果。

发明内容
在本专利申请中，发明人提供了一种共振能量转移(RET)的替代，其不需要紧密分子接近的供体和受体源，但仍然能够提供从生物标记物发射的光子中想要的红移。这种现象的术语为不受发光约束的激发所产生的突光(Fluorescence by Unbound Excitationfrom Luminescence(FUEL)),不同于RET,因为供体和受体不需要是接近的分子,且FUEL可以在基本上较大的距离上发生(微米或更远)。根据本发明的第一个方面，其提供了一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物的方法,包括步骤a)提供适于FPP-L产生至少一个第一光子的条件；b)提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FPP-U，其中步骤a)的所述至少一个第一光子激发所述FPP-U，FPP-U发射至少一个第二光子；
所述方法的特征在于所述FPP-L和所述FPP-U不结合，且特征在于所述至少一个第二光子的每个比所述至少一个第一光子的每个能量更低。FUEL涉及FUEL探针对(FPP)的使用，其由两个成分组成FPP下游(FPP-L)和FPP上游(FPP-U)，其均可以是生物标记物。例如，可以将加RFP标签的寄生虫引入易感的加GFP标签的细胞和所研究的细胞感染中。在此情况中，FPP-L,例如QD，也存在于所研究的系统中，其发射光子，从而激发RFP导致可检测的来自RFP的进一步的光子发射。因而，生物标记物是加标签的寄生虫，但这也是 FPP-U。或者，只要具有使其发射光子的条件，例如，内源或外源的激发光，加GFP标签的细胞可以是FPP-L，这些GFP光子然后激发置于接近细胞的FPP-U，其中然后可检测到来自FPP-U的光子。
在两种情况中，使用FUEL可检测生物标记物的存在。FPP-L可以是发光的生物标记物，此生物标记物可以是，但不局限于，生物发光的、化学发光的或包括荧光蛋白的荧光团/荧光探针。FPP-U还是发光分子，发光分子可以是，但不局限于，包括量子点、荧光蛋白、碳纳米管、纳米金刚石或金属卟啉的荧光团/荧光探针。FPP-L的发射谱有必要与FPP-U的激发谱重叠，以保证红移的光子的充分产生。根据本发明的另一个方面，许多中间FFPs可以被插入到生物标记物和最终FPP-U之间的光子激发和发射的级联(cascade)当中，其产生可观察的光子。因此，特别地，本发明涉及一组FPPs，其每一个具有与在级联中在先成员的发射谱重叠的激发谱，继而产生级联中在后成员的激发谱内的光子。根据本发明的这一方面，其提供了一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的“级联”方法，包括步骤a)提供适于第一 FPP产生至少一个第一光子的条件；b)提供置于接近所述细胞、组织或生物体的第二 FPP，其中步骤a)的所述至少一个第一光子激发所述第二 FPP，第二 FPP发射至少一个第二光子；其中步骤b)至少再重复一次，其中对于每个额外的步骤进一步FPP置于接近所述细胞、组织或生物体，而不是所述的第一或第二 FPP，其中所述进一步的FPP特异地被至少一个在先前步骤中发射的光子所激发，且其随后发射至少一个进一步的光子；其中，在最终步骤中检测所述进一步的光子；所述方法的特征在于所述多个FPPs不结合，且特征在于每个所述至少一个光子比每个来自之前步骤的所述至少一个光子的波长更长。在本方法的一个优选的实施方式中，其中所述生物标记物是所述第一或所述第二FPP。此处涉及FPP-Ls或FPP-Us特性的任何详述的特异性特征可应用于本“级联”方法中使用的多个FPP。此方法涉及被生物标记物(比如生物发光的细菌)发射的光子所充分激发的FPP-Us作为增强体内生物标记物非侵入检测手段的用途。量子点是由半导体核心物质(例如CdSe)和用官能化聚乙二醇(PEG)或其它外涂层共价修饰的两亲聚合物涂层组成的纳米晶体(10-40nm大小)(16)。QDs特征性地具有宽广的吸收谱，以及窄的发射谱，几乎适于所有可应用的激发波长(17)，具有范围从60-85%的量子效率(18、19)。碳纳米管是具有圆柱形结构的碳同素异形体，是富勒烯结构家族成员。单壁纳米管能够具有大约Inm的直径。碳纳米管具有大的斯托克斯位移，能够从大约600nm开始被激发，而在900nm以上发射(28)。突光蛋白是非常常见的应用。最早纯化于水母(Aequorea victoria)的绿色突光蛋白现在通常被克隆至许多细胞和动物中。已经开发了大量的衍生物用于几乎每个激发和发射波长。这些蛋白质可能具有大的量子效率，但是，通常地，其不具有大的斯托克斯位移。金刚石纳米晶体，或纳米金刚石，生产于具有高氮含量的金刚石材料。这些富含氮的金刚石被高能电子辐射产生带负电的氮空位中心。而后被辐射的金刚石在高温下退火以增加中心。这些材料可能具有名义上IOOnm的大小，具有以560nm为中心的吸收，并在700nm高效地发射。据报道它们具有接近I的量子效率，在化学和生物上是惰性的，可在其上进行 表面化学作用(surface chemistries) (29、30)。金属卟啉，特别是钼、钯和钌卟啉具有一些有趣的性质。它们通常在400nm或更低时可被激发，而在650nm以上的波长发射。许多金属卟啉具有在500_550nm间的二级激发范围。上述列表中的金属卟啉也是氧敏感的，因而它们的发光强度和寿命衰减率是局部氧浓度的函数(31-33)。在本专利申请中，术语“光子能量”和“光信号波长”用于描述由FPP-L和FPP-U发射的光子/信号的各方面。因为电磁辐射被认为既是粒子(光子)又是电磁波，所以相同的光子/波将具有能量值以及波长。这些不同值的关系是直接的，通常认为光子的能量越低波长越长。因而，当提到由FPP-U产生的第二光子比由FPP-L产生的第一光子具有更低的能量时，也可以认为第二光子的波长大于第一光子的波长(这也是事实)。根据本专利申请，生物标记物可以是用于使用FUEL使光信号红移的FPP的FPP-L。或者，生物标记物可以是最终通过系列中间激发导致光信号红移的一系列FPPs中的第一个。因而，生物标记物的参照可以是FPP-L的参照或一系列FPPs中的第一个的参照。或者，生物标记物可以是FPP-U，其中其被所研究的系统中存在的FPP-L激发或者其可以是FPPs级联中的一个FPP。根据本发明，术语“体外”指的是任何来自活的或死的生物体的细胞、组织、有机物或其它材料的混合物或溶液，在预定义的条件下，所述混合物或溶液组合有化学物质、试剂。根据本发明，术语“体内”指的是当在完整的动物上进行时，使用任何来自活的或死的生物体的细胞、组织、有机物或其它材料的混合物或溶液所进行的任何操作，在预定义的条件下，所述混合物或溶液组合有化学物质、试剂。根据本发明，适于允许生物标记物产生至少一个光子的条件将取决于选定的生物标记物而不同。例如，在生物发光的生物标记物，例如荧光素酶的情况下，有必要诱导/允许该酶的表达，然后提供酶可以在体内、体外或在原位产生光信号的条件，如果有必要，提供荧光素酶可能需要利用的所有成分试剂。同样地，对于化学发光的生物标记物，反应所需的所有的成分试剂有必要存在，或者在荧光生物标记物的情况下，适合的激发光源有必要存在。根据本发明，生物标记物可以在靶细胞、组织或生物体的内部；或者置于其一些或所有的表面；或者即在这些目标的内部又在表面。根据本发明，FPP-U位于接近靶细胞、组织或生物体，特别地，其可能位于这些结构内和/或其表面上和/或围绕这些结构的介质内，条件是不发生RET。特别地，FPP-U必须足够地接近生物标记物，从而使得由生物标记物产生的光子可以激发FPP-U，其继而可以产生至少一个第二光子。根据本发明，生物标记物和FPP-U是非共价地，或通过任何其它手段彼此相互结合，这意味着它们在靶细胞、组织或生物体中彼此不相互结合，以这样一种方式即其中RET可能发生。根据本专利申请，生物标记物可以是任何生物发光、荧光或化学发光的分子、化合 物、酶或产生确定性质的光子的其它结构。例如生物发光的大肠杆菌(Escherichia coli)(命名为RT57)(20)，其携带表达IuxCDABE操纵子的质粒，该质粒包括编码具有以480nm为中心的发射的生物发光产物的基因，所述大肠杆菌被用于此处一些具体实施例中在体外和体内条件下激发量子点。如上所述，发明人现已经表明BRET在生物标记物的输出的红移中不是必要的步骤。例如，在此处的表I中使用Cy5. 5滤光器，观察到当允许生物发光细菌RT57和QD705共同设置时，观察到从FPP-U、QD705的显著发射，当全距离接近3cm时(包括IOmm的琼脂)仍然发现实质上的增加，分隔两种成分(6. 10±1. 79相对于2. 21 ± I. 00)导致FUEL。图4显示在远超出共振能量转移的距离下可能发生FUEL现象。该比较表明(I)生物发光细菌能够从相当的距离激发QDs，和(2)为实现FPP-U高效激发，策划的BRET条件不是必需的。考虑到光子发射物和荧光团的相对大小，与包含它们在内的总体积相比，当发光源和荧光探针没有结合在一起时，BRET发生的可能性充其量是最小的。因此，当发光细菌和QD705非常接近时有更多的红光子这一事实最有可能归因于增加的能够激发FPP-U的光子的数目。换言之，观察到的光子流越大FPP-U越接近生物标记物，通过生物标记物发射的光子激发FPP-U的可能性增加。相反地，FPP-L和FPP-U间的距离越大，激发的可能性越小，这解释了红光子的降低。考虑到激发的相当距离(μ m-cm,图3_6)，FPP_U的激发是辐射过程，并不涉及RET所必需的偶极子一偶极子的相互作用。尽管此处描述的方法描述了生物发光的特定参照，其可以扩展到其它辐射能量转移系统，比如突光和化学发光。在生物标记物和产生可检测信号的FPP-U间直接接触的缺少，经初步检查可被争论为表明在FUEL方法中缺少特异性，但是，如图3-6和表I中所示的，吸收物(在此情况中为刚果红)的存在证明了生物标记物和FPP-U间距离的依赖性。因此，FUEL能够鉴定特定位置中生物发光细菌的存在，或者，潜在地，鉴定细菌和“标记的”细胞间的相互作用。从图
3、4、7中，还能推断由于FPP-U光子中的红移，这些细菌的检测可能发生在较低的滴度，增加了生物发光成像的总灵敏度。在本专利申请中，发明人还提出了一套体内实验，进行该实验以确定在典型的实验条件下FUEL的可行性。如图9和10和表3和4中所见，存在强大的证据表明FUEL现象可以被容易地利用。但是，对于生物发光成像的FUEL的有效性和有用性主要地依赖于FPP-U。发明人认为QDs适合于短期用作根据此处描述的FUEL技术的FPP-U，有许多利用QDs用于生物发光成像的理由，包括宽的吸收谱、窄的发射谱、显著的斯托克斯位移和接近I的量子效率。在测量时QDs必须存在于宿主或靶。在图9的情况中，注射后立即使小鼠成像(对照表明在几小时内没有可能改变细菌、量子点或它们的FUEL相互作用定量的显著扩散)。因此，发明人证明了没有必要使用BRET使生物发光光子红移至光学上更希望的深红或NIR。不受发光约束的激发可以且确实发生在生物标记物(如生物发光细菌)和FPP-U(即QD)之间，如果没有生物发光吸收物存在，这种转移发生在相当的距离。发明人已经表明FUEL的使用可以实质上增加体内和体外应用中红光子的数目，因而增加生物发光成像的灵敏度。 因而，根据本发明的另一些方面，生物标记物是生物发光的。现在许多生物发光的分子被常规用于标记、分离和监测细胞、病毒和相关物质的各种成分。实例包括水母发光蛋白或酶，其产生作为其催化来自各种生物体的如荧光素酶的反应产物的光子。所有此类生物发光标记物和变体可以被用作本专利申请的FPP-L。或者，生物标记物是化学发光的。或者，生物标记物是荧光的。特别地，生物标记物发射具有650nm以下波长的光子。最特别地，生物标记物发射具有400_650nm波长的光子。特别地，FPP-U发射具有波长大于FPP-L发射的光子波长的光子。特别地，FPP-U发射具有650_900nm波长的光子。尽管为FPP-L和FPP-U提供了特定的发射范围，这些成分没有必要被波长范围限定，关键的技术特征是每个FPP-L具有比其FPP-U更短的波长，FPP-L的发射谱与FPP-U的激发/吸收谱重叠，以及生物标记物(无论是FPP-L或FPP-U)发射的所有光子更容易被检测。根据本发明另一方面，生物标记物和/或FPP-U可以作为被研究的细胞、组织或生物体内的一个或多个拷贝存在。根据本发明的另一方面，方法包括在细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的至少两个生物标记物；其中至少两个生物标记物的每个发射在波长非重叠区域的光子，光子激发所述FPP-U的两亚组的至少一个，FPP-U发射至少一个光子，其中由各亚组FPP-U发射的至少一个光子在波长非重叠区域。除了使用FUEL从生物标记物的单一类型传导信号外，其还可能通过提供不同的FPP-Us亚组从几个生物标记物传导几个非重叠信号。这些FPP-U亚型的每个发射非重叠信号，从而允许不同生物信号的可视化。根据本发明的这一特定方面，不同的FPP-Us亚组可以是相同类型的分子，或者它们可以是不同类型的分子。在一个优选的实施方式中，FPP-U的一个亚组是QD，其它的亚组是碳纳米管。特别地，FPP-Us包括使其靶向所述细胞、组织或生物体特异性部分的装置。
可获得多种装置使特定分子或化合物靶向细胞内或细胞外位置，包括核定位信号、细胞渗透肽、抗体和适体。因而这种成分和FPP-U的组合将允许FPP-U被定位于最佳的位置，从而接受(如果存在)来自生物标记物的光子，并将其转化为可检测的信号。特别地，生物标记物可以是游离的或与靶细胞、组织或生物体的成分结合。例如，生物标记物可以是融合蛋白的部分。特别地，FPP-U置于细胞、组织或生物体内。或者，FPP-U置于细胞、组织或生物体外。或者，FPP-U置于细胞、组织或生物体内和外。 使用上面列出的特异机制使FPP-U定位于目标细胞、组织或生物体内或外，或仅通过调准可视化步骤使得允许FPP-U充分扩散至靶，本方法允许恰当的FPP-U定位从而最好地阐明由生物标记物产生的信号。根据本发明另一方面，生物标记物(FPP-L)和其配对物(FPP-U)可以相互结合，例如更大分子的成分，但是FPP-L和FPP-U并不相互结合，从而允许RET发生。根据本发明的第二方面，其提供了用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少至少一个根据本发明的FPP-U ;和用于进行本发明方法的说明书其中，至少一个FPP-U具有与生物标记物的发射谱重叠的激发谱，因而当置于接近所研究系统中的生物标记物时，将通过FUEL机制发射光子，光子继而可以被检测。特别地，根据本发明的这一方面，试剂盒可以包括至少一个根据本发明的生物标记物。特别地，试剂盒进一步包括吸收由所述生物标记物产生的光子的化合物。考虑到吸收物的存在将以其浓度的函数降低此距离，通过提供由生物标记物产生的光子的吸收物，试剂盒的使用者在进行本方法的同时，可以控制生物标记物和将允许FPP-U被激发的FPP-U之间的距离。对于生物标记物的每一个能想到的发射波长，已知有许多可能的吸收物，且所有此种吸收物包括在本专利申请中。根据本发明的另一方面，其提供了用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少一个根据本发明的FPP-L ;和
用于进行本发明方法的说明书其中，至少一个FPP-L具有与生物标记物的激发谱重叠的发射谱，因而当置于接近所研究系统中的生物标记物时，将通过FUEL机制使生物标记物发射光子，光子继而可以被检测。根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包括顺次与发射和激发谱重叠的多个FPPs，如此处详述地，其可被用于级联的FPP系统中。根据本发明的第三方面，提供了 FPP-U (例如未结合的QD)在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物中的用途，其中FUEL发生在生物标记物和未结合的QDs之间，导致了生物标记物发射的信号的红移。根据本发明另一方面，提供了 FPP-L在目标细胞、组织或生物体中产生光子和确定存在生物标记物中的用途，其中FUEL发生在FPP-L和生物标记物之间，导致了信号的红移。


为了更好地理解本发明，并表明如何有效地实施本发明，现将仅以实施例的方式说明本发明的具体实施方式
、方法和过程，并参照附图，其中图I :实验不同元素的吸收和发射谱。A. RT57的发射谱，QD705的激发和发射谱，以及刚果红的吸收谱。斜线(///)区指示RT57发射和QD705激发间的谱重叠。B.小鼠肺、血液和肝的吸收谱。图2.使用生物发光的大肠杆菌的QD705的不受约束的激发。生理水(列1)、RT57(列2)、QD705 (列3)以及RT57和QD705的混合物(列4)被等分到独立的I. 5ml离心管(eppendorftube)中，在开放的(Open)和Cy5. 5滤光器套件(set)(分别为第I和第2行)
下，曝光时间设定为5s，观察得到的发光。在开放的滤光器套件下，对RT57和RT57+QD705观察到相似水平的发光，而对于两个对照，没有观察到发光。当在Cy5. 5滤光器套件下观察时，与单独的RT57相比，对于RT57+QD705混合物观察到光子数目实质上的增加。使用O. 25s曝光时间通过荧光激发确认了 QD705的存在(第3行)。图3 =FUEL距离依赖性确认的实验设置A.示意图显示板的定位以及RT57和QD705的位置。指出了细菌和QD705之间的距离。B.条件I (四个琼脂板)和条件2 (两个琼脂板和两个CRAgar板)的板设置的照片。图4 :条件2的过夜生长实验A.在条件2下生物发光细菌的过夜生长曲线。B.条件2的最后一次点成像的实施例。C.列2、3和4与列I的比较表明可检测光子的增强。图5 :FUEL作用的距离依赖性。以逐渐增加距离将生物发光的大肠杆菌的等份(不可见的被一张黑纸覆盖)放置于充满QD705 (左)或水(右)的两个比色皿之间，检测获得的发光。来自FUEL作用的归一化发光强度作为距离的函数。使用三种不同的细菌培养物，一式三份地重复FUEL作用的距离依赖性。图6 :使用RT57的QD705的距离激发。将储备液RT57的等份放置于皮氏皿中央。以距RT57渐增加O. 5cm的间隔(中心至中心)直到2cm的总工作距离放置QD705的等份。(A)在Cy5. 5滤光器套件下获得的发光。(B)使用荧光激发证实的QD705等份的位置。(C)降低的QD705发射作为离RT57距离的函数。图7 :使用由一张黑纸分隔的两个石英串联比色皿建立几个实验条件，通过该实验条件确认来自QD705添加的红光子产生的增加。在纸上开了一个小窗口，以便允许生物发光的光子的通过。图8 :通过离体样本改善的发光检测。通过MWB、匀浆的肝、或匀浆的肺观察三种不同的RT57+QD705混合物的发光，并被来自相同条件下单独RT57所观察到的发光进行归一化。尽管在开放的滤光器套件下，发现混合物中观察到的光子数量增加(左)，而在Cy5. 5滤光器套件下，观察到红光子数量相当可观的增加(右)。
图9 QD705存在下可检测的光子增强的体内实施例。大腿肌肉注射细菌和细菌+QD705后在开放的、610LP和Cy5. 5滤光器套件中获得的成像。图10.体内证实FUEL。将两个不同的琼脂珠皮下插入雌性小鼠的左和右侧大腿。每个珠由琼脂糖+RT57核心组成。将琼脂糖或者在琼脂糖中的QD705混合物的第二层加入珠的核心，分别生成对照或FUEL珠。然后将小鼠置于成像系统，并通过开放的和QD705滤光器套件腹侧地和背侧地观测。正如可以看到的，当在开放的滤光器套件下腹侧观测小鼠时，观察到有限的红光子增强。由于仅存在一薄层的皮肤，预期只有有限的FUEL作用。但是，在QD705滤光器下容易地观察到了 FUEL作用。然后让小鼠旋转，从而在到达检测器前使任何珠的发光通过整个小鼠大腿。在这种情况下，在开放的和QD705滤光器套件中，都很容易地观察到FUEL的能力，观察到的光子总数显著增加。图11.体内FUEL模型的示意体现。生物发光大肠杆菌在各个方向上辐射光。在不存在QD705时，一些发射的光子将被存在于体内的任何淬灭物(例如，血红蛋白)吸收。当QD705接近RT57时，一些发射的光子将入射QD705，诱导产生不易被相同淬灭物吸收的红移 光子的荧光事件。红光子增加的产生导致增加的红色发光信号和整个动物成像的特异性。现在将通过实施例的方式描述本发明人实施的特定模式。在下面描述中设定了许多特定的细节，以便提供充分的理解。但是，显而易见的是，对于本领域技术人员而言，本发明可被实施而并不局限于这些特定细节。在其它情况下，没有描述公知的方法和结构，以免不必要地使描述含糊。
具体实施例方式实施例I :材料和方法通用试剂在Choi等人中描述了携带表达Iux操纵子(pUC18-mini-Tn7T-Gm_lux称作RT57)的质粒的生物发光大肠杆菌，其在全文中注释为RT57 (20)。从Invitrogen获得Qtracker705非靶向量子点，保存在4°C黑暗中直到使用(注释为QD705)。为了制备琼脂板，在无菌条件下将25mL温的无菌琼脂加入到IOcm皮氏皿，并使其冷却。在无菌H2O中以l%w/v制备刚果红(Sigma)。低熔点琼脂糖(Lonza,France)用于珠的构建。在室内制备普通生理盐水(O. 9%NaCl，称为PS)，并用于所有的稀释。对于刚果红+琼脂板(CRAgar )，将无菌H2O中的4mL l%w/v刚果红(Sigma)加入到400mL温的无菌琼脂中，使琼脂中最终染料浓度为O. 01%。使溶液充分混合，然后将25mL加入到IOcm皮氏皿，并使其冷却。得到的皿含有5mm厚的琼脂或CRAgar层。当琼脂以及CRAgar固化后,倒置制备好的板,储存于4°C直至使用。对于所有的动物实验，使用雌性6周龄Balb/c小鼠(Janvier, France)。细菌制备物在成像的前一天，建立RT57的过夜培养物。第二天早上，获取OD6c ，当必要时，根据进行的适当稀释铺板以实现1000个细菌/5 μ L盐水的最终浓度。然后根据所需方向将细菌铺板(通常5 μ L等份的3 X 4矩阵)。QD705的长距离激发使用黑胶带在减少体积的一次性比色皿(Ratiolab, Germany)上开两个2mmX3mm光学窗口，使两个窗口位于比色皿的相对面上，位置接近但是远离底面(base)。让此改装的比色皿充满ImL来自过夜培养的RT57储备液，用一张黑纸覆盖，并放于Ivis成像系统中。黑纸抑制RT57生物发光的观察。使两个未改装的减少体积的比色皿充满ImL PS，或ImL上述QD705溶液，然后将其放置于含有RT75的改装比色皿的两侧，从而使三个比色皿轴向对齐，中心和外侧比色皿(面对面)之间的距离10mm。从开放的和QD705滤光器套件观察获得的发光。在获取后，使两个未改装的比色皿与中心比色皿间的距离增加5mm，观察发光。重复此步骤直至三种不同细菌培养物的总分离为30mm。在一个可选择的实验中，将5 μ I的储备液RT57的等份放置于空皮氏皿的中央。距细菌5mm的距离(中心对中心)开始，向外辐射状放置2 μ I QD705的等份，以5mm间隔增力口，直至总距离2cm。使用QD705特异的滤光器套件使板成像300s。获取荧光成像以证实QD705的位置。由QD705的添加产生的红光子的增加使用由一张黑纸分隔的两个石英串联比色皿(插图表格图7，PS:生理盐水； QD705 QD705溶液；RT57 :生物发光的大肠杆菌；CR :刚果红)建立多个实验条件。在纸上开一小窗口以允许生物发光光子通过。纸还提供了两个比色皿间的物理分隔，以保证在QD705和RT57之间没有物理接触可以发生。在RT57-和QD705-特异的滤光器套件下(分别注释为480和QD705)观察每个条件的发光强度，每个条件进行一式三份。谱获取使用具有Inm狭缝宽度并设置扫描率(scan rate)为480nm/min的Perkin-ElmerUV/Vis双路分光仪获取刚果红、小鼠全血、肝和肺的吸收谱(图I)。无菌水用作参照。对于每次获取，将ImL的各分析物加入ImL具有Icm路径长度的塑料比色皿。使用恒温于25°C下的Icm路径长度的石英比色皿，用PTI Quanta_MasterQM4CW分光荧光计(PTI，Lawrenceville，NJ)记录RT57生物发光的发射谱。从400至750nm，用5nm的狭缝宽度记录发光。用5nm的狭缝宽度获取QD705激发和发射谱。体外生物发光成像使用配有冷却C⑶和滤光轮(filter wheel)的IVIS 100全动物成像系统(Xenogen Corporation, Caliper Life Sciences, Alameda, CA)获取所有的生物发光成像。使用的滤光器是 610 长传(long pass) (610LP)和 Cy5. 5 带通(band pass) (695nm_770nm，也称为QD705滤光器)。为了全光检测，在滤光轮内的一个位置保持空置，术语为开放的滤光器套件。对于每个实验，CXD冷却至-105°C，暗箱加温至37°C。除非另有说明，LivingImage (Xenogen)软件3. I版本的获取设置为如下设置对所有三个滤光器套件5分钟的获取时间，8Xbin，视野C (20cm)，和f-stop为I。在时间进程实验的情况中，建立成像顺序从而顺次获取开放的、610LP和Cy5. 5成像，然后跟随一个45分钟的延迟，形成一个I小时的成像循环。允许重复此循环直至所需。使用未结合的生物发光细菌量子点的距离激发建立两个不同的实验条件测量距离对RT57-QD705光子产生的作用，条件I涉及四个琼脂板，条件2使用两个琼脂板和两个CRAgar板(图3)。在细菌和QD705放置前，从4°C保存中取出所需的板，使其加温至室温，并核查污染。对于条件1，吸取12个5 μ L细菌溶液等份，以3行乘4列(3x4)的矩阵,放置于有庆大霉素(终浓度为50 μ g/mL)的琼脂板上。将各含有1000个细胞的细菌滴放置于琼脂(板I)。将第二个琼脂板放在一旁，直至最后构成板堆(板2)。然后将三个2 μ LQD705等份移入第三个琼脂板(板3)，从而当堆在含有细菌的板(板I)最上面时，每一个QD705等份将与每个细菌等份的列3垂直对齐。将D705等份的第二组放置于第四个琼脂板(板4)上，每个等份与板I上对应的列4细菌对齐。最后，在确保细菌被放置于琼脂上后，直接向位于板I列2的每个细菌等份上加入2μ LQD705等份。将板倒置，按照板I在底部的顺序堆放，然后清空板2，随后是板3和4。然后将堆放置于IvislOO中，开始成像顺序。对于条件2，除了板2和3由CRAgar而不是琼脂组成外，进行相同的步骤。测量总板的高度为14mm，琼脂或CRAgar深度5mm (图3)。RT57和对应的QD705等份之间的总距离如下列2为0mm、列3为28mm、列4为42mm。QD705的不受约束的激发为了确定生物发光RT57能否激发QD705而不需要物理结合，准备了一系列I. 5mL离心管。第一个管包括用生理盐水(PS)稀释至IOOyL的IOyL细菌储备液。用IOyL细菌储备液、4 μ L QD705和86 μ LPS准备第二个管。用包含稀释至100 μ L的4 μ I QD705的第一和仅由IOOyL PS组成的第二建立两个发光的对照。用移液管轻轻混合所有四个管， 生成均质溶液，将其放置于具有放置于每管之间的黑色塑料分隔的成像系统中，将信号交叉降到最低。在两个滤光器套件下对得到的生物发光观察5s。使用荧光成像确认QD705的存在。离体生物发光成像用开泰敏/甲苯噻嗪麻醉三只雌性六周龄Balb/c小鼠。对每只小鼠进行心脏穿刺，获得大约ImL血液。移出肝，放置于2mL冰冷的PBS中。最后，也移出肺，放置于ImL冰冷的PBS中。然后使用机械匀浆机使器官匀浆，同血液一起，放置于冰上直至进一步使用。用断头法处死每只小鼠。然后使用机械匀浆机使器官匀浆，与血液一同，放置于冰上直至进一步使用。所有动物实验根据法国国家伦理规程进行。在准备小鼠之前，改变玻璃底黑色96孔板从而使板的底能够平稳地放置于IOcm皮氏皿上。将一张带有12个3X4方向的I. 5_直径的洞的黑纸放在96孔板和琼脂板之间，使小洞准确地与96孔板的孔对齐。然后直接将5 μ L细菌储备液的等份移到琼脂上，与小洞和孔对齐。有时间处置好后，将2yL QD705等份放置于细菌的第二和第四列。然后将设置置于37°C下IvislOO中，确认生物发光。然后，将50 μ L来自每只小鼠的血液、匀浆的肝、或匀浆的肺的等份适当地分布，获取前面所述的成像顺序。体内生物发光成像用异氟醚(2. 5%)麻醉雌性Balb/c小鼠。在麻醉下，用有或没有QDs的25-50 μ L细菌混悬液向小鼠左大腿肌肉内注射至3mm的深度，使用IVIS100成像。首先摄取亮视野成像，随后用开放的、610LP和Cy5. 5滤光器摄取生物发光成像。使用Living Image (v 3. I,Xenogen corp.)软件分析成像。使用“珠”的体内FUEL成像为了体内证明FUEL，构建了由琼脂糖或琼脂糖和QD705混合物形成层的基于RT57的核心组成的2%琼脂糖珠。简言之，为了生成独立的“珠”，12. 5μ L RT57储备液与12. 5μ L温的4%琼脂糖混合，移到封口膜(parafilm)上。在允许25 μ L珠核心冷却后，将5 μ L PS或5 μ L QD705储备液与7. 5 μ L 5%琼脂糖的混合物移到珠核心上，分别形成对照和FUEL珠。在珠构建之后，使用开泰敏/甲苯噻嗪化学麻醉三只雌性六周龄Balb/c小鼠。然后使用电动剃刀剃掉所有三只小鼠后肢的背侧和腹侧的毛。在两侧后肢内部开一个小切口，允许皮下埋置对照(RT57)或FUEL (RT57和QD705)珠。然后将小鼠置于IvislOO中，从腹侧观察到开放的和QD705滤光器套件的发光。然后旋转小鼠，对两种滤光器套件均观察到来自背侧的发光。实施例2 :结果谱的比较在图IA中可以看到刚果红(CR)的归一化的UV/Vis吸收图，其覆盖RT57的生物发光的发射谱和QD705的激发/发射谱。如所示，QD705的激发谱与生物发光谱有很大重叠，而QD705的荧光发射发现于以703nm为中心。为了获得有用的吸收谱，在无菌H2O中将血液稀释300倍，而同样在无菌H2O中各稀释肝和肺200倍(图IB)。如图IA和IB中所示，QD705的发射位于最小吸收区域内，并被血液、肝和肺分散， 而分散/吸收剂强烈扰乱RT57的生物发光发射。这些发射最大值的位置高度表明使发射的光子红移的益处。在悬浮液中通过生物发光细菌的QD705不受约束的激发为了确定生物发光大肠杆菌能否激发QD705而不需要任何偶联化学或结合，将RT57和QD705溶液单独分布或混合于独立的管中，在两种不同的发射滤光器套件(开放的和Cy5. 5)下与三个对照(单独的RT57、单独的QD705和PS)比较得到的发光产物。如图2中所见，RT57和RT57+QD705都在开放的滤光器存在时发射光子。如预期的，从生物发光对照(单独的QD705或PS ;列I和3，行I和2)没有观察到发光。在RT57存在下，在没有发射滤光器(列2和4，行I)、仅有细菌(列2，行I)和有RT57+QD705 (列4，行O时，我们观察到比较强的生物发光信号。但是，通过鲜明的对比，当通过Cy5. 5发射滤光器观察时，与单独的发光细菌(列2，行2)相比，我们从RT57+QD705 (列4，行2)观察到一些多10倍的信号，这表明QD705的存在引起了发射光的波长的移位，从而其部分现在通过了深红发射滤光器。从对照没有观察到发光。这强烈地表明单独的发光细菌能够激发QD705。显示了 RT57归一化的生物发光发射谱和QD705的激发/发射谱(图I)。QD705的激发谱与RT57生物发光的峰值发射重叠，而QD705的荧光发射位于，正如预期的，以705nm为中心。鉴于此处显示的谱重叠和结果，单独的RT57生物发光足以激发QD507。细菌荧光素酶的距离依赖性-QD705FUEL探针对开发了模拟小鼠血液、肝和肺的光吸收的简单模型，以便证明通过微不足道的(trivial)激发的生物发光光子红移的重要性。发现普通染料刚果红(CR)具有与小鼠血液、肝和肺相似的吸收谱，与RT57重叠。CR还显示出在705nm处非常少的吸收。通过在两种不同条件下在RT57和RT57+QD705的等份上堆积琼脂和CRAgar板，观察吸收物(CRAgar)对可检测光子的作用(图3)。如上所述，对两个不同条件使用不同的滤光器套件获得三个连续的5分钟获取。条件I包括使用四个标准琼脂板，而条件2用CRAgar板替代了中间的两个琼脂板(图3A和3B)。对于每个条件一式三份地重复生长实验，并使用IvislOO观察。图4A显示对于条件2总光子流量随时间而增加，而图4B显示对于条件2在生长实验结束时获得典型的生物发光成像。如所见到的，列2 (RT57+QD705)显著地比其它列更亮。在图4C中可以更清晰地观察到这种区别。此处，相对于列I (仅有RT57)将列2、3和4的总光子流量进行归一化。对于列2观察到总光子流量的显著增加，列3有小的增加，而列4基本上没有增加。如在表I中所见的，在两种条件下在开放的滤光器套件下，对于列2存在光子流量的增加。在条件I中列3中也观察到相似的增加，而在条件2中观察到更小的增加。这可以解释为归因于在条件2中CRAgar板的存在。CRAgar板位于板I和板3之间，降低了可用于激发位于板3的QD705的RT57光子的数目。这很重要，因为该作用表明QD705必须光学上可用于RT57，从而使得光子中的移位发生。这进一步的证据还可见于，当条件2下列4与列I比较时。此处，列之间的比以I为中心，表明当两个CRAgar板存在时没有增强。但是，对于条件1，即使在RT57和QD705之间有两个琼脂板，还是观察到轻度的增强(列4)。因而，没有吸收物，就没有对QD705激发的特异性。细菌能够离开相当的距离。其不是当在动物中观察细菌演变时想要的。在每种条件下，对于每个滤光器套件，列2 (RT57+QD705)观察到 最大增强。这种对610LP和Cy5. 5滤光器套件均观察到的增加的增强证明了归因于QD705存在的生物发光光子的红移。表I.具有生物发光RT57的QD705激发的距离依赖性*
权利要求
1.一种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的方法，包括步骤 a)提供适于FPP-L产生至少一个第一光子的条件； b)提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FPP-U，其中步骤a)的所述至少一个第一光子激发所述FPP-U，其发射至少一个第二光子； 所述方法特征在于所述FPP-L和所述FPP-U不结合，且所述至少一个第二光子的每个比所述至少一个第一光子的每个的波长更长。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述FPP-L是生物标记物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是生物发光的。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是化学发光的。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标记物是荧光的。
6.根据权利要求I至5任一项所述的方法，其中所述生物标记物发射具有650nm以下波长的光子。
7.根据权利要求I至6任一项所述的方法，其中所述FPP-U发射具有比所述生物标记物更长的波长的光子。
8.根据权利要求I至7任一项所述的方法，其中所述FPP-U发射具有650-900nm波长的光子。
9.根据权利要求I至8任一项所述的方法，其中所述方法包括在细胞、组织或生物体中确定存在产生至少两个光子的生物标记物；其中所述至少两个生物标记物的每个发射在波长非重叠范围的光子，所述光子激发所述FPP-U的至少两亚组的至少一个，所述FPP-U各发射至少一个光子，其中由每个所述FPP-U的所述亚组发射的所述至少一个光子在波长非重置范围。
10.根据权利要求I至9任一项所述的方法，其中所述FPP-U包括将其靶向所述细胞、组织或生物体的特定部位的装置。
11.根据权利要求I至10任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之内。
12.根据权利要求I至10任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之外。
13.根据权利要求I至9任一项所述的方法，其中所述FPP-U置于所述细胞、组织或生物体之内和之外。
14.根据权利要求I至13任一项所述的方法，其中所述FPP-U选自量子点、碳纳米管、荧光蛋白、金刚石纳米晶体或金属卟啉。
15.—种在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的发光生物标记物的方法，包括步骤 a)提供适合第一FPP产生至少一个第一光子的条件； b)提供置于接近所述细胞、组织或生物体的第二FPP，其中步骤a)的所述至少一个第一光子激发所述第二 FPP，其发射至少一个第二光子； 其中步骤b)再重复至少一次，其中对于每个额外的步骤进一步的FPP置于接近所述细胞、组织或生物体，而不是所述的第一或第二 FPP，其由在先步骤中发射的至少一个光子所特异激发，且其随后发射至少一个进一步的光子； 其中，在最终步骤中检测所述至少一个进一步的光子； 其中所述生物标记物是所述第一或所述第二 FPP ； 所述方法特征在于所述多个FPPs不结合，且特征在于每个所述至少一个光子比每个来自之前步骤的所述至少一个光子的波长更长。
16.一种用于进行根据权利要求I至13任一项的方法的试剂盒，其包括至少 根据权利要求I至13任一项的FPP-U分子； 用于进行权利要求I至11任一项的方法的说明书。
17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括吸收由所述生物标记物产生的光子的化合物。
18.未结合至生物标记物的量子点用于在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生所述光子的生物标记物的用途。
全文摘要
本发明涉及在目标细胞、组织或生物体中确定存在产生光子的生物标记物的方法。该方法基于不受发光约束的激发所产生的荧光(FUEL)，并包括步骤a)提供适于生物标记物通过发光产生至少一个第一光子的条件；b)提供置于接近所述细胞、组织或生物体的FUEL探针对上游(FPP-U)，其中步骤a)的至少一个第一光子激发FPP-U，FPP-U发射至少一个第二光子。FPP-U可选自量子点、碳纳米管、荧光蛋白、金刚石纳米晶体和金属卟啉。该方法特征在于所述生物标记物和所述FPP-U不结合，以及特征在于至少一个第二光子的每个比至少一个第一光子的每个波长更长。
文档编号G01N21/64GK102869983SQ201180021806
公开日2013年1月9日 申请日期2011年3月25日 优先权日2010年3月26日
发明者K·罗杰斯, S·L·肖特, J·德拉加翁, S·布拉兹凯 申请人:巴斯德研究所